HCMC UNIVERSITY OF
TECHNOLOGY AND
PRACTICE OF ORGANIC
EDUCATION
CHEMISTRY
FACULTY OF CHEMICAL
AND FOOD TECHNOLOGY
LAB REPORT
#4 CHROMATOGRAPHY TECHNIQUES (TLC AND CC)
Date: Grade
Class: 21116FIE Group:
Name: Nguyen Quoc Huy Student ID: 21116300
Name: Le Viet Anh Khoi Student ID:21116304 Signature
Name: Nguyen Ha Anh Quan Student ID:21116316
A. PREPERATION
1. Purpose of experiment:
Qualitative analysis and evaluation of the purity of substances through
thin layer chromatography
Purification of organic compounds by thin layer chromatography
Separation and purification of organic compounds by column
chromatography
2. Chemical properties and safety
Compound Structure MW mp (oC) bp (oC) density safety
655 kg/
Hexane 86,18 - 95 69
m³
784 kg/
Acetone 58.04 -95 -93 56-57
m³
902 kg/
Ethyl acetate 88,11 -83,6 77,1
m³
792 kg/
Methanol 32,04 -97,6 64,7
m³
Na2SO4 2,66 g/
142,04 884 1.429
(dried) cm³
Silica gel 655 kg/
86,18 - 95 69
(Hexane) m³
3. Experimental procedure
a) Thin-layer chromatography (TLC)
Stage 1 Prepare TLC table
Step 1: Use a pencil and ruler to divide the 20x20 TLC board into 4 20x5
parts, use scissors to cut the board.
Step 2: Use a pencil and a ruler to draw a line 1 cm from the bottom edge
of the board as the starting line of the solvent.
Step 3: Lightly draw a line 0.5 cm from the top edge of the board as the
finish line.
Step 4: Depending on the number of samples to be marked, cut the TLC
board with the appropriate width. Use a pencil to mark the sample dot
positions so that the positions are about 0.5 - 1.0 cm apart and from the
edge of the TLC board.
Stage 2 Prepare lysis solvent
Step 1: Use a measuring cylinder to mix 10 mL of hexane: acetone
(7:3, 9:1,…)
Step 2: Put in a decanter with a pre-installed filter paper, gently invert to let
the solvent wet the filter paper.
Step 3: Cover the flask and let it stand.
Stage 3 Dot the sample on the TLC board
Step 1: Prepare the sample
(1) Weigh about 1 g of dried coriander leaves, cut into small pieces, and
then put them in a porcelain mortar, using a pestle to puree them; Add 0.5 g
anhydrous Na2SO4 and 10 mL acetone, mix well (the amount of acetone
fills the sample). Decant the extract into a test tube. Add 2 mL of acetone
to rinse the residue and the mortar and pestle and transfer all the acetone to
the test tube (do two rinses).
(2) Add 1 g of anhydrous Na2SO4 to the acetone extract. Shaken.
(3) Decant the extract, discard the solids, and transfer the extract to a 50
mL beaker. Evaporate the solvent on a water bath, obtain the residue as a
sample for the TLC panel.
Step 2: Dissolve the residue with 0.5 mL of hexane
Step 3: Dip the tip of the microtubule into the sample solution,
Step 4: Lightly touch the tip of the microtubule to the TLC board at the
point on the starting line. Quickly lift the microtubule away from the TLC
panel so that the dot spreads only into a 1 mm diameter circle,
Step 5: Depending on the concentration of the sample, dot a few times on a
spot until the spot is clearly yellow. Before the next dot, it is necessary to
evaporate the solvent at the dotted spot,
Step 6: Light drying evaporates the solvent,
Step 7: If multiple samples need to be examined, mark each sample one
spot on the starting line of the TLC table. Spots are 0.5 - 1.0 cm apart. The
two marks on the outer cover must be 1 cm from the edge.
Stage 4 Implement TLC table
Step 1: Place the TLC board in the flask, the bottom edge of the TLC board
touching the bottom of the flask and submerged in the solvent. The starting
line and the sample dots should not be immersed in the solvent.
Step 2: Cover the flask and let it stand.
Step 3: Wait until the solvent ink gradually penetrates and rises to the
finish line, then lift the TLC board out of the flask and dry the TLC board.
Stage 5 Show traces on the TLC . board
Step 1: Observe with the naked eye
(1) Observe the appearance of stains.
(2) Take pictures again for archiving.
Step 2: Detect by ultraviolet (UV) lamp
(1) Place the TLC panel under a UV lamp at 254 nm and observe.
(2) Take pictures again for archiving.
(3) Use a pencil to draw dark spots on a light background.
Step 3: Show the stain with vanillin/H2SO4 solution (with colorless
substance)
(1) Immerse the TLC board in the flask containing the 50% H2SO4
solution. Gently scrape the board on the side of the flask to allow excess
acid to return to the flask. Place the aluminum side of the TLC board on
absorbent paper to drain the acid.
(2) Place the TLC board on the hotplate to heat.
(3) Observe the appearance of stains.
(4) Take pictures again for archiving.
Stage 6 Calculation of Rf
Step 1: Use a ruler to measure the distance from the starting line to the
center of each mark on the TLC board.
Step 2: Measure the distance from the start line to the finish line
Step 3: Calculate Rf according to the formula presented in the theory part.
Step 4: See if the traces on the TLC are within the appropriate Rf limits. If
not, perform the same procedure a second time with the group's self-
recommended lysis solvent system.
b) Column chromatography (CC)
Stage 1: Prepare the necessary tools
Step 1: Prepare a clean and dry 5 mL pipette as a chromatographic column.
Step 2: Put a small cotton ball on the column, use a long zinc pole to put
the cotton ball at the end of the column (before the lock);
Step 3: Use clamps and brackets to fix the vertical column;
Step 4: Prepare 10 test tubes (ball jars) numbered 1-10 to collect fractions
from the chromatographic column
Note: All instruments in this test must be clean and dry.
Stage 2: Prepare column loading sample
The column loading sample preparation was similar to the sample
preparation for the TLC experiment in Lesson 6, Thin Layer
Chromatography.
Stage 3: Choosing a solvent system (referencing)
Use TLC to select a suitable solvent system for CC. The suitable solvent
system is the solvent system that separates the traces in the mixture the
farthest.
Choose a solvent system with a ratio so that the more polar spot has an Rf
of about 0.3.* (this system will be used to dissolve more polar substances
and deploy TLC to check the results). Hint: try with n-hexane, acetone,
ethyl acetate solvents.
Stage 4: Stuffing the column
Step 1: Put 2 g of silica gel in a small beaker and pour hexane into it, stir to
make a paste, let stand 5 minutes for silica gel to expand in hexane.
Step 2: Add hexane to 1/2 column. Lock the column. Place the collection
tube under the column.
Step 3: Using a Pasteur pipette, slowly transfer the slurry of silica gel to
the column, unlocking the column for continuous flow. Add solvent to the
rinse cup to transfer all silica gel to the column
Step 4: Lightly tap the column wall to make sure there are no air bubbles in
the column and make the silica gel layer on the column surface flat.
Step 5: Continue adding solvent to the top of the column, do not let the
column dry. Allow the column to flow continuously for some time to
stabilize before loading the sample.
Stage 5: Load the sample at the top of the column
Step 1: Dissolve the spinach leaf extract in 1 mL of hexane. Retain a few
drops of leaf extract for comparison of TLC results;
Step 2: Unlock the column so that the solvent flows down to the level close
to the surface of the silica gel layer.
Step 3: Pipette the extract into the top of the column by whisking evenly
around the column wall.
Step 4: Each time a small amount of sample is transferred to the top of the
column, open the lock so that the extract layer flows down to penetrate the
silica gel layer. Close as soon as the extract has been absorbed
Step 5: Add solvent to rinse the sample container to ensure that the entire
sample is transferred to the top of the column. Use a small amount of
solvent each time. Repeat this process several times until the clean column
head solvent layer is no longer blue in the sample. Add clean solvent to the
top of the column and start unlocking for dissolution.
Stage 6: Column Chromatographic Separation
Step 1: Perform column lysis starting with hexane. Use test tubes to collect
the fractions with a capacity of 5 mL each
Step 2: Trace the color of the bands on the column.
Step 3: When the first color band (yellow – β-carotene) reaches the bottom
of the column, change the solvent system to hexane-acetone (9:1, v/v)
Step 4: If the second color band (blue – chlorophyll) moves slowly, use
acetone to dissolve.
Step 5: Continually collect the fractions in a test tube until the entire
second color band is out of the column.
Step 6: Flush the column with acetone-methanol (80:20).
Stage 7: Test by TLC and̀ segment aggregation
Step 1: Use TLC to check the separation process by spotting the extract and
the fractions collected in turn on the same TLC panel. (If the number of
segments is more than the number of spots that can be scored on 1 table, it
can be divided into 2 tables but must re-dot the last trace of table 1 at the
beginning of table 2 to be able to compare the results of the 2 tables).
Step 2: Deploy TLC with suitable solvent system selected in step 2
(hint: hexane-acetone 70:30, etc.).
Step 3: The segments with the same TLC results are aggregated.
Step 4: Solvent the fractions containing the purified substances to obtain
the pure substance.
Step 5: Re-dot TLC of 3 substances on the same table: sample before
running column and 2 purified substances.
Step 6: Observe the color of the spots under normal conditions and under
254 and 365 nm UV lamps.
Step 7: Take a picture and save the result.
Step 8: Calculate the Rf of the traces.
B. REPORT
1. Thin-layer chromatography (TLC)
a) Describe the experimental phenomenon
-. Using a capillary tube, we take samples from 4 TLC plates after
preparing the dried spinach sample in liquid form. We then place the
samples in 4 separate chambers with various solvents and solvent mixtures.
b) Experimental results
- Put out the plate when the dark color is 1 cm away from the top after a
few seconds, when the green and yellow spot of the dried spinach sample
starts to move up and the dark color of the wet solvent starts to move up on
the plate. The trip duration of the yellow spot differs amongst the 4
chambers with various solvents, which indicates different Rf.
c) Rf calculation
Solvent:
- 70% hexane, 30% acetone: Rf = 0.68
- 90% hexane, 10% acetone: Rf =0.94
- 100% hexane: Rf = 0.26
d) Discussion
2. Column chromatography (CC)
a) Describe the experimental phenomenon
- 2g silica gel is added to a tube of hexane. After that, it is agitated until it
condenses.
- We pipet extract spinach into the column while adding additional hexane
solvent to it after placing condensed silica gel in hexane into the pipet
column with cotton packed at the tip.
b) Experimental results
- After a period, the color changes from green to a yellow phase on top and
a white phase at the bottom..
- To compare the yellow extract with the original green extract, repeat the
TLC portion..
c) Rf calculation
- Both sample get the same result: Rf = 0.28
d) Discussion
C. ANSWER THE QUESTION
To distinguish the chemicals in the sample or solvent, TLC only needs a
very little quantity of sample. The little dissolved sample is placed on the
TLC plate using a capillary tube after being placed within a cup that has
been lined with filter paper and coated with a specified solvent. Both the
solvent and the sample will rise to the top of the plate, demonstrating
whether the sample is pure or not and if the solvent is the proper one.
4A
Câu 1: Hãy trình bày nguyên tắc tách các hợp chất hữu cơ bằng kỹ
thuật sắc ký.
TRẢ LỜI:
Nguyên tắc chất phân cực tan trong dung môi phân cực, chất
kém phân cực tan trong dung môi kém phân cực.
Những chất có ái lực mạnh với dung môi (pha động) sẽ được giải ly
ra trước.
Những chất có ái lực mạnh với chất hấp phụ (pha tĩnh) sẽ bị giữ chặt
và giải ly ra sau
Câu 7: Giả sử một hỗn hợp phản ứng có hai tác chất ban đầu là A và
B. A phân cực hơn B. Sau 2 giờ tiến hành phản ứng, có thể dùng kỹ
thuật TLC để kiểm tra tiến trình phản ứng được không? (Gợi ý: đã tạo
thành sản phẩm hay chưa? A và B còn hay đã phản ứng hết?). Giả sử sản
phẩm C phân cực hơn A và B và dung môi X có thể tách tốt cả 3 chất A,
B và C, hãy so sánh và giải thích giá trị Rf của từng chất trên bảng TLC
với dung môi giải ly là X? Hãy vẽ hình vị trí các vết hiện trên bảng TLC.
TRẢ LỜI:
- Có thể dùng kỹ thuật TLC để kiểm tra tiến trình phản ứng.
- 2 tiếng sau khi tiến hành phản ứng, A và B sẽ phản ứng hết.
- Nếu C phân cực hơn A, B và dung môi X có thể tách tốt cả
3 chất A, B và C thì: Rf (C) < Rf (A) < Rf (B)
Câu 8: Một sinh viên chấm một mẫu chất chưa biết trên bảng TLC và
triển khai bảng trong dung môi dichloromethane. Chỉ có 1 vết xuất hiện
với Rf=0,95. Điều này có thể khẳng định chất trên là tinh khiết không?
Cần làm gì để xác định độ tinh khiết của mẫu?
TRẢ LỜI:
- Chưa thể khẳng định chất trên là tinh khiết
- Để xác định độ tinh khiết của mẫu ta cần:
+ Thử nghiệm TLC với 3 hệ dùng môi khác nhau
+ Triển khai nhiều lần trong hệ dung môi giải ly có độ phân cực
thấp để xem có sự khác biệt hay không.
+ Triển khai hai chiều: Dùng bản TLC vuông, chấm 1 mẫu hỗn
hợp của hai chất vào một góc bảng TLC. Triển khai TLC theo một
chiều trong một hệ dung môi giải ly. Đem ra làm khô, tiếp tục triển
khai bảng TLC theo chiều còn lại trong một hệ dung môi giải ly
khác. Nếu thấy 2 vết tách ra thì A, B là hai chất khác nhau.
Câu 9: Hai sinh viên A và B được giao mỗi người một mẫu chất chưa
biết. Cả hai mẫu đều là không màu. Cả hai sinh viên đều dùng bảng TLC
như nhau và triển khai cùng hệ dung môi giải ly. Mỗi người đều thu
được kết quả là một vết với Rf=0,75. Làm cách nào để chứng minh hai
mẫu đó là một?
TRẢ LỜI:
- Để chứng minh 2 mẫu là một, ta làm các bước giống như các bước
để xác định độ tinh khiết của mẫu:
+ Thử nghiệm TLC với 3 hệ dùng môi khác nhau
+ Triển khai nhiều lần trong hệ dung môi giải ly có độ phân cực thấp
để xem có sự khác biệt hay không.
+ Triển khai hai chiều: Dùng bản TLC vuông, chấm 1 mẫu hỗn hợp
của hai chất vào một góc bảng TLC. Triển khai TLC theo một
chiều trong một hệ dung môi giải ly. Đem ra làm khô, tiếp tục triển
khai bảng TLC theo chiều còn lại trong một hệ dung môi giải ly
khác. Nếu thấy 2 vết trùng vào nhau thì hai mẫu đó là một.
4B
Câu 1: Hãy trình bày nguyên tắc chung của sắc ký cột.
TRẢ LỜI:
• Nguyên tắc chất phân cực tan trong dung môi phân cực, chất
kém phân cực tan trong dung môi kém phân cực.
• Những chất có ái lực mạnh với dung môi (pha động) sẽ được giải ly
ra trước.
• Những chất có ái lực mạnh với chất hấp phụ (pha tĩnh) sẽ bị giữ
chặt và giải ly ra sau.
Câu 2: Pha tĩnh trong kỹ thuật sắc ký cột là chất gì? Đặc tính kỹ thuật
của pha tĩnh dùng trong sắc ký cột có gì khác so với kỹ thuật sắc ký lớp
mỏng?
TRẢ LỜI:
- Pha tĩnh trong kĩ thuật sắc kí cột là silicagel G
- Sắc kí cột sử dụng silicagel dạng bột nhồi vào cột. Còn sắc kí lớp
mỏng, silicagel G được phủ lên một tấm bảng nhôm, nhựa hoặc thủy
tinh dày 0,1 – 0,3mm.
Câu 3: Trong bài thí nghiệm này, vì sao chọn n-hexane làm dung môi
giải ly đầu tiên cho sắc ký cột?
TRẢ LỜI:
- Vì sẽ tách được các hợp chất kém phân cực và phân cực tốt hơn
(hexane không phân cực nên hợp chất phân cực sẽ được tách ra
trước).
Câu 4: Trong quá trình sắc ký cột với dịch chiết lá mồng tơi, vì sao
vạch màu vàng của β-
carotene tách và ra khỏi cột khi giải ly với 100% hexane?
TRẢ LỜI:
- Vìβ-Carotene không phân cực nên sẽ tan tốt trong dung môi không
phân cực là hexane.
Câu 5: Cũng trong thí nghiệm sắc ký cột với dịch chiết lá mồng tơi,
sau khi tách loại β- carotene ra khỏi cột, hãy đề xuất dung môi (hoặc hệ
dung môi) để có thể tách chlorophyll ra khỏi sắc ký cột.
TRẢ LỜI:
- Cho thêm từng lượng nhỏ acetone vào cột.
Câu 6: Để chuẩn bị cho quá trình sắc ký cột, cần điều chế dịch chiết
acetone chứa β-carotene và chlorophyll từ lá mồng tơi. Tại sao phải đuổi
hết acetone rồi thêm một ít n-hexane để tạo dạng sệt rồi mới đưa vào đầu
cột?
TRẢ LỜI:
- Vì acetone phân cực, nếu còn acetone nó sẽ giải ly chất không
phân cực lẫn phân cực cùng lúc.
Câu 7: Hãy cho biết nguyên nhân cột bị “gãy” trong quá trình giải ly
và đề xuất cách khắc
phục.
TRẢ LỜI:
- Nguyên nhân cột bị gãy trong quá trình giải ly là do tăng độ phân
cực của dung môi đột ngột. Cách khắc phục là nên tăng độ phân cực
của dung môi từ từ.
Câu 8: Sau khi chất hấp phụ được nạp vào cột sắc ký lỏng, điều quan
trọng là mức dung môi không được hạ thấp xuống dưới bề mặt của chất
hấp phụ. Hãy cho biết lý do.
- Mức dung môi luôn nằm trên bề mặt chất hấp phụ nhằm tạo dòng
chảy liên tục của dung môi đi qua cột sẽ giải ly các chất tan tách
khỏi lớp silicagel và đi ra khỏi cột nhờ đó các chất tách ra khỏi hỗn
hợp.
Câu 9: Những sự cố nào có thể xảy ra trong quá trình nạp cột sắc ký
lỏng?
- Nhét bông quá nhiều, quá chặt, dẫn đến thời gian thực hiện thí
nghiệm kéo dài và khó khăn trong việc lấy bông ra.
- Chọn chất hấp phụ có kích thước hạt quá to.
- Cho quá nhiều chất hấp phụ.
- Khi nạp dung môi không liên tục, tạo điều kiện cho bọt khí xuất
hiện làm gãy cột.
