அழியாத செல்

கலாச்சார நெறிமுறைகள்

அழியாத செல் கலாச்சார நெறிமுறை

PRF செல் & திசு வங்கிக்கு அழியாத செல் லைன்களை தாராளமாக உருவாக்கி வழங்கியதற்காக ஹார்வர்ட் பல்கலைக்கழகத்தில் டாக்டர் மார்ட்டின் டோர்ஃப் அவர்களுக்கு நன்றி கூறுகிறோம். நன்றி.

பின்வரும் நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி PRF செல் கோடுகள் அழியாதவை:

ரெட்ரோவைரஸ் தொற்று

A. வைரஸ் உற்பத்தி: இடமாற்றத்திற்கு 12-24 மணிநேரத்திற்கு முன், 60-80% சங்கமத்தில் 100-மிமீ தட்டில் HEK293 செல்கள் பேக்கேஜிங் பூசப்பட்டது. ஒவ்வொரு தட்டும் 12μg ரெட்ரோவைரல் கன்ஸ்ட்ரக்ட் pBABE-puro (SV40T) மற்றும் 12μg pCL-Ampho Retrovirus பேக்கேஜிங் வெக்டருடன் இணைந்து மாற்றப்பட்டது. பண்பாட்டு ஊடகம் 8-10 மணிநேரத்திற்கு மாற்றப்பட்டது, மேலும் 10 மில்லி முழுமையான ஊடகத்துடன் மாற்றப்பட்டது. உகந்த வைரஸ் டைட்டரை அடைய கூடுதலாக 48-72 மணிநேரத்திற்கு கலாச்சாரம் அடைக்கப்பட்டது.

B. இலக்கு செல்களை பாதிக்கிறது: நோய்த்தொற்றுக்கு 12-18 மணிநேரத்திற்கு முன் இலக்கு செல்கள் 100 மிமீ தட்டில் பூசப்பட்டன. பேக்கேஜிங் கலங்களிலிருந்து ஊடகம் சேகரிக்கப்பட்டு 0.45-μm செல்லுலோஸ் அசிடேட் அல்லது பாலிசல்போனிக் வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டப்பட்டது. செல்கள் 40-60% சங்கமமானவுடன், 10 μg/ml பாலிப்ரீன் இறுதி செறிவுடன் 8 மில்லி வைரஸ் கொண்ட ஊடகம் சேர்க்கப்பட்டது. ~ 12 மணிநேர இடைவெளியில் மூன்று சுற்று நோய்த்தொற்றுகள் தொடர்ச்சியாக நிகழ்த்தப்பட்டன. 24 மணிநேர அடைகாக்கும் பிறகு ஊடகம் மாற்றப்பட்டது.

C. நிலையான செல் கோடுகளின் தேர்வு: நோய்த்தொற்றுக்கு 72 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு, செல்கள் டிரிப்சினைஸ் செய்யப்பட்டு, 1:3 இல் பிரிக்கப்பட்டு, 3 μg/ml ப்யூரோமைசின் முன்னிலையில் இரண்டு 100 மிமீ தட்டுகளுக்கு மாற்றப்பட்டன, மேலும் ஆண்டிபயாடிக் இல்லாமல் ஒரு கட்டுப்பாட்டு தட்டு. நிலையான செல் கோடுகளை உருவாக்க, கலாச்சார ஊடகம் ஒவ்வொரு 2 அல்லது 3 நாட்களுக்கும் தோராயமாக 2 முதல் 4 வாரங்களுக்கு மாற்றப்பட்டது.

வளர்ச்சி ஊடகம்

DMEM- இன்விட்ரஜன் #11960-044 (எல்-குளுட்டமைன் இல்லாமல் அதிக குளுக்கோஸ்)

15% FBS பிடல் போவின் சீரம்

1% (1x) பென்சிலின்-ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (Invitrogen#15140-122)

1% (1X) L-குளுட்டமைன் (Invitrogen#25030-081)

0.75 μg/ml puromycin (InvivoGen #ant-pr-1)

டிரிப்சின்

டிரிப்சின் EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

ஹாங்கின் சமச்சீர் உப்பு தீர்வு

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) கால்சியம் குளோரைடு, (-)மெக்னீசியம் குளோரைடு, (-) மெக்னீசியம் சல்பேட்)

உறைபனிக்கான டி.எம்.எஸ்.ஓ

செல் கலாச்சாரம் தர DMSO

உலர் பனியில் உறைந்திருக்கும் செல்கள் தோராயமாக 5 x 10 செறிவில் வரும்.⁵செல்கள் / குப்பியை

ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்களைக் கரைப்பதற்கான நெறிமுறை

37 டிகிரி செல்சியஸ் நீர் குளியலில் செல்களை வேகமாக கரைக்கவும்.
குப்பியின் வெளிப்புறத்தை 70% எத்தனால் கொண்டு துடைக்கவும்.
கரைந்த செல்களை ப்யூரோமைசின் இல்லாமல் 5 மில்லி வளர்ச்சி ஊடகம் கொண்ட T25 குடுவைக்கு மாற்றவும்.
ஒரே இரவில் 37 டிகிரி செல்சியஸ் இன்குபேட்டரில் குடுவை வைக்கவும்.
அடுத்த நாள், செல்கள் இணைக்கப்பட்டுள்ளதை உறுதிப்படுத்த நுண்ணோக்கின் கீழ் கண்காணிக்கவும்.
மீடியாவை அகற்றி, புதிய வளர்ச்சி ஊடகத்துடன் மாற்றவும்.

துணை கலாச்சாரம் PRF செல் கோடுகள்

1) செல்கள் நிறுவப்பட்டு வளரும் போது, 0.75 μg/ml puromycin கொண்ட மீடியாவைப் பயன்படுத்தத் தொடங்குங்கள். 0.75 μg/ml puromycin கொண்ட மீடியாவில் செல்களை தொடர்ந்து பராமரிக்கவும்.

2) கலங்கள் சங்கமிக்கும் போது பிரிக்கப்பட வேண்டும்.

3) செல்களைப் பிரிக்க (தொகுதிகள் T25 இல் செல்கள் இருப்பதாகக் கருதுகிறது):

A. மலட்டுத் தொழில் நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, மீடியாவை அகற்றி, 2-3 மில்லி மலட்டு HBSS கொண்டு குடுவையைக் கழுவவும். HBSS ஐ அகற்றி நிராகரிக்கவும்.

B. 1 மில்லி டிரிப்சின் சேர்த்து 2-3 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும். செல்கள் சுற்றவும், உயர்த்தவும் மற்றும் மிதக்கவும் தொடங்கியுள்ளனவா என்பதை அறிய, தலைகீழ் நுண்ணோக்கியின் கீழ் சரிபார்க்கப்பட வேண்டும். 3 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு செல்கள் பிரிக்கப்படாவிட்டால், நீங்கள் மற்றொரு 1-2 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கலாம்

C. தொப்பியை இறுக்கி, அனைத்து செல்களையும் அகற்ற, பக்கவாட்டில் இருந்து பிளாஸ்க்கை மெதுவாகத் திருப்பவும். தேவைப்பட்டால், செல்களை தளர்த்துவதற்கு, குடுவையை பக்கத்தில் லேசாகத் தட்டலாம்.

டி. டிரிப்சின் செயலிழக்க செல்கள் மிதந்தவுடன் 4 மில்லி புதிய மீடியாவை குடுவையில் சேர்க்கவும். பிளாஸ்டிக் மற்றும் கரைசலில் உள்ள அனைத்து செல்களையும் கழுவ புதிய மீடியாவுடன் பிளாஸ்கின் பக்கங்களை பல முறை துவைக்கவும். செல்களைக் கொண்ட அனைத்து திரவத்தையும் அகற்றி, 15 மில்லி கூம்பு வடிவத்திற்கு மாற்றவும் (அல்லது நீங்கள் 3 அல்லது அதற்கு மேற்பட்ட குடுவைகளை சேகரித்தால் 50 மில்லி).

E. மலட்டுத் தொழில்நுட்பத்தைப் பயன்படுத்தி, ஹெமாசைட்டோமீட்டரில் எண்ணுவதற்கு ஒரு அலிகோட்டை அகற்றவும்.

F. நீங்கள் செல்களை எண்ணும் போது, மீதமுள்ள கரைசலை 1000 ஆர்பிஎம்ஸில் 5 நிமிடங்களுக்கு மருத்துவ மையவிலக்கில் சுழற்ற வேண்டும்.

4) உங்கள் செல் எண்ணிக்கையைக் கணக்கிட்ட பிறகு, தட்டு செல்கள் 2.5 x 10⁵ T 25 வடிகட்டி மேல் குடுவைக்கு செல்கள்.

5) 0.75 μg/ml puromycin கொண்ட புதிய வளர்ச்சி ஊடகத்துடன் ஒவ்வொரு 2-3 நாட்களுக்கும் செல்களுக்கு உணவளிக்க வேண்டும்.

உறைதல்:

செல்கள் 5x 10க்குக் குறையாமல் உறைந்திருக்க வேண்டும்⁵ செல்கள் /ml/cryovial வளர்ச்சி ஊடகத்தில் 10% DMSO மற்றும் 30% FBS ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது ப்யூரோமைசின் இல்லாமல் பின்னர் ஒரே இரவில் -80°C இல் ஐசோப்ரோபனோல் உறைபனி அறையில் வைக்கப்பட்டது. அடுத்த நாள் திரவ நைட்ரஜனுக்கு மாற்றவும்.

மேலும் தகவலுக்கு, தொடர்பு கொள்ளவும்:

லெஸ்லி பி. கார்டன், MD, PhD

பிரவுன் பல்கலைக்கழகத்தின் குழந்தை மருத்துவ ஆராய்ச்சி பேராசிரியர் வாரன் ஆல்பர்ட் மருத்துவப் பள்ளி மற்றும் குழந்தை மருத்துவத் துறை, ஹாஸ்ப்ரோ குழந்தைகள் மருத்துவமனை, பிராவிடன்ஸ், RI மயக்க மருந்து துறை, குழந்தைகள் மருத்துவமனை பாஸ்டன் மற்றும் ஹார்வர்ட் மருத்துவப் பள்ளி, பாஸ்டன், எம்ஏ மருத்துவ இயக்குநர், தி புரோஜீரியா ஆராய்ச்சி அறக்கட்டளை

தொலைபேசி: 978-535-2594
தொலைநகல்: 508-543-0377
[email protected]

வெண்டி நோரிஸ்

PRF செல் மற்றும் திசு வங்கி
தொலைபேசி: 401-274-1122 x 48063
[email protected]

பதிவு செய்யவும்

எங்களுக்காக

புதுப்பிப்புகள்!

இப்போது பதிவு செய்யவும்

ஒன்றாக, நாங்கள்

உயில்

மருந்து கண்டுபிடி!

இப்போது நன்கொடை அளியுங்கள்