Protocol voor het kweken van lymfoblasten

Groeimedium

RPMI 1640 – ThermoFisher # 11875
15% Foetaal runderserum (FBS) – ThermoFisher #10437-028
1% (1X) Penicilline-streptomycine (optioneel) – ThermoFisher #15140-122

Algemene opmerkingen

• Het groeimedium moet altijd in evenwicht zijn in de broedstoof bij 37°C, 5% CO₂ 30 minuten laten intrekken voor gebruik
• Gebruik altijd flessen met geventileerde doppen
• Zet de kolf altijd rechtop
• Er mag niet meer dan 20 ml in een T25-kolf worden gebruikt

Ontdooien van bevroren cellen

Bevroren cellen worden ontvangen in 1 ml aliquots op droogijs. Houd cellen bevroren tot ze ontdooid zijn voor celkweek of bewaar ze in vloeibare stikstof als u niet meteen met kweken begint. Het wordt echter aanbevolen om, als u de cellen voor later gebruik wilt bewaren, verse voorraden te kweken en meerdere ampullen in te vriezen. De cellen worden cryopreserveerd in 45% RPMI-1640, 50% FBS en 5% DMSO (weefselkweekkwaliteit).

1. 1. Doe 10 ml RPMI-1640, 15% foetaal runder serum (FBS), ± antibiotica in een T-25 kolf met een geventileerde dop.
   2. Laat de media in evenwicht komen in een bevochtigde incubator van 37°C met 5% CO₂ in de lucht gedurende 30 minuten. Kolven moeten rechtopstaand worden geïncubeerd.
   3. Ontdooi elke ampul of elk flesje met bevroren cellen één voor één in een waterbad van 37°C of in een bekerglas met lauw water.
   4. Maak de buitenkant van de ampul of het flesje snel schoon met 70% ethanol. Als de cellen in een glazen ampul zitten, breek de ampul dan voorzichtig en zorg ervoor dat u uw vingers beschermt tegen gebroken glas.
   5. Verwijder de 1 ml bevroren cellen met een steriele pipet en plaats ze in een T-25-kolf met 10 ml medium. Label de kolf duidelijk om elke cellijn te identificeren.
   6. Plaats de kolf in een bevochtigde broedstoof van 37°C met 5% CO₂ in de lucht. Flessen moeten rechtopstaand worden geïncubeerd.
   7. Verwijder na 24 uur 5 ml medium van bovenaf, zonder de lymfocyten op de bodem van de kolf te verstoren, en vervang dit door 5 ml voorverwarmd medium.
   8. Ga verder met het lymfoblastcelkweekprotocol.

Lymfoblastcultuur

1. 1. Drie tot vier dagen na het ontdooien, tel de cellen. Cellen zijn niet-klevend en groeien in klonten. Breek klonten door voorzichtig te pipetteren.
   2. Cellen tellen.
   3. Idealiter mag de celconcentratie niet hoger zijn dan 2 x 10⁶ cellen/ml.
   4. Afhankelijk van de celconcentratie, cellen opnieuw voeden, splitsen of invriezen.
   5. Voeg opnieuw 5-6 ml geëquilibreerd groeimedium toe.
   6. Zaai nieuwe culturen op minimaal 2 x 10⁵ cellen/ml.
   7. Cellen moeten worden ingevroren in een verhouding van ongeveer 5 x 10⁶ cellen/ml. Volg het celinvriesprotocol.

Bevriezen van lymfoblasten

1. 1. Cellen moeten worden ingevroren in een verhouding van ongeveer 5 x 10⁶ cellen/ml.
   2. Breng het juiste volume cellen over in een conische buis van 15 of 50 ml.
   3. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4°C en 100 xg.
   4. Verwijder het medium en suspendeer het opnieuw in het juiste volume koudvriesmedium.
   5. Breng 1 ml cellen over in het cryoviaaltje.
   6. Plaats de cryobuisjes in de vrieskamer en zet de kamer een nacht in de vriezer bij een temperatuur van -80°C.
   7. De volgende dag worden de cryobuisjes in vloeibare stikstof gedaan.

Wendy Norris