अमर सेल

संस्कृती प्रोटोकॉल

अमर सेल कल्चर प्रोटोकॉल

पीआरएफ सेल आणि टिश्यू बँकेला अमर सेल लाइन्स उदारपणे निर्माण केल्याबद्दल आणि प्रदान केल्याबद्दल आम्ही हार्वर्ड विद्यापीठातील डॉ. मार्टिन डॉर्फ यांचे आभार मानतो. धन्यवाद.

खालील प्रोटोकॉलचा वापर करून PRF सेल लाइन्स अमर झाल्या होत्या:

रेट्रोव्हायरस संसर्ग

A. व्हायरसची निर्मिती: ट्रान्सफेक्शनच्या 12-24 तास आधी, पॅकेजिंग HEK293 सेल 60-80% संगमावर 100-मिमी प्लेटवर लावले होते. प्रत्येक प्लेट 12μg रेट्रोव्हायरल कंस्ट्रक्ट pBABE-puro (SV40T) आणि 12μg pCL-Ampho रेट्रोव्हायरस पॅकेजिंग वेक्टरसह सह-संक्रमण करण्यात आली. संक्रमणानंतर 8-10 तासांनी कल्चर मिडीयम एस्पिरेट केले गेले आणि 10 मिली संपूर्ण माध्यमाने बदलले. इष्टतम व्हायरल टायटर मिळविण्यासाठी कल्चर अतिरिक्त 48-72 तासांसाठी उष्मायन केले गेले.

B. लक्ष्य पेशी संक्रमित करणे: लक्ष्य पेशी संसर्गाच्या 12-18 तास आधी 100 मिमी प्लेटवर लावल्या गेल्या. पॅकेजिंग सेलमधील माध्यम 0.45-μm सेल्युलोज एसीटेट किंवा पॉलीसल्फोनिक फिल्टरद्वारे गोळा आणि फिल्टर केले गेले. एकदा पेशी 40-60% संगम झाल्यानंतर, 10 μg/ml पॉलीब्रेनच्या अंतिम एकाग्रतेसह 8 मिली व्हायरस-युक्त माध्यम जोडले गेले. संक्रमणाच्या तीन फेऱ्या अनुक्रमे ~ 12 तासांच्या अंतराने केल्या गेल्या. 24 तासांच्या उष्मायनानंतर माध्यम बदलण्यात आले.

C. स्थिर सेल लाईन्सची निवड: संसर्गानंतर 72 तासांनंतर, पेशी ट्रिप्सिनाइज केल्या गेल्या, 1:3 वाजता विभाजित केल्या गेल्या आणि 3 μg/ml प्युरोमायसिनच्या उपस्थितीत दोन 100 मिमी प्लेट्समध्ये हस्तांतरित केल्या गेल्या, तसेच प्रतिजैविक नसलेली एक नियंत्रण प्लेट. स्थिर सेल लाइन्स तयार करण्यासाठी अंदाजे 2 ते 4 आठवड्यांसाठी प्रत्येक 2 किंवा 3 दिवसांनी संस्कृती माध्यम बदलले गेले.

ग्रोथ मीडिया

DMEM- Invitrogen #11960-044 (L-glutamine शिवाय उच्च ग्लुकोज)

15% FBS फेटल बोवाइन सीरम

1% (1x) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमायसिन (इनव्हिट्रोजन#15140-122)

1% (1X) एल-ग्लुटामाइन (इनव्हिट्रोजन#25030-081)

0.75 μg/ml प्युरोमायसिन (InvivoGen #ant-pr-1)

ट्रिप्सिन

ट्रिप्सिन EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

हँकचे संतुलित मीठ समाधान

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) कॅल्शियम क्लोराईड, (-)मॅग्नेशियम क्लोराईड, (-) मॅग्नेशियम सल्फेट)

फ्रीझिंगसाठी DMSO

सेल कल्चर ग्रेड DMSO

कोरड्या बर्फावर गोठलेल्या पेशी सुमारे 5 x 10 च्या एकाग्रतेवर पोहोचतील⁵पेशी/कुपी

फायब्रोब्लास्ट्स वितळण्यासाठी प्रोटोकॉल

३७ डिग्री सेल्सिअस पाण्याच्या बाथमध्ये पेशी वेगाने वितळवा.
70% इथेनॉलने कुपीची बाहेरची बाजू पुसून टाका.
वितळलेल्या पेशी एका T25 फ्लास्कमध्ये हस्तांतरित करा ज्यामध्ये प्युरोमायसिनशिवाय 5 मिली ग्रोथ मीडिया आहे.
फ्लास्क रात्रभर 37 डिग्री सेल्सिअस इनक्यूबेटरमध्ये ठेवा.
पुढील दिवशी, पेशी संलग्न झाल्याची खात्री करण्यासाठी सूक्ष्मदर्शकाखाली निरीक्षण करा.
मीडिया काढा आणि ताज्या ग्रोथ मीडियासह बदला.

पीआरएफ सेल लाइन्सचे उपसंस्कृती

1) जेव्हा पेशी स्थापित होतात आणि वाढतात तेव्हा 0.75 μg/ml प्युरोमायसिन असलेले माध्यम वापरण्यास सुरुवात करा. 0.75 μg/ml प्युरोमायसिन असलेल्या माध्यमातील पेशींची देखभाल करणे सुरू ठेवा.

2) संगम असताना पेशी विभाजित केल्या पाहिजेत.

३) पेशी विभाजित करण्यासाठी (दिलेले खंड हे गृहीत धरून पेशी T25 मध्ये आहेत):

A. निर्जंतुकीकरण तंत्र वापरून, माध्यम काढून टाका आणि 2-3 मिली निर्जंतुक HBSS सह फ्लास्क स्वच्छ धुवा. HBSS काढा आणि टाकून द्या.

B. 1 मिली ट्रिप्सिन घाला आणि 2-3 मिनिटे उबवा. पेशी गोलाकार, उचलणे आणि तरंगणे सुरू झाले आहे का हे निर्धारित करण्यासाठी उलट्या सूक्ष्मदर्शकाखाली तपासले पाहिजे. 3 मिनिटांनंतर पेशी विलग न झाल्यास, तुम्ही आणखी 1-2 मिनिटे उष्मायन करू शकता

C. सर्व पेशी काढून टाकण्यासाठी टोपी घट्ट करा आणि हलक्या हाताने फ्लास्क बाजूला करा. आवश्यक असल्यास, पेशी सोडविण्यासाठी फ्लास्क बाजूला हलके टॅप केले जाऊ शकते.

D. ट्रिप्सिन निष्क्रिय करण्यासाठी पेशी फ्लोटिंग होताच फ्लास्कमध्ये 4 मिली नवीन माध्यम जोडा. प्लॅस्टिकच्या सर्व पेशी धुवून द्रावणात जाण्यासाठी फ्लास्कच्या बाजू अनेक वेळा नवीन माध्यमाने स्वच्छ धुवा. पेशी असलेले सर्व द्रव काढून टाका आणि 15 मिली शंकूच्या आकारात (किंवा तुम्ही 3 किंवा अधिक फ्लास्क एकत्र करत असाल तर 50 मिली).

E. निर्जंतुकीकरण तंत्राचा वापर करून, हेमॅसिटोमीटरवर मोजण्यासाठी अलिकट काढा.

F. तुम्ही पेशी मोजत असताना, उर्वरित द्रावण क्लिनिकल सेंट्रीफ्यूजमध्ये 1000 rpms वर 5 मिनिटे कातले पाहिजे.

4) तुमच्या सेलची संख्या मोजल्यानंतर, 2.5 x 10 वर सेल प्लेट करा⁵ सेल प्रति T 25 फिल्टर टॉप फ्लास्क.

5) पेशींना दर 2-3 दिवसांनी 0.75 μg/ml प्युरोमायसिन असलेले ताजे वाढीचे माध्यम दिले पाहिजे.

अतिशीत:

सेल 5x 10 पेक्षा कमी नसावेत⁵ पेशी /ml/cryovial वाढ मीडिया मध्ये 10% DMSO आणि 30% FBS असलेले puromycin शिवाय आणि त्यानंतर रात्रभर -80°C तापमानात isopropanol फ्रीझिंग चेंबरमध्ये ठेवले जाते. दुसऱ्या दिवशी द्रव नायट्रोजनमध्ये स्थानांतरित करा.

अधिक माहितीसाठी कृपया संपर्क साधा:

लेस्ली बी. गॉर्डन, एमडी, पीएचडी

ब्राऊन युनिव्हर्सिटीच्या बालरोग संशोधन वॉरेन अल्पर्ट मेडिकल स्कूलचे प्राध्यापक आणि बालरोग विभाग, हॅस्ब्रो चिल्ड्रन हॉस्पिटल, प्रोव्हिडन्स, आरआय डिपार्टमेंट ऑफ ऍनेस्थेसिया, चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल बोस्टन आणि हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए मेडिकल डायरेक्टर, प्रोजेरिया रिसर्च फाउंडेशन

फोन: ९७८-५३५-२५९४
फॅक्स: 508-543-0377
[email protected]

वेंडी नॉरिस

PRF सेल आणि टिश्यू बँक
फोन: ४०१-२७४-११२२ x ४८०६३
[email protected]

साइन अप करा

आमच्या साठी

अपडेट्स!

आता साइन अप करा

एकत्र, आम्ही

होईल

उपचार शोधा!

आता दान करा