Tripsin

Tripsin EDTA C.25% (Invitrogen#25200-056)

Larutan Garam Seimbang Hank

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) kalsium klorida, (-) magnesium klorida, (-) magnesium sulfat)

DMSO untuk Pembekuan

DMSO Kelas Kultur Sel

Sel akan tiba dalam keadaan beku di atas es kering dengan konsentrasi sekitar 5 x 10⁵sel/botol

Protokol pencairan fibroblas

1. Cairkan sel dengan cepat dalam air bersuhu 37°C.
2. Bersihkan bagian luar botol dengan etanol 70%.
3. Pindahkan sel yang telah dicairkan ke dalam labu T25 yang berisi 5 ml media pertumbuhan tanpa puromisin.
4. Letakkan labu dalam inkubator 37°C semalaman.
5. Keesokan harinya, amati di bawah mikroskop untuk memastikan sel telah menempel.
6. Buang media dan ganti dengan media pertumbuhan yang baru.

Subkultur garis sel PRF

1) Setelah sel terbentuk dan tumbuh, mulailah menggunakan media yang mengandung puromisin 0,75 μg/ml. Terus pertahankan sel dalam media yang mengandung puromisin 0,75 μg/ml.

2) Sel harus dipisah ketika konfluen.

3) Untuk membagi sel (volume yang diberikan dengan asumsi sel berada dalam T25):

A. Dengan menggunakan teknik steril, keluarkan media dan bilas labu dengan 2-3 ml HBSS steril. Keluarkan dan buang HBSS.

B. Tambahkan 1 ml tripsin dan inkubasi selama 2-3 menit. Sel harus diperiksa di bawah mikroskop terbalik untuk menentukan apakah sel sudah mulai membulat, terangkat, dan mengapung. Jika sel tidak terlepas setelah 3 menit, Anda dapat menginkubasi lagi selama 1-2 menit.

C. Kencangkan tutup dan miringkan labu perlahan dari satu sisi ke sisi lain untuk melepaskan semua sel. Labu dapat diketuk pelan di bagian samping untuk melepaskan sel jika perlu.

D. Tambahkan 4 ml media baru ke dalam labu segera setelah sel mengapung untuk menonaktifkan tripsin. Bilas sisi-sisi labu beberapa kali dengan media baru untuk membersihkan semua sel dari plastik dan memasukkannya ke dalam larutan. Buang semua sel yang mengandung cairan dan pindahkan ke dalam tabung kerucut 15 ml (atau 50 ml jika Anda menggabungkan 3 labu atau lebih).

E. Dengan menggunakan teknik steril, ambil sebagian untuk dihitung pada hemasitometer.

F. Saat Anda menghitung sel, sisa larutan harus diputar dalam centrifuge klinis selama 5 menit pada 1000 rpm.

4) Setelah menghitung jumlah sel Anda, plat sel pada 2,5 x 10⁵ sel per tabung filter T 25 atas.

5) Sel harus diberi makan setiap 2-3 hari dengan media pertumbuhan segar yang mengandung 0,75 μg/ml puromisin.

Pembekuan:

Sel harus dibekukan pada suhu tidak kurang dari 5x 10⁵ sel /ml/kriovial dalam media pertumbuhan mengandung 10% DMSO dan 30% FBS tanpa puromisin dan kemudian ditempatkan dalam ruang pembeku isopropanol pada suhu -80°C semalaman. Pindahkan ke nitrogen cair keesokan harinya.

Wendy Norris