Mencairkan garis sel PRF

1. Cairkan sel dengan cepat dalam air bersuhu 37˚C.
2. Bersihkan bagian luar botol dengan etanol 70%.
3. Pindahkan sel yang telah dicairkan ke dalam labu T25 yang berisi 5 ml media pertumbuhan.
4. Letakkan labu dalam inkubator 37˚C semalaman.
5. Keesokan harinya, amati di bawah mikroskop untuk memastikan sel telah menempel.
6. Buang media dan ganti dengan media pertumbuhan yang baru.

Subkultur garis sel PRF

1. Sel harus dipisah ketika menyatu.
2. Untuk membagi sel (volume yang diberikan dengan asumsi sel berada dalam T25):
   a) Dengan menggunakan teknik steril, keluarkan media dan bilas labu dengan 2-3 ml HBSS steril. Keluarkan dan buang HBSS.
   b) Tambahkan 1 ml tripsin dan inkubasi selama 2-3 menit. Sel harus diperiksa di bawah mikroskop terbalik untuk menentukan apakah sel sudah mulai membulat, terangkat, dan mengapung. Jika sel tidak terlepas setelah 3 menit, Anda dapat menginkubasinya lagi selama 1-2 menit.
   c) Kencangkan tutup dan miringkan labu perlahan dari satu sisi ke sisi lain untuk melepaskan semua sel. Labu dapat diketuk pelan di bagian samping untuk melepaskan sel jika perlu.
   d) Tambahkan 4 ml media baru ke dalam labu segera setelah sel mengapung untuk menonaktifkan tripsin. Bilas sisi-sisi labu beberapa kali dengan media baru untuk membersihkan semua sel dari plastik dan memasukkannya ke dalam larutan. Buang semua sel yang mengandung cairan dan pindahkan ke dalam tabung kerucut 15 ml (atau 50 ml jika Anda menggabungkan 3 labu atau lebih).
   e) Dengan menggunakan teknik steril, ambil sebagian untuk dihitung pada hemocytometer.
   f) Saat Anda menghitung sel, sisa larutan harus diputar dalam centrifuge klinis selama 5 menit pada 1000 rpm.
3. Setelah menghitung jumlah sel Anda, plat sel pada 2,5 x 10⁵ sel per tabung filter atas T25.
4. Sel harus diberi makan setiap 2-3 hari dengan media pertumbuhan segar.

Pembekuan:

Sel harus dibekukan pada suhu tidak kurang dari 5 x 10⁵ sel/ml/cryovial dalam media pertumbuhan yang mengandung 10% DMSO dan 30% FBS dan kemudian ditempatkan dalam ruang pembeku isopropanol pada suhu -80˚C semalaman. Pindahkan ke nitrogen cair keesokan harinya.

Protokol untuk Subkultur dan Pembekuan Fibroblast