Auftauen von PRF-Zelllinien

1. Tauen Sie die Zellen schnell in einem 37 °C heißen Wasserbad auf.
2. Wischen Sie die Außenseite des Fläschchens mit 70% Ethanol ab.
3. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in eine T25-Flasche mit 5 ml Wachstumsmedium.
4. Stellen Sie den Kolben über Nacht in einen Inkubator mit 37 °C.
5. Beobachten Sie am nächsten Tag unter dem Mikroskop, ob sich Zellen angeheftet haben.
6. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Wachstumsmedium.

Subkultivierung von PRF-Zelllinien

1. Die Zellen sollten geteilt werden, wenn sie konfluent sind.
2. So teilen Sie Zellen (die angegebenen Volumina gehen davon aus, dass sich die Zellen in einem T25 befinden):
   a) Unter Verwendung steriler Techniken das Medium entfernen und den Kolben mit 2–3 ml sterilem HBSS spülen. HBSS entfernen und entsorgen.
   b) 1 ml Trypsin hinzufügen und 2–3 Minuten inkubieren. Die Zellen sollten unter einem inversen Mikroskop überprüft werden, um festzustellen, ob sie begonnen haben, sich zu runden, anzuheben und zu schweben. Wenn sich die Zellen nach 3 Minuten nicht ablösen, können Sie weitere 1–2 Minuten inkubieren.
   c) Den Deckel festziehen und den Kolben vorsichtig von einer Seite zur anderen kippen, um alle Zellen zu lösen. Bei Bedarf kann der Kolben leicht seitlich geklopft werden, um die Zellen zu lösen.
   d) Geben Sie 4 ml neues Medium in den Kolben, sobald die Zellen schwimmen, um das Trypsin zu inaktivieren. Spülen Sie die Seiten des Kolbens mehrere Male mit dem neuen Medium ab, um alle Zellen vom Kunststoff in die Lösung zu spülen. Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit, die Zellen enthält, und geben Sie sie in einen 15-ml-Erlenmeyerkolben (oder 50 ml, wenn Sie 3 oder mehr Kolben zusammenlegen).
   e) Unter Anwendung steriler Techniken entnehmen Sie eine Aliquote zur Auszählung auf einem Hämozytometer.
   f) Während Sie die Zellen zählen, sollte der Rest der Lösung 5 Minuten lang bei 1000 U/min in der klinischen Zentrifuge geschleudert werden.
3. Nach der Berechnung der Zellzahl werden die Zellen auf 2,5 x 10⁵ Zellen pro T25-Filterflasche.
4. Die Zellen sollten alle 2–3 Tage mit frischem Wachstumsmedium versorgt werden.

Einfrieren:

Zellen sollten bei mindestens 5 x 10 eingefroren werden⁵ Zellen/ml/Kryoröhrchen in Wachstumsmedium mit 10% DMSO und 30% FBS und anschließend über Nacht in eine Isopropanol-Gefrierkammer bei -80 °C gestellt. Am nächsten Tag in flüssigen Stickstoff überführen.

Protokoll zum Subkultivieren und Einfrieren von Fibroblasten