الخلية الخالدة

بروتوكولات الثقافة

بروتوكول زراعة الخلايا الخالدة

نشكر الدكتور مارتن دورف من جامعة هارفارد على سخائه في إنتاج سلالات الخلايا الخالدة وتوفيرها لبنك الخلايا والأنسجة PRF. شكرًا لك.

تم تخليد خطوط خلايا PRF باستخدام البروتوكول التالي:

عدوى الفيروسات الرجعية

أ. إنتاج الفيروس: قبل 12-24 ساعة من التحويل الجيني، تم وضع خلايا HEK293 المعبأة على صفيحة بقطر 100 مم عند التقاء 60-80%. تم تحويل كل صفيحة بشكل مشترك باستخدام 12 ميكروجرام من مركب pBABE-puro (SV40T) و12 ميكروجرام من ناقل التغليف الفيروسي الرجعي pCL-Ampho. تم شفط وسط الثقافة بعد 8-10 ساعات من التحويل الجيني، واستبداله بـ 10 مل من الوسط الكامل. تم تحضين الثقافة لمدة 48-72 ساعة إضافية لتحقيق أفضل تركيز فيروسي.

ب. إصابة الخلايا المستهدفة: تم وضع الخلايا المستهدفة على صفيحة 100 مم قبل 12-18 ساعة من العدوى. تم جمع الوسط من خلايا التغليف وتصفيته من خلال أسيتات السليلوز 0.45 ميكرومتر أو مرشح بولي سلفونيك. بمجرد أن تصبح الخلايا متجانسة 40-60%، تمت إضافة 8 مل من وسط يحتوي على الفيروس بتركيز نهائي 10 ميكروجرام / مل من البولي بريلين. تم إجراء ثلاث جولات من العدوى بشكل متتابع، بفاصل 12 ساعة تقريبًا. تم استبدال الوسط بعد حضانة لمدة 24 ساعة.

ج. اختيار خطوط الخلايا المستقرة: بعد 72 ساعة من الإصابة، تم معالجة الخلايا بالتربسين، وتقسيمها بنسبة 1:3 ونقلها إلى صفيحتين بقطر 100 مم في وجود 3 ميكروجرام/مل من البيوروميسين، بالإضافة إلى صفيحة تحكم واحدة بدون مضاد حيوي. تم تغيير وسط الثقافة كل 2 أو 3 أيام لمدة 2 إلى 4 أسابيع تقريبًا لإنتاج سلالات خلايا مستقرة.

وسائط النمو

DMEM- Invitrogen #11960-044 (نسبة عالية من الجلوكوز بدون L-glutamine)

مصل الجنين البقري 15% FBS

1% (1x) بنسلين-ستربتوميسين (Invitrogen#15140-122)

1% (1X) L-جلوتامين (Invitrogen#25030-081)

0.75 ميكروجرام/مل من البيوروميسين (InvivoGen #ant-pr-1)

التربسين

تريبسين EDTA C .25% (Invitrogen#25200-056)

محلول الملح المتوازن من هانك

HBSS- (Invitrogen#14170 (1X) (-) كلوريد الكالسيوم، (-) كلوريد المغنيسيوم، (-) كبريتات المغنيسيوم)

DMSO للتجميد

درجة زراعة الخلايا DMSO

ستصل الخلايا مجمدة على الجليد الجاف بتركيز يبلغ حوالي 5 × 10⁵خلايا/قارورة

بروتوكول إذابة الخلايا الليفية

قم بتذويب الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
امسح الجزء الخارجي من القارورة باستخدام الإيثانول 70%.
انقل الخلايا المذابة إلى قارورة T25 تحتوي على 5 مل من وسط النمو الخالي من البيوروميسين.
ضع القارورة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي، قم بالمراقبة تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد التصقت.
قم بإزالة الوسائط واستبدالها بوسائل نمو جديدة.

زراعة خلايا PRF

1) عندما يتم إنشاء الخلايا ونموها، ابدأ في استخدام الوسائط التي تحتوي على 0.75 ميكروجرام/مل من البيوروميسين. استمر في الحفاظ على الخلايا في الوسائط التي تحتوي على 0.75 ميكروجرام/مل من البيوروميسين.

2) ينبغي تقسيم الخلايا عند التقاءها.

3) لتقسيم الخلايا (الأحجام المعطاة تفترض وجود الخلايا في T25):

أ. باستخدام تقنية التعقيم، قم بإزالة الوسائط واشطف القارورة بـ 2-3 مل من HBSS المعقم. قم بإزالة HBSS والتخلص منه.

ب. أضف 1 مل من التربسين واحتضن لمدة 2-3 دقائق. يجب فحص الخلايا تحت المجهر المقلوب لتحديد ما إذا كانت قد بدأت في التكتل والارتفاع والطفو. إذا لم تنفصل الخلايا بعد 3 دقائق، يمكنك الحضن لمدة 1-2 دقيقة أخرى.

ج. أحكم إغلاق الغطاء وحرك القارورة برفق من جانب إلى آخر لإخراج جميع الخلايا. يمكن قرع القارورة برفق على أحد الجانبين لإخراج الخلايا إذا لزم الأمر.

د. أضف 4 مل من الوسط الجديد إلى القارورة بمجرد أن تطفو الخلايا لتعطيل التربسين. اشطف جوانب القارورة عدة مرات بالوسط الجديد لغسل جميع الخلايا من البلاستيك وإدخالها إلى المحلول. أزل جميع الخلايا السائلة التي تحتوي على الخلايا وانقلها إلى مخروطي الشكل سعة 15 مل (أو 50 مل إذا كنت تقوم بتجميع 3 قوارير أو أكثر).

هـ. باستخدام تقنية معقمة، قم بإزالة جزء معين لعده على جهاز عداد خلايا الدم.

و. أثناء عد الخلايا، يجب تدوير بقية المحلول في جهاز الطرد المركزي السريري لمدة 5 دقائق بسرعة 1000 دورة في الدقيقة.

4) بعد حساب عدد خلاياك، خلايا اللوحة عند 2.5 × 10⁵ خلايا لكل فلتر T 25 العلوي.

5) يجب تغذية الخلايا كل 2-3 أيام بوسط نمو طازج يحتوي على 0.75 ميكروجرام / مل من البيوروميسين.

التجميد:

يجب تجميد الخلايا عند درجة حرارة لا تقل عن 5 × 10⁵ خلايا /مل/زجاجة مبردة في وسائط النمو يحتوي على 10% DMSO و 30% FBS بدون البيوروميسين ثم توضع في حجرة تجميد الأيزوبروبانول عند درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل، ثم تنقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.

لمزيد من المعلومات يرجى الاتصال:

ليزلي ب. جوردون، دكتور في الطب، دكتور في الفلسفة

أستاذ أبحاث طب الأطفال كلية الطب وارن ألبرت بجامعة براون وقسم طب الأطفال، مستشفى هاسبرو للأطفال، بروفيدنس، رود آيلاند قسم التخدير، مستشفى الأطفال بوسطن وكلية الطب بجامعة هارفارد، بوسطن، ماساتشوستس المدير الطبي لمؤسسة أبحاث الشيخوخة المبكرة

الهاتف: 978-535-2594
فاكس: 508-543-0377
لجوردون@progeriaresearch.org

ويندي نوريس

بنك الخلايا والأنسجة PRF
الهاتف: 401-274-1122 x 48063
ونوريس@brownhealth.org

من اجلنا

التحديثات!

سجل الآن

معا نحن

سوف

ابحث عن العلاج!

تبرع الآن