TÉCNICAS DE CÉLULAS Y CULTIVOS. TEMA 2 1

Material necesario/imprescindible:-Campana flux laminar-Incubador (controla T y CO2).-Microscopio invertido Para mantener la asepsia, idealmente se debe trabajar en una sala aislada. Los laboratorios de cultivos se dividen en (diferentes en presión atmosférica):-General: presión positiva  cuando se abre la puerta no entrará aire de fuera, al revés, sale. Es mejor que salga que que se me contamine a mí. 15-20mm Hg.-Especifico en patógenos: trabajan con agentes potencialmente peligrosos: presión negativa  cuando se abre la puerta entra el aire. Es mejor que entre que no que salga. ¿Cómo se esteriliza la zona de trabajo? Con filtración del aire con los filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters). Retienen el 99.97% de las partículas de 0.22 micrómetros. Están en las camapanas de flujo laminar y en los incubadores. Muchas veces no son solo para la entrada de aire, sino también para la salida, por eso le llamamos que esterilizan el área. Es importante el mantenimiento rutinario e los equipos. Se controlan y cambian periódicamente (anualmente) porque si no al final se obstruyen y no filtran. CAMPANAS Las campanas de flujo laminar quieren reducir el riego de contaminación de la muestra, del trabajador, y del entorno. Es importante ya que hay muchos tipos de campanas, pero no todas cumplen esos 3 requisitos. Se clasifican en:-Horizontal: el aire fluye de forma horizontal. No protege al operador, ya que el aire va hacia él. HORIZONTAL VERTICAL TIPO 1, 2, 3

el primer microscopio Hooke observó laminillas de corcho y describió la célula. 1831, Brown demostró la existencia de un corpúsculo en el interior de las células, al que denominó núcleo 1837, Purkinje, introdujo el término de protoplasma 1838-39, por Schleiden&Schwann: las plantas y animales están constituidos por una o más unidades fundamentales: las células.

Hay 3 videos en Moodle del cambio, pase y congelación / descongelación. Color rojizo lo da el Rojo de fenol o Fenol Red, es indicador de pH. Cuando es rojo es aproximadamente de 7. Si cambiamos el medio cada 2-3 días, al final el medio tiene color amarillento a los 3 días. Si nunca se pone amarillo también puede ser que pase algo o que nos estemos anticipando demasiado. Cuando observamos las células y morfológicamente vemos errores se cambia el medio rápidamente. Células a 37 grados y el medio está en la nevera a 4 grados, por lo tanto se tiene que poner en el baño a 37 grados. Debe estar preparado antes de hacer el cambio, cuando se acaba se prevee que se hará de nuevo. Segundo punto: T-75 10 mL de medio T-50 5 mL de medio aprox Holding médium: Medio de aguante. Menos nutritivo. Se utiliza en situaciones excepcionales (tengo un congreso y no puedo ir a cambiar el medio, etc) y no durante etapas experimentales. Células adherentes: el cambio de medio es simple. Se quita el medio y se pone con la pipeta, sin que esta toque las paredes. Tanto en placas como en frascos. En labs más profesionales hay una bomba que succiona el medio y pone de nuevo. No hay que ser cuidadoso en cuanto al volumen exacto de medio, pero si que hay que hacer bastante rápido. Células en suspensión: más complicado. No podemos sacar directamente el medio porque contiene las células. Hay que separar por centrifugación. Se pone el medio en un falcon estéril, centrifugamos, tire el medio viejo y ponemos el nuevo. Muchas centrifugaciones tampoco son buenas para las cejas, y lo que se hace es diluir el medio viejo con medio nuevo. Y se basa en hacer diluciones entre semana por ejemplo y al final de la semana se hace una centrifugación. Muchas diluciones seguidas dificultaría la difusión de gases debido al elevado volumen de medio. Cambio de medio-> 2-3 veces por semana. El lunes y el viernes seguro para el fin de semana no se trabaja en los laboratorios. ¿Cuándo hacemos un pase? Cuando nos hemos quedado sin espacio y puede que haya inhibición por contacto. ¿Cómo hacemos un pase? Desorganizando la red de proteínas que forman la matriz extracelular y/o proteínas de unión/adhesión.

jj