TEMA 9 INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA DE TEJIDOS ¿Para qué queremos introducir ADN en una célula... more TEMA 9 INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA DE TEJIDOS ¿Para qué queremos introducir ADN en una célula? Conferir ventajas selectivas (ej. Resistencia a una sustancia tóxica) Caracterizar la función de la proteína de interés Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada) Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador) Obtener una proteína recombinante procesada correctamente para células de mamífero ESTRATEGIAS DE INTRODUCCIÓN DEL ADN CONDICIONES IDEALES DE INTRODUCCIÓN DEL ADN Basado en la eficiencia máxima y en la toxicidad nula, que no haya toxicidad. Cada tipo celular tiene una eficiencia y una toxicidad determinada para un mismo método, por eso se tiene que establecer empíricamente. MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
Ver vídeo de moodle. Si tenemos suspensión heterogénea, ¿cómo hacemos para obtener los componente... more Ver vídeo de moodle. Si tenemos suspensión heterogénea, ¿cómo hacemos para obtener los componentes separados de forma homogénea? Técnica asociada a la citometría de flujo FACS. Los enriquecimientos de cultivos se hacen en el cultivo primario, ya que con la disgregación conseguimos una mezcla heterogénea, y queremos todo separado. Cuando estas técnicas no estaban desarrolladas se usaba la muerte selectiva para quedarte con lo que tú querías. Un antibiótico con células resistentes por ejemplo. Clonaje por dilución: usar diluciones muy bajitas, de tal manera que se diga que por cada microlitro haya medio célula. Si tengo mi suspensión tan diluida, cuando cojo un microlitro, tendré como mucho una célula, si lo siembro en un medio de cultivo, tendré una célula sola. Cuando lo caracterizo puedo tenerlas separadas. SEPARACIÓN CELULAR A) SEDIMENTACIÓN: densidad celular aproximadamente de 1.06g/cm 3. Mucho tiempo durante el cual puede haber muerte celular. B) CENTRIFUGACIÓN: sedimentación celular acelerada. Si tenemos una suspensión celular y la dejamos en repaso, las células por su propio peso va sedimentando. La centrifugación lo acelera. Las células sedimentan en función de su densidad. Si nosotros añadimos a esa suspensión, soluciones con diferente densidad, al final las tengo separadas gracias a un gradiente de densidad (Ficoll. Metrizamida, percoll…). Lo clásico es hacer PBMC: es una muestra sanguínea de sangre periférica (células mononucleares de sangre periférica) linfocitos y monocitos. Sin granulocitos. Se usa mucho porque en humanos por ejemplo, es muy difícil de obtener biopsias de tejidos, así que de los PBMC puedo extraer material genético y hacer cultivos. Estos PBMC los puedo separar aun en monocitos y linfocitos. El ficoll es mucho más denso que la sangre, y nos interesa tener esa separación de fases, para que así después de la centrifugación se puedan separar las fases de la imagen. Es importante separar rápido el PBMC ya que el ficoll es tóxico y puede disminuir la viabilidad celular. Se ponen después en un medio llamado RPMI 1640, y ya podremos hacer nuestros análisis.
TEMA 6 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y AUTENTIFICACIÓN 1) OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Hablaremos de la prim... more TEMA 6 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y AUTENTIFICACIÓN 1) OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Hablaremos de la primera parte. Aspectos generales:-Cumplir la legislación de experimentación animal. Hay un comité ético que se encarga de asegurarse que el animal no sufra, o sufra lo menos posible.-Limpiar la fuente del tejido con etanol 70%.-Extraer el tejido lo más aspecticamente posible.-Llevarlo al laboratorio de cultivos (máximo 72h a 4ºC). Aspectos específicos de las biopsias humanas:-Consentimiento: comité ético del hospital, del cirujano y del donante.-Coordinar momento y lugar de obtención con momento y lugar de inicio del cultivo.-Tener en cuenta el posible riesgo de infección. 2) AISLAMIENTO DEL TEJIDO Requerimientos comunes del proceso: 1. Eliminar grasa y tejido necrótico durante disección 2. Cortar finamente el tejido con instrumentos afilados para minimizar daño 3. Centrifugar para eliminar enzimas usados para disgregar 4. Trabajar en concentraciones celulares superiores a un subcultivo de línea, pues el grado de muerte celular es superior 5. Medios ricos con FBS más garantías de éxito 6. Tejido embrionario:-Más fácil de disgregar,-Genera más células viables y prolifera más rápidamente
Hay 3 videos en Moodle del cambio, pase y congelación / descongelación. Color rojizo lo da el Roj... more Hay 3 videos en Moodle del cambio, pase y congelación / descongelación. Color rojizo lo da el Rojo de fenol o Fenol Red, es indicador de pH. Cuando es rojo es aproximadamente de 7. Si cambiamos el medio cada 2-3 días, al final el medio tiene color amarillento a los 3 días. Si nunca se pone amarillo también puede ser que pase algo o que nos estemos anticipando demasiado. Cuando observamos las células y morfológicamente vemos errores se cambia el medio rápidamente. Células a 37 grados y el medio está en la nevera a 4 grados, por lo tanto se tiene que poner en el baño a 37 grados. Debe estar preparado antes de hacer el cambio, cuando se acaba se prevee que se hará de nuevo. Segundo punto: T-75 10 mL de medio T-50 5 mL de medio aprox Holding médium: Medio de aguante. Menos nutritivo. Se utiliza en situaciones excepcionales (tengo un congreso y no puedo ir a cambiar el medio, etc) y no durante etapas experimentales. Células adherentes: el cambio de medio es simple. Se quita el medio y se pone con la pipeta, sin que esta toque las paredes. Tanto en placas como en frascos. En labs más profesionales hay una bomba que succiona el medio y pone de nuevo. No hay que ser cuidadoso en cuanto al volumen exacto de medio, pero si que hay que hacer bastante rápido. Células en suspensión: más complicado. No podemos sacar directamente el medio porque contiene las células. Hay que separar por centrifugación. Se pone el medio en un falcon estéril, centrifugamos, tire el medio viejo y ponemos el nuevo. Muchas centrifugaciones tampoco son buenas para las cejas, y lo que se hace es diluir el medio viejo con medio nuevo. Y se basa en hacer diluciones entre semana por ejemplo y al final de la semana se hace una centrifugación. Muchas diluciones seguidas dificultaría la difusión de gases debido al elevado volumen de medio. Cambio de medio-> 2-3 veces por semana. El lunes y el viernes seguro para el fin de semana no se trabaja en los laboratorios. ¿Cuándo hacemos un pase? Cuando nos hemos quedado sin espacio y puede que haya inhibición por contacto. ¿Cómo hacemos un pase? Desorganizando la red de proteínas que forman la matriz extracelular y/o proteínas de unión/adhesión.
El volumen que yo cojo de la muestra es independiente del resultado, porque cabe un volumen exact... more El volumen que yo cojo de la muestra es independiente del resultado, porque cabe un volumen exacto en la cámara de Neubauer. Tengo que deshacer la dilución, multiplicando x10000 al final. TÉCNICAS DE RECUENTO CELULAR Determinación del número de células que tenemos en suspensión:-Cámara de recuento celular o hemocitómetro (Búrker, Neubauer): se cuenta al microscopio el número de células en un volumen conocido y así se determina la densidad celular. El volumen de la cámara es fijo. Cabe un volumen concreto. Si cuando analizamos viabilidad le añadimos colorante, tengo que tenerlo en cuenta para deshacer la dilución también.-"Cell Coulter": se usa en labs clínicos. Permite contar y medir el diámetro de las partículas en suspensión. Cuando el recuento es fisiológico y no fisiopatológico, además de hacer el recuento automático, lo hace manual para supervisar los resultados.
Material necesario/imprescindible:-Campana flux laminar-Incubador (controla T y CO2).-Microscopio... more Material necesario/imprescindible:-Campana flux laminar-Incubador (controla T y CO2).-Microscopio invertido Para mantener la asepsia, idealmente se debe trabajar en una sala aislada. Los laboratorios de cultivos se dividen en (diferentes en presión atmosférica):-General: presión positiva cuando se abre la puerta no entrará aire de fuera, al revés, sale. Es mejor que salga que que se me contamine a mí. 15-20mm Hg.-Especifico en patógenos: trabajan con agentes potencialmente peligrosos: presión negativa cuando se abre la puerta entra el aire. Es mejor que entre que no que salga. ¿Cómo se esteriliza la zona de trabajo? Con filtración del aire con los filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters). Retienen el 99.97% de las partículas de 0.22 micrómetros. Están en las camapanas de flujo laminar y en los incubadores. Muchas veces no son solo para la entrada de aire, sino también para la salida, por eso le llamamos que esterilizan el área. Es importante el mantenimiento rutinario e los equipos. Se controlan y cambian periódicamente (anualmente) porque si no al final se obstruyen y no filtran. CAMPANAS Las campanas de flujo laminar quieren reducir el riego de contaminación de la muestra, del trabajador, y del entorno. Es importante ya que hay muchos tipos de campanas, pero no todas cumplen esos 3 requisitos. Se clasifican en:-Horizontal: el aire fluye de forma horizontal. No protege al operador, ya que el aire va hacia él. HORIZONTAL VERTICAL TIPO 1, 2, 3
TEMA 2: La cèl·lula en cultiu: condicions d'incubació, medis i superfícies de creixement Las célu... more TEMA 2: La cèl·lula en cultiu: condicions d'incubació, medis i superfícies de creixement Las células necesitan para crecer:-Sustrato (medio donde adherirse)-Nutrientes (medio de cultivo)-Ambiente (CO, 37ºC, humedad)-Todo eso en condiciones de esterilidad (técnica aseptica, antibióticos y antimicóticos). Los antibióticos los uso en los procesos largos, pero en el momento del experimento real, al final de la línea celular, lo quito ya que me puede hacer variar los resultados. 1. CO2 y O2 Tenemos que controlar sobretodo la concentración de oxigeno y de CO2:-CO2: importa en la regulación del pH celular, junto con el bicarbonato sódico. En función de la cantidad de bicarbonato sódico que tengan nuestras células, sabremos que tiene más o menos CO2. Normalmente usamos un 5% de CO2.-O2: 20 o 95% de oxigeno en cultivos de células o tejidos el rango depende del tipo celular del estudio. En células de mamíferos se pone un 20-21% de oxígeno. Se debe evitar la toxicidad (quelantes de radicales libres) el oxigeno da ambiente oxidante, así que tenemos que neutralizarlo. Teniendo las condiciones de nuestro incubador correctas, tenemos que asegurarnos de que haya una difusión adecuada por órganos y tejidos, no podemos poner un volumen muy grande. Normalmente se habla de que el medio de trabajo debería tener entre 2 y 5 mm de volumen (0.2-0.5 ml/cm2). 2. TEMPERATURA Dependiendo del tipo de célula que yo trabajo, ajusto la temperatura, vemos algunas óptimas:-37ºC homeotermos-38.5ºC aves-15-26ºC poiquilotermos Se permite una variación de medio grado. A pesar de esas ser las optimas, las puedo criopreservar a-196ºC o 4ºC, donde no mueren, solo se para su crecimiento. Cambios de temperatura también influencian en el pH, así que CO2 tiene una solubilidad superior a temperatura más baja GRAN INFLUENCIA EN LA TASA DE CRECIMIENTO Y METABOLISMO DE LAS CÉLULAS.
La técnica de cultivo celular o técnicas asociadas a in vitro, tiene una parte muy protocolaria/c... more La técnica de cultivo celular o técnicas asociadas a in vitro, tiene una parte muy protocolaria/científica, que se tienen que seguir de forma muy estricta (el "como" se sigue de forma muy rigurosa, se necesita ser experto); por otro lado esá la parte más creativa, se puede realizar el tipo de ensayo que tú prefieras, con muchas formas experimentales. La parte creativa es la que le da la gracia a trabajar con células. BREVE HISTORIA El cultivo de células in vitro se hace a últimos del s XIX, cogían embriones y los tenían in vitro. Claude Bernard y Wilhem Roux, ambos embriólogos, vieron que al sacarlo del organismo y ponerle unas condiciones concretas, vieron que el embrión sobrevivía un cierto tiempo, estando fisiológicamente activo: El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la embriología:-Al 1878, Claude Bernard demostró que el sistema fisiológico de un organismo podía ser mantenido como un sistema vivo después de la muerte del organismo.-En 1885, Wilhem Roux concluyó que el proceso de crecimiento específico, observado en el mantenimiento de una porción de embrión de pollo en solución fisiológica tibia, sucede independientemente de las otras partes del embrión. Fue pionero en la manipulación experimental de las células en desarrollo.-1907: A pesar de ellos, el "padre" es Ross G. Harrisson, trabajaba con células de médula espinal embrionaria de anfibios. el zoólogo estadounidense Ross G. Harrison fue el primer investigador que utilizó técnicas in vitro para al estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios.-Observó el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células-El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada. Usaba técnicas de microbiología, como la de la gota inversa: pone tejido boca abajo y una gota de linfa lo rodeaba. Ese ambiente aislado lo mantenía estéril.
TEMA 9 INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA DE TEJIDOS ¿Para qué queremos introducir ADN en una célula... more TEMA 9 INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA DE TEJIDOS ¿Para qué queremos introducir ADN en una célula? Conferir ventajas selectivas (ej. Resistencia a una sustancia tóxica) Caracterizar la función de la proteína de interés Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada) Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador) Obtener una proteína recombinante procesada correctamente para células de mamífero ESTRATEGIAS DE INTRODUCCIÓN DEL ADN CONDICIONES IDEALES DE INTRODUCCIÓN DEL ADN Basado en la eficiencia máxima y en la toxicidad nula, que no haya toxicidad. Cada tipo celular tiene una eficiencia y una toxicidad determinada para un mismo método, por eso se tiene que establecer empíricamente. MÉTODOS DE TRANSFECCIÓN
Ver vídeo de moodle. Si tenemos suspensión heterogénea, ¿cómo hacemos para obtener los componente... more Ver vídeo de moodle. Si tenemos suspensión heterogénea, ¿cómo hacemos para obtener los componentes separados de forma homogénea? Técnica asociada a la citometría de flujo FACS. Los enriquecimientos de cultivos se hacen en el cultivo primario, ya que con la disgregación conseguimos una mezcla heterogénea, y queremos todo separado. Cuando estas técnicas no estaban desarrolladas se usaba la muerte selectiva para quedarte con lo que tú querías. Un antibiótico con células resistentes por ejemplo. Clonaje por dilución: usar diluciones muy bajitas, de tal manera que se diga que por cada microlitro haya medio célula. Si tengo mi suspensión tan diluida, cuando cojo un microlitro, tendré como mucho una célula, si lo siembro en un medio de cultivo, tendré una célula sola. Cuando lo caracterizo puedo tenerlas separadas. SEPARACIÓN CELULAR A) SEDIMENTACIÓN: densidad celular aproximadamente de 1.06g/cm 3. Mucho tiempo durante el cual puede haber muerte celular. B) CENTRIFUGACIÓN: sedimentación celular acelerada. Si tenemos una suspensión celular y la dejamos en repaso, las células por su propio peso va sedimentando. La centrifugación lo acelera. Las células sedimentan en función de su densidad. Si nosotros añadimos a esa suspensión, soluciones con diferente densidad, al final las tengo separadas gracias a un gradiente de densidad (Ficoll. Metrizamida, percoll…). Lo clásico es hacer PBMC: es una muestra sanguínea de sangre periférica (células mononucleares de sangre periférica) linfocitos y monocitos. Sin granulocitos. Se usa mucho porque en humanos por ejemplo, es muy difícil de obtener biopsias de tejidos, así que de los PBMC puedo extraer material genético y hacer cultivos. Estos PBMC los puedo separar aun en monocitos y linfocitos. El ficoll es mucho más denso que la sangre, y nos interesa tener esa separación de fases, para que así después de la centrifugación se puedan separar las fases de la imagen. Es importante separar rápido el PBMC ya que el ficoll es tóxico y puede disminuir la viabilidad celular. Se ponen después en un medio llamado RPMI 1640, y ya podremos hacer nuestros análisis.
TEMA 6 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y AUTENTIFICACIÓN 1) OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Hablaremos de la prim... more TEMA 6 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO Y AUTENTIFICACIÓN 1) OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Hablaremos de la primera parte. Aspectos generales:-Cumplir la legislación de experimentación animal. Hay un comité ético que se encarga de asegurarse que el animal no sufra, o sufra lo menos posible.-Limpiar la fuente del tejido con etanol 70%.-Extraer el tejido lo más aspecticamente posible.-Llevarlo al laboratorio de cultivos (máximo 72h a 4ºC). Aspectos específicos de las biopsias humanas:-Consentimiento: comité ético del hospital, del cirujano y del donante.-Coordinar momento y lugar de obtención con momento y lugar de inicio del cultivo.-Tener en cuenta el posible riesgo de infección. 2) AISLAMIENTO DEL TEJIDO Requerimientos comunes del proceso: 1. Eliminar grasa y tejido necrótico durante disección 2. Cortar finamente el tejido con instrumentos afilados para minimizar daño 3. Centrifugar para eliminar enzimas usados para disgregar 4. Trabajar en concentraciones celulares superiores a un subcultivo de línea, pues el grado de muerte celular es superior 5. Medios ricos con FBS más garantías de éxito 6. Tejido embrionario:-Más fácil de disgregar,-Genera más células viables y prolifera más rápidamente
Hay 3 videos en Moodle del cambio, pase y congelación / descongelación. Color rojizo lo da el Roj... more Hay 3 videos en Moodle del cambio, pase y congelación / descongelación. Color rojizo lo da el Rojo de fenol o Fenol Red, es indicador de pH. Cuando es rojo es aproximadamente de 7. Si cambiamos el medio cada 2-3 días, al final el medio tiene color amarillento a los 3 días. Si nunca se pone amarillo también puede ser que pase algo o que nos estemos anticipando demasiado. Cuando observamos las células y morfológicamente vemos errores se cambia el medio rápidamente. Células a 37 grados y el medio está en la nevera a 4 grados, por lo tanto se tiene que poner en el baño a 37 grados. Debe estar preparado antes de hacer el cambio, cuando se acaba se prevee que se hará de nuevo. Segundo punto: T-75 10 mL de medio T-50 5 mL de medio aprox Holding médium: Medio de aguante. Menos nutritivo. Se utiliza en situaciones excepcionales (tengo un congreso y no puedo ir a cambiar el medio, etc) y no durante etapas experimentales. Células adherentes: el cambio de medio es simple. Se quita el medio y se pone con la pipeta, sin que esta toque las paredes. Tanto en placas como en frascos. En labs más profesionales hay una bomba que succiona el medio y pone de nuevo. No hay que ser cuidadoso en cuanto al volumen exacto de medio, pero si que hay que hacer bastante rápido. Células en suspensión: más complicado. No podemos sacar directamente el medio porque contiene las células. Hay que separar por centrifugación. Se pone el medio en un falcon estéril, centrifugamos, tire el medio viejo y ponemos el nuevo. Muchas centrifugaciones tampoco son buenas para las cejas, y lo que se hace es diluir el medio viejo con medio nuevo. Y se basa en hacer diluciones entre semana por ejemplo y al final de la semana se hace una centrifugación. Muchas diluciones seguidas dificultaría la difusión de gases debido al elevado volumen de medio. Cambio de medio-> 2-3 veces por semana. El lunes y el viernes seguro para el fin de semana no se trabaja en los laboratorios. ¿Cuándo hacemos un pase? Cuando nos hemos quedado sin espacio y puede que haya inhibición por contacto. ¿Cómo hacemos un pase? Desorganizando la red de proteínas que forman la matriz extracelular y/o proteínas de unión/adhesión.
El volumen que yo cojo de la muestra es independiente del resultado, porque cabe un volumen exact... more El volumen que yo cojo de la muestra es independiente del resultado, porque cabe un volumen exacto en la cámara de Neubauer. Tengo que deshacer la dilución, multiplicando x10000 al final. TÉCNICAS DE RECUENTO CELULAR Determinación del número de células que tenemos en suspensión:-Cámara de recuento celular o hemocitómetro (Búrker, Neubauer): se cuenta al microscopio el número de células en un volumen conocido y así se determina la densidad celular. El volumen de la cámara es fijo. Cabe un volumen concreto. Si cuando analizamos viabilidad le añadimos colorante, tengo que tenerlo en cuenta para deshacer la dilución también.-"Cell Coulter": se usa en labs clínicos. Permite contar y medir el diámetro de las partículas en suspensión. Cuando el recuento es fisiológico y no fisiopatológico, además de hacer el recuento automático, lo hace manual para supervisar los resultados.
Material necesario/imprescindible:-Campana flux laminar-Incubador (controla T y CO2).-Microscopio... more Material necesario/imprescindible:-Campana flux laminar-Incubador (controla T y CO2).-Microscopio invertido Para mantener la asepsia, idealmente se debe trabajar en una sala aislada. Los laboratorios de cultivos se dividen en (diferentes en presión atmosférica):-General: presión positiva cuando se abre la puerta no entrará aire de fuera, al revés, sale. Es mejor que salga que que se me contamine a mí. 15-20mm Hg.-Especifico en patógenos: trabajan con agentes potencialmente peligrosos: presión negativa cuando se abre la puerta entra el aire. Es mejor que entre que no que salga. ¿Cómo se esteriliza la zona de trabajo? Con filtración del aire con los filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters). Retienen el 99.97% de las partículas de 0.22 micrómetros. Están en las camapanas de flujo laminar y en los incubadores. Muchas veces no son solo para la entrada de aire, sino también para la salida, por eso le llamamos que esterilizan el área. Es importante el mantenimiento rutinario e los equipos. Se controlan y cambian periódicamente (anualmente) porque si no al final se obstruyen y no filtran. CAMPANAS Las campanas de flujo laminar quieren reducir el riego de contaminación de la muestra, del trabajador, y del entorno. Es importante ya que hay muchos tipos de campanas, pero no todas cumplen esos 3 requisitos. Se clasifican en:-Horizontal: el aire fluye de forma horizontal. No protege al operador, ya que el aire va hacia él. HORIZONTAL VERTICAL TIPO 1, 2, 3
TEMA 2: La cèl·lula en cultiu: condicions d'incubació, medis i superfícies de creixement Las célu... more TEMA 2: La cèl·lula en cultiu: condicions d'incubació, medis i superfícies de creixement Las células necesitan para crecer:-Sustrato (medio donde adherirse)-Nutrientes (medio de cultivo)-Ambiente (CO, 37ºC, humedad)-Todo eso en condiciones de esterilidad (técnica aseptica, antibióticos y antimicóticos). Los antibióticos los uso en los procesos largos, pero en el momento del experimento real, al final de la línea celular, lo quito ya que me puede hacer variar los resultados. 1. CO2 y O2 Tenemos que controlar sobretodo la concentración de oxigeno y de CO2:-CO2: importa en la regulación del pH celular, junto con el bicarbonato sódico. En función de la cantidad de bicarbonato sódico que tengan nuestras células, sabremos que tiene más o menos CO2. Normalmente usamos un 5% de CO2.-O2: 20 o 95% de oxigeno en cultivos de células o tejidos el rango depende del tipo celular del estudio. En células de mamíferos se pone un 20-21% de oxígeno. Se debe evitar la toxicidad (quelantes de radicales libres) el oxigeno da ambiente oxidante, así que tenemos que neutralizarlo. Teniendo las condiciones de nuestro incubador correctas, tenemos que asegurarnos de que haya una difusión adecuada por órganos y tejidos, no podemos poner un volumen muy grande. Normalmente se habla de que el medio de trabajo debería tener entre 2 y 5 mm de volumen (0.2-0.5 ml/cm2). 2. TEMPERATURA Dependiendo del tipo de célula que yo trabajo, ajusto la temperatura, vemos algunas óptimas:-37ºC homeotermos-38.5ºC aves-15-26ºC poiquilotermos Se permite una variación de medio grado. A pesar de esas ser las optimas, las puedo criopreservar a-196ºC o 4ºC, donde no mueren, solo se para su crecimiento. Cambios de temperatura también influencian en el pH, así que CO2 tiene una solubilidad superior a temperatura más baja GRAN INFLUENCIA EN LA TASA DE CRECIMIENTO Y METABOLISMO DE LAS CÉLULAS.
La técnica de cultivo celular o técnicas asociadas a in vitro, tiene una parte muy protocolaria/c... more La técnica de cultivo celular o técnicas asociadas a in vitro, tiene una parte muy protocolaria/científica, que se tienen que seguir de forma muy estricta (el "como" se sigue de forma muy rigurosa, se necesita ser experto); por otro lado esá la parte más creativa, se puede realizar el tipo de ensayo que tú prefieras, con muchas formas experimentales. La parte creativa es la que le da la gracia a trabajar con células. BREVE HISTORIA El cultivo de células in vitro se hace a últimos del s XIX, cogían embriones y los tenían in vitro. Claude Bernard y Wilhem Roux, ambos embriólogos, vieron que al sacarlo del organismo y ponerle unas condiciones concretas, vieron que el embrión sobrevivía un cierto tiempo, estando fisiológicamente activo: El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX como una continuación de las técnicas de la embriología:-Al 1878, Claude Bernard demostró que el sistema fisiológico de un organismo podía ser mantenido como un sistema vivo después de la muerte del organismo.-En 1885, Wilhem Roux concluyó que el proceso de crecimiento específico, observado en el mantenimiento de una porción de embrión de pollo en solución fisiológica tibia, sucede independientemente de las otras partes del embrión. Fue pionero en la manipulación experimental de las células en desarrollo.-1907: A pesar de ellos, el "padre" es Ross G. Harrisson, trabajaba con células de médula espinal embrionaria de anfibios. el zoólogo estadounidense Ross G. Harrison fue el primer investigador que utilizó técnicas in vitro para al estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios.-Observó el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células-El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada. Usaba técnicas de microbiología, como la de la gota inversa: pone tejido boca abajo y una gota de linfa lo rodeaba. Ese ambiente aislado lo mantenía estéril.
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