REPLICAÇÃO
Modelos para a Replicação do DNA
1. Modelo Semiconservativo:
As moléculas filhas de DNA contém uma das fitas
parentais e uma das fitas recém sintetizadas.
2. Modelo Conservativo:
As fitas parentais transferem a informação para um
intermediário, então o intermediário é copiado. Assim, a hélice
parental é conservada e a hélice filha é completamente nova.
3. Modelo Dispersivo:
A hélice parental é quebrada em fragmentos, separada e
copiada, então duas novas hélices são formadas. O DNA novo
e o velho estão completamente dispersos.
Modelos para a Replicação do DNA
Semiconservativo Conservativo Dispersivo
Molécula Intermediaria
Meselson e Stahl
Replicação Semi-conservativa do DNA
Gradiente de densidade CsCl
Replicação do DNA
Replicação do DNA
1. A fita dupla é separada em duas.
2. A junção das duas fitas abertas é a
forquilha de replicação.
3. A fita nova é feita através de
pareamento com a original.
4. Duas moléculas dupla fita são
resultantes do processo: cada
uma contém uma fita nova
e uma “velha”.
O Processo
Geral de
Replicação
Filamento Ambas servem Duas fitas filhas
original como molde idênticas
Replicação – Uni ou Bi-direcional
Replicação Unidirecional
Origem
Replicação Bidirecional
5’ 3’ Origem
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
Forquilha de
Replicação
Replicação do DNA
• A replicação do DNA é semiconservativa
– Cada fita da forquilha de replicação está sendo
copiada.
• A replicação do DNA é bidirecional
– A replicação Bidirecional envolve duas forquilhas
de replicação, que se movem em direções
opostas.
Replicação do DNA
A síntese do DNA ocorre sempre no sentido 5’ – 3’.
Ambas as fitas são replicadas simultaneamente, então no
sentido 3’ – 5’, são adicionados fragmentos de nucleotídeos
chamados Fragmentos de Okazaki.
ENZIMOLOGIA DA REPLICAÇÃO
Sistema DNA replicase: conjunto de 20 ou mais enzimas e
proteínas envolvidos na replicação.
Nucleases:
Exonucleases: degradam o DNA a partir da ponta,
removendo nucleotídeos das pontas 5’ ou 3’.
Endonucleases: degradam o DNA de qualquer ponto,
reduzindo-o em pequenos fragmentos.
DNA Polimerase I:
Sintetiza o DNA ligando o dNTP ao OH da ponta 3’,
liberando PPi.
A DNA Polimerase necessita:
- Template (molde) para o pareamento de bases.
- Primer (iniciador) para o início da síntese do DNA.
São fragmentos de RNA ligados no ponto de início
da replicação.
Função Exonuclease da DNA Polimerase:
Sentido 3’ – 5’: função revisora da replicação. A
DNA Polimerase remove a base incorreta e adiciona a
base correta.
Sentido 5’ – 3’: função de retirada do primer de
Atividade Revisora da
DNA polimerase I
A DNA Polimerase I tem capacidade de adicionar 600pb/min.
Em E. coli, demoraria 100 minutos para a replicação de todo
genoma, mas este processo leva somente 40 minutos, sugerindo
que existam outras enzimas envolvidas na replicação.
Em E. coli, existem 5 DNA Polimerases:
DNA Polimerase I: síntese de pequenos fragmentos de DNA e
reparo. Remoção dos primers e síntese desses espaços vazios.
DNA Polimerase II, IV e V: reparo do DNA.
DNA Polimerase III: principal enzima da replicação.
DNA Polimerase III
• Rapidez: até 1000 dNTPs adicionados/segundo/enzima
• Alta processividade: >500,000 dNTPs adicionados antes
de se dissociar
• Acurácia: comete 1 erro a cada 10 milhões de dNTPs
adicionados, com a atividade revisora, o erro é de 1 a
cada 10 bilhões de bases.
DNA polimerase III
OUTRAS ENZIMAS
Helicase: separa as fitas de DNA, usando ATP.
Topoisomerase: alivia o stress topológico da separação das
fitas.
Proteínas ligadoras de DNA: estabilizam as fitas separadas.
Primases: sintetizam os primers.
DNA Ligase: faz a ligação fosfodiéster entre fragmentos de
Okazaki e após a exclusão dos primers.
A REPLICAÇÃO
A replicação pode ser separada em 3 estágios:
- Iniciação
- Alongamento
- Término
Iniciação:
Inicia no local do genoma chamado Origem de Replicação,
que é uma região com 3x13pb e 4x9pb superconservadas
para a ligação da proteína DnaA.
1º Passo: 20 DnaA ligam-se nas 4x9pb, desnaturando
o DNA na região dos 3x13pb.
A REPLICAÇÃO
Iniciação:
2º Passo: A proteína DnaB liga-se no DNA desenrolado.
Esta ligação depende da proteína DnaC.
2 hexâmeros de DnaB ligam-se ao DNA, fazendo o
papel de Helicases, desenrolando o DNA em ambas as direções.
3º Passo: Topoisomerase e Proteínas ligadoras de DNA
ligam-se ao DNA para desenrolar e estabilizar as simples fitas.
A REPLICAÇÃO
Alongamento:
Divide-se em 2 operações distintas:
Síntese da fita leading (fita principal)
Síntese da fita lagging (fita de atraso)
Fita Principal:
Inicia com a síntese do primer pela Primase.
RNA com 10 a 60 nucleotídeos.
DNA Polimerase III adiciona nucleotídeos a este primer.
A síntese desta fita continua seguindo o sentido da
forquilha de replicação.
A REPLICAÇÃO
Alongamento:
Fita de Atraso:
Sintetizada pela ligação de fragmentos de Okazaki.
Primase sintetiza o RNA primer e a DNA Polimerase III
liga nucleotídeos a ele.
A síntese da fita principal e da de atraso ocorrem ao
mesmo tempo. Para isso, o DNA faz uma volta para que o
dímero da DNA Pol III trabalhe simultaneamente.
Ligação ao DNA Ligação do substrato
Primase
Alongamento Iniciação
Transferência
A síntese contínua da fita principal
Elongação
procede com o desenrolamento do
DNA pela DnaB Helicase
A síntese do fragmento de
Okazaki se aproxima da
conclusão
Primase liga-se a DnaB,
sintetiza um novo
primer, e dissocia-se
Elongação
A síntese do fragmento de
Okazaki se aproxima da
conclusão
Primase liga-se a DnaB,
sintetiza um novo
primer, e dissocia-se
Um novo grampo é carregado
sobre o novo primer pelo
carregador de grampo
Síntese de um novo
fragmento de Okazaki
é completo na fita
de atraso.
Elongação
Um novo grampo é carregado
sobre o novo templete pelo
carregador de grampo
Síntese de um novo
fragmento de Okazaki
é completo na fita
de atraso.
DNA Pol III da fita de
atraso é transferida
para o novo primer e
seu grampo . O velho
grampo é descartado.
DNA Pol III da fita de
atraso é transferida
para o novo primer e Elongação
seu grampo . O velho
grampo é descartado.
O próximo grampo é
preparado assim que inicia
a síntese do fragmento de
Okazaki.
DNA Ligase
Liga OH-3’ ao P-5’ com gasto
de 1 ATP.
Primer
copiado
do DNA
DNA Pol
sintetiza os
fragmentos
de Okazaki
DNA Pol remove
os primers e
preenche os
espaços
DNA Ligase liga
os fragmentos
A REPLICAÇÃO
Término:
Ocorre numa sequência chamada Ter.
Esta sequência é o sítio de ligação de uma proteína
chamada Tus.
O complexo Tus-Ter consegue prender a forquilha de
replicação em um sentido. A forquilha do sentido oposto para
quando há a colisão.
Este complexo é importante para evitar sobre-replicação.
A enzima Topoisomerase IV separa as novas fitas.
REGULAÇÃO DA REPLICAÇÃO
A iniciação é a única fase que sobre regulação.
2 níveis de regulação:
Metilação do DNA: DNA na sua forma metilada, a origem
de replicação está ligada a membrana, não disponível para
ser replicado. Ordem genética de divisão celular, remove a
metilação para dar início a replicação.
Ativação da DnaA: ligada a ATP (ativa)
ligada a ADP (inativa)
