Preparo de Ágar BHI Usando Micro-ondas e Autoclave

●​ 29,6 g de pó de caldo BHI

●​ 15 g de ágar-ágar
●​ 1 litro de água destilada (ou ajuste proporcionalmente)
●​ Recipiente de vidro grande (compatível com micro-ondas)
●​ Placas de Petri estéreis
●​ Autoclave

Modo de Preparo:
1. Mistura Inicial:
Coloque 29,6 g de BHI e 15 g de ágar-ágar em um recipiente de vidro com 1 litro de água
destilada.
Misture bem até que os componentes estejam bem distribuídos na água.

2. Dissolução no Micro-ondas:
Coloque o recipiente no micro-ondas e aqueça em intervalos de 2-3 minutos, retirando e
mexendo entre cada intervalo.
Continue até que a solução esteja completamente dissolvida e sem grumos, com uma
aparência clara. (Normalmente leva de 8 a 10 minutos no total.)

Atenção: Observe o recipiente enquanto aquece para evitar transbordamentos.

3. Esterilização na Autoclave:
Após a dissolução, transfira o recipiente com a mistura para a autoclave.
Esterilize a 121°C por 15 minutos para garantir que todos os possíveis contaminantes sejam
eliminados.
Deixe a pressão e temperatura da autoclave normalizarem antes de retirar o recipiente para
evitar acidentes.

4. Resfriamento e Vertimento:
Retire o recipiente da autoclave com cuidado, ele estará muito quente.
Deixe esfriar até cerca de 45-50°C, para evitar condensação nas placas.
Em condições estéreis, verta cerca de 20-25 mL da solução em cada placa de Petri.

5. Solidificação e Armazenamento:
Deixe o meio solidificar completamente antes de virar as placas para baixo (com a tampa para
baixo).
Armazene em temperatura de 4°C, dentro de recipientes fechados, para manter a esterilidade
até o uso.
 Esterilização das Folhas de Hortelã

●​ 3 pacotes de hortelã
●​ Álcool 70% (1 minuto)
●​ Hipoclorídrico (2 minutos)
●​ Água destilada (1 minuto)
●​ Pinça
●​ Papel toalha estéril

Passo a Passo:
1. Retire as folhas de hortelã e coloque-as em uma solução de álcool 70% por 1 minuto.
2. Transfira as folhas para hipoclorídrico e deixe por 2 minutos.
3. Lave as folhas em água destilada por 1 minuto.
4. Coloque as folhas em papel toalha estéril e seque-as.
5. (Opcional) Para finalizar, coloque o papel toalha com as folhas sob luz UV por 5 minutos de
cada lado.

Maceração das Folhas

●​ Folhas de hortelã esterilizadas

●​ Gral e pistilo
●​ Salina estéril
●​ 6 barquinhas estéreis
●​ 2 tubos para colocar a maceração

Passo a Passo:
1. Coloque uma quantidade adequada de folhas esterilizadas no gral.
2. Adicione salina estéril e macere bem as folhas.
3. Transfira o extrato macerado para tubos estéreis.

Diluição Serial do Extrato Macerado

●​ Tubo com extrato macerado puro

●​ Salina estéril
●​ Pipetas estéreis
●​ 6 tubos para diluições

Passo a Passo:
1. Pegue 1 mL do caldo macerado puro e adicione a um tubo contendo 9 mL de salina estéril.
Agite bem para fazer uma diluição 1:10.
2. Transfira 1 mL dessa diluição para outro tubo com 9 mL de salina, agite para obter uma
diluição 1:100.
3. Repita o processo mais uma vez para obter uma diluição de 1:1000.
 Isolamento em Placas de Cultivo

●​ Tubo com extrato macerado puro e diluições (1:10, 1:100, 1:1000)

●​ Ágar BHI
●​ Ágar Sabouraud
●​ Placas de Petri com ágar BHI e Sabouraud (12 placas)
●​ Alça bacteriológica de 1 μL
●​ Alça de Drigalski
●​ Pipetas estéreis

Passo a Passo:
1. Pegue uma alça bacteriológica e mergulhe no tubo com o extrato puro.
2. Espalhe a alça por três placas de ágar BHI, usando o método quantitativo.
3. Repita para cada uma das diluições (1:10, 1:100 e 1:1000), também espalhando por três
placas de cada diluição.
4. Esse processo pode ser feito também usando a alça de Drigalski. Pegue um licota de cada
líquido (puro, 1:10, 1:100, 1:1000) e espalhe pela placa toda.
5. Repita o mesmo processo utilizando as placas de ágar Sabouraud para isolar fungos.

★​ Certifique-se de trabalhar próximo ao fogo ou em condições estéreis para evitar

contaminação.
★​ Numere corretamente os tubos e placas para facilitar a identificação posterior.
★​ Coloque as placas na estufa para incubação conforme o tipo de meio utilizado e os
microrganismos esperados.
 Preparação da Lâmina para Microscopia
●​ Colônia bacteriana (de uma placa de cultivo)
●​ Lâminas de microscopia estéreis
●​ Solução de salina estéril
●​ Alça bacteriológica ou loop
●​ Pinça
●​ Bico de Bunsen (para esterilização)
●​ Papel absorvente estéril

Passo a Passo:
1. Esterilize a alça bacteriológica no fogo até ficar incandescente e deixe esfriar.
2. Com a alça esterilizada, retire uma pequena porção da colônia bacteriana da placa de cultivo.
3. Coloque uma gota de salina estéril no centro da lâmina de microscopia.
4. Misture a colônia com a gota de salina usando a alça, formando uma suspensão uniforme.
5. Deixe a lâmina secar ao ar.
6. Após secar, passe rapidamente a lâmina pelo fogo do bico de Bunsen 2-3 vezes para fixar a amostra
(fixação térmica).

Coloração Gram
●​ Violeta de cristal
●​ Lugol (mordente)
●​ Álcool-acetona (descolorante)
●​ Fucsina básica (ou safranina)
●​ Água destilada
●​ Pipeta estéril
●​ Bico de Bunsen

Passo a Passo:
1. Violeta de Cristal:
Cubra a lâmina com violeta de cristal por 1 minuto.
Enxágue suavemente com água destilada.

2. Lugol:
Aplique lugol e deixe por 1 minuto (atua como mordente para fixar o corante primário).
Enxágue com água destilada.

3. Descoloração:
Aplique álcool-acetona por 10-15 segundos (não ultrapasse esse tempo para evitar super-descoloração).
Enxágue rapidamente com água destilada.

4. Contracoloração:
Aplique fucsina básica (ou safranina) e deixe por 1 minuto.
Enxágue com água destilada e deixe secar ao ar.

Resultado Esperado:
★​ Gram-positivas: Células coradas de roxo.
★​ Gram-negativas: Células coradas de rosa/vermelho.
 Ajuste do Microscópio para Observação
●​ Microscópio com objetiva de imersão (100x)
●​ Óleo de imersão

Passo a Passo:
1. Preparação da Lâmina:
Coloque a lâmina colorida e seca na platina do microscópio.
Adicione uma gota de óleo de imersão diretamente sobre a amostra.

2. Ajuste do Microscópio:
Comece com uma objetiva de menor aumento (4x ou 10x) para localizar a amostra.
Ajuste o foco grosseiro até visualizar a amostra.
Troque para a objetiva de 100x (imersão) e gire a lente suavemente até que o óleo toque a objetiva.
Use o ajuste fino para focalizar a imagem.

3. Iluminação e Observação:
Ajuste a intensidade da luz e o diafragma para obter um contraste adequado.
Observe as características morfológicas das bactérias (forma, agrupamento e cor).

Análise e Identificação
Formas Comuns de Bactérias:
➔​ Cocos: Redondos, podem estar em cadeias (estreptococos), cachos (estafilococos) ou
diplococos.
➔​ Bacilos: Alongados/retangulares, podem ser isolados ou em cadeias.
➔​ Espirilos: Em formato espiralado, mais curvos e alongados.

Interpretação das Colorações:

➔​ Gram-positivas (roxo): Possuem parede celular espessa de peptidoglicano.
➔​ Gram-negativas (rosa/vermelho): Parede celular mais fina e presença de uma membrana
externa.
 Preparo de Meio BHI e Inoculação Bacteriana
●​ 29,6 g de caldo BHI (Brain Heart Infusion)
●​ 800 mL de água destilada
●​ Erlenmeyer grande e pequenos (um para cada amostra bacteriana)
●​ Agulha ou alça bacteriológica
●​ Fogo para ambiente estéril
●​ Estufa de cultivo
●​ Autoclave

1. Preparo do Meio BHI:

Meça 800 mL de água destilada e adicione em um Erlenmeyer grande.
Adicione 29,6 g de caldo BHI à água.
Misture bem até o caldo dissolver completamente.

2. Esterilização:
Transfira o meio preparado para um autoclave e esterilize-o conforme as instruções padrão
(geralmente 121°C por 15 minutos).

3. Distribuição do Meio:
Após autoclavar e resfriar, distribua 100 mL do meio BHI esterilizado em Erlenmeyers menores.

4. Inoculação das Bactérias:

Com todos os materiais perto do fogo para manter um ambiente estéril, utilize uma agulha ou
alça bacteriológica para inocular as bactérias no meio BHI dos Erlenmeyers pequenos.
Enumere cada Erlenmeyer de acordo com o respectivo número dos tubos de bactéria para
identificação.

5. Incubação:
Coloque os Erlenmeyers numerados na estufa para incubação, seguindo a temperatura e
tempo apropriados para o crescimento das bactérias.
 Testes bioquímicos

Teste de Catalase
Propósito:
Determinar se a bactéria possui a enzima catalase, que quebra o peróxido de hidrogênio (H₂O₂)
em água e oxigênio.
Usado para diferenciar bactérias aeróbicas/anaeróbicas facultativas (geralmente
catalase-positivas) de anaeróbicas estritas (geralmente catalase-negativas).

Procedimento:
1. Coloque uma pequena amostra da colônia bacteriana em uma lâmina.
2. Adicione uma gota de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) a 3%.
3. Observe a reação imediata.

Interpretação:
Positivo: Formação de bolhas, indicando que a catalase está presente (ex: Staphylococcus).
Negativo: Sem bolhas, indicando ausência de catalase (ex: Streptococcus).

Teste de Oxidase
Propósito:
Identificar a presença da enzima citocromo oxidase, importante na cadeia de transporte de
elétrons.
Usado para distinguir entre certas bactérias Gram-negativas (ex: Pseudomonas é
oxidase-positiva, enquanto Enterobacteriaceae é oxidase-negativa).

Procedimento:
1. Coloque uma amostra da colônia em um papel de filtro impregnado com reagente de oxidase
(geralmente tetrametil-p-fenilenodiamina).
2. Observe a mudança de cor dentro de 10-30 segundos.

Interpretação:
Positivo: Coloração azul ou roxa, indicando a presença de oxidase.
Negativo: Sem mudança de cor.

Teste de Fermentação de Carboidratos (Caldo de Açúcar)

Propósito:
Determinar se a bactéria pode fermentar um determinado açúcar e produzir ácido e/ou gás.
Útil para diferenciar espécies de bactérias baseadas em seus perfis de fermentação.

Procedimento:
1. Inocule o caldo contendo o açúcar específico (ex: glicose, lactose, sacarose) e um indicador
de pH (geralmente vermelho de fenol).
2. Incube a 37°C por 24-48 horas.
3. Observe a mudança de cor e/ou produção de bolhas (gás).
Interpretação:
Ácido Positivo: Cor amarela (indicando produção de ácido).
Gás Positivo: Bolhas no tubo de Durham (indicando produção de gás).
Negativo: Cor permanece vermelha, sem produção de gás.

Teste de Indol (Parte do SIM - Sulfeto, Indol, Motilidade)

Propósito:
Detectar a capacidade de uma bactéria de quebrar o aminoácido triptofano em indol.
Útil para diferenciar espécies de Enterobacteriaceae.

Procedimento:
1. Inocule o meio SIM (Sulphide, Indole, Motility) e incube a 37°C por 24-48 horas.
2. Adicione algumas gotas de reagente de Kovac no tubo.
3. Observe a camada superior do meio para mudança de cor.

Interpretação:
Positivo: Camada vermelha na superfície, indicando presença de indol (ex: E. coli).
Negativo: Sem mudança de cor (ex: Klebsiella).

Teste de Voges-Proskauer (VP)

Propósito:
Detectar a fermentação de glicose com produção de acetoína, um produto intermediário.
Ajuda a distinguir entre diferentes tipos de Enterobacteriaceae.

Procedimento:
1. Inocule o caldo VP e incube a 37°C por 24-48 horas.
2. Adicione reagentes VP (alfa-naftol e solução de KOH).
3. Observe a mudança de cor após 15-30 minutos.

Interpretação:
Positivo: Coloração rosa/vermelha, indicando a presença de acetoína (ex: Enterobacter).
Negativo: Sem mudança de cor (ex: E. coli).

Teste de Citrato (Meio de Simmons Citrate)

Propósito:
Verificar se a bactéria pode usar citrato como única fonte de carbono.
Útil para distinguir entre Enterobacteriaceae.

Procedimento:
1. Inocule uma amostra no meio de citrato de Simmons.
2. Incube a 37°C por 24-48 horas.
3. Observe a mudança de cor no meio.

Interpretação:
Positivo: Mudança de cor para azul, indicando uso de citrato (ex: Enterobacter, Klebsiella).
Negativo: Cor permanece verde, indicando que a bactéria não utiliza citrato (ex: E. coli).

Teste de Hidrocloreto de Ureia (Urease)

Propósito:
Determinar se a bactéria possui urease, que hidrolisa a ureia em amônia e dióxido de carbono.
Comumente usado para identificar Proteus.

Procedimento:
1. Inocule uma amostra no caldo de ureia.
2. Incube a 37°C por 24-48 horas.
3. Observe a mudança de cor.

Interpretação:
Positivo: Cor rosa/roxa, indicando produção de amônia e presença de urease.
Negativo: Sem mudança de cor (amarelo/pálido).

Teste TSI (Triple Sugar Iron)

Propósito:
Detectar a fermentação de glicose, lactose e sacarose, produção de gás e sulfeto de hidrogênio
(H₂S).
Útil para diferenciar enterobactérias.

Procedimento:
1. Inocule o meio inclinando e furando o ágar com o inóculo.
2. Incube a 37°C por 24-48 horas.
3. Observe mudanças de cor e formação de bolhas/negro (H₂S).

Interpretação:
Amarelo no fundo e na inclinação: Fermentação de glicose e/ou lactose/sacarose.
Amarelo no fundo e vermelho na inclinação: Apenas glicose fermentada.
Bolhas ou rachaduras: Produção de gás.
Preto: Produção de sulfeto de hidrogênio.
 Extração de Microrganismos Endofíticos a Partir de Caldo de Cana
●​ Caldo de cana-de-açúcar (preferencialmente fresco e comprado diretamente dos
comerciantes)
●​ Tubos Falcon estéreis (50 mL)
●​ Centrífuga de bancada
●​ Papel filtro estéril ou gaze estéril
●​ Pipetas e ponteiras estéreis
●​ Placas de Petri com meio de cultura apropriado (Ágar nutriente, Ágar Sabouraud, etc.)
●​ Antibióticos (ex.: Cloranfenicol, Ampicilina, Gentamicina, Tetraciclina)
●​ Solução estéril de antibióticos
●​ Estufa de incubação (regulável entre 25°C e 30°C)
●​ Capela de fluxo laminar (opcional, mas recomendado)
●​ Autoclave
●​ Bico de Bunsen ou lamparina a álcool
●​ Álcool 70%

Solução de antibiótico estéril: prepare a solução conforme as concentrações sugeridas (ex.:

Cloranfenicol 10-20 µg/mL, Ampicilina 50-100 µg/mL, etc.).
Álcool 70% para desinfecção do ambiente e materiais

4.1 Coleta do Caldo de Cana

1. Compra do Caldo:
Adquira o caldo de cana diretamente de comerciantes e peça para que seja servido em um
recipiente estéril. Se possível, transfira o caldo para tubos Falcon estéreis imediatamente após
a coleta para reduzir o risco de contaminação.
Mantenha o caldo em uma caixa térmica limpa e esterilizada até chegar ao laboratório.

4.2 Preparação do Caldo para Extração

1. Pré-filtragem (Opcional):
Passe o caldo por papel filtro ou gaze estéril para remover partículas grandes. Realize essa
etapa sob uma capela de fluxo laminar para reduzir a contaminação.

2. Centrifugação:
Centrifugue o caldo em tubos Falcon a 3.000 rpm por 10 minutos.
Separe o sobrenadante para as próximas etapas e descarte o pellet (se necessário).

3. Tratamento com Antibióticos:

Adicione uma solução de antibiótico previamente preparada no caldo de cana. Use as
seguintes concentrações como referência:
●​ Cloranfenicol: 10-20 µg/mL
●​ Ampicilina: 50-100 µg/mL
●​ Gentamicina: 10-50 µg/mL
●​ Tetraciclina: 10-30 µg/mL
Misture bem e deixe agir por 10-30 minutos.
1. Incubação:
Transfira o caldo para recipientes estéreis e coloque-os na estufa.
Incube o caldo de cana em uma estufa regulada conforme o tipo de microrganismo desejado:
Bactérias: 28-30°C por 24 a 72 horas
Fungos: 25-28°C por 3 a 7 dias

1. Inoculação em Placas de Petri:

Após a incubação, transfira 100 µL do caldo para placas de Petri contendo meio de cultura
seletivo.
Espalhe o líquido usando uma alça de inoculação esterilizada e incube as placas de acordo
com o tipo de microrganismo:
Bactérias: 28-30°C por 24-48 horas
Fungos: 25-28°C por 3-5 dias

2. Controle de Contaminação:
Prepare placas de controle negativo (água estéril) para verificar possíveis contaminações.
Anote o crescimento observado e proceda com coloração de Gram ou outras técnicas para
identificação.

5. Controle de Qualidade
Certifique-se de que todos os equipamentos estejam esterilizados antes do uso.
Realize o procedimento sob condições assépticas para minimizar a contaminação externa.
Utilize controles positivos e negativos para garantir a precisão dos resultados.

6. Segurança e Descarte
Desinfete todas as superfícies e materiais antes e após o experimento.
Descarte os resíduos biológicos em recipientes apropriados e autoclavados antes do descarte
final.
Utilize equipamentos de proteção individual (EPI) como jaleco, luvas e óculos de segurança
durante o procedimento.

Esse POP oferece um procedimento estruturado para extração e isolamento de endofíticos a

partir do caldo de cana. Adapte conforme necessário, especialmente se você identificar tipos
específicos de microrganismos que deseja selecionar.