PCR
Detecção de Leishmania infantum com Primers RV1RV2 e GAPDH
Nome: Vitória de Freitas da Silva
1. Protocolo
2. MIX
3. NANODROP
4. EXTRAÇÃO (Adicionar o DNA ao mix)
5. Termociclador (Pasta RV1RV2)
6. Gel de Agarose
1. Objetivo
Detectar Leishmania infantum por PCR utilizando primers RV1RV2 (gênero
Leishmania) e GAPDH(controle interno - gene endógeno), desde a quantificação do
DNA até a análise em gel de agarose. O protocolo garante biossegurança e previne
contaminações cruzadas entre ambientes.
2. Quantificação do DNA – Nanodrop
Local: Parasitologia
● Leitura (absorbância):
○ 260 nanômetros: Absorbância de DNA e RNA (sem distorção)
○ 280 nm: Absorbância de proteínas
○ 230 nm: Solventes orgânicos
● A partir de 1,8 a razão 260/280 é considerada pura, sendo entre 1,8 e 2,0 a
melhor relação de pureza. (1,8 ul indica mais DNA do que proteínas)
○ 100% de DNA e 0% de proteínas = 1,8
○ 75% de DNA e 25% de proteínas = 1,4
● Razão 260/230 - Relação que demonstra a quantidade de solventes
orgânicos presentes na amostra.
○ Valores menores = Maior contaminação
● O nanômetro não distingue DNA de RNA.
● A sensibilidade é limitada, principalmente com amostras com alta
concentração ou abaixo de 2ng.
Procedimento:
1. Sempre ligar ele sem o papel entre os leitores.
2. Escolher um alvo.
3. Usar de 1 a 2 µL, mas preferencialmente 1. NÃO FAZER BOLHAS!
4. Começar com o branco, que deve ser usado tampão de eluição.
⚠️
5. Quando aparece o símbolo “ ” ao lado da amostra, é porque teve
contaminação.
6. Clicar no símbolo ‘’i’’ e ver o valor corrigido.
Limpeza:
7. Limpar entre medições com lenço de papel.
8. Ao finalizar, colocar 3 µL de água e aguardar 3 minutos (COM ELE
FECHADO!). Depois é só secar e desligar no botão de trás.
9. Para salvar, basta encerrar o experimento, nomear e mandar para a nuvem.
Também pode deixar salvo no próprio equipamento.
3. Diluição do DNA (se necessário)
Local: Sala de Extração
Para controle positivo (L. infantum):
1. Misturar 10 µL de DNA com 90 µL de água livre de nucleases (proporção
1/10).
- Diluição 1/10: corresponde à proporção de 1ng/ul de soluto (amostra)
para 9ul de água. Pode ser feito em outros volumes, ex.: volume final
20ul - diluição: 2ul de amostra + 18 ul de água.
- A água utilizada é sempre a destinada para biologia molecular
(DNA/RNA free)
2. Homogeneizar suavemente em vórtex ou com a pipeta (em primeiro estágio).
3. Identificar como “L. infantum 1/10”.
4. Preparo do Master Mix (RV1RV2 e GPDAH)
Local: Sala de Mix PCR (EPI trocado)
● Realizar o mix total inicialmente em um tubo de 1,5 ou 2 ml (grandão) para
depois distribuir 20ul do mix para os tubos de 0,2 ml, onde já será colocada a
água do mix no CN da água (controle negativo).
● Composição por reação (base 6 reações com tubos de 0,2 ml (200 µL -
Pequeno)):
Componente Volume total (6x) Volume por reação
Mix dNTP 11 µL 2,2 µL
Magnésio 6,5 µL 1,3 µL
Tampão 10X 11 µL 2,2 µL
Taq Polimerase 1 µL 0,2 µL
Primer 1 4,5 µL 0,9 µL
Primer 2 4,5 µL 0,9 µL
Água 61,5 µL 12,3 µL
Total 100 µL 20 µL
Observação:
● Preparar dois mixes distintos, um para RV1RV2 e outro para GAPDH.
● Homogeneizar e aliquotar 20 µL em tubos de PCR estéreis (0,2 ml (200 ul -
super pequeno; Igual o de LAMP))
● Mixar tudo.
● Nunca levar a estante de um lugar para outro.
5. Adição do DNA
Local: Iniciar na Sala de Extração → Transição controlada para Sala Limpa
Procedimento:
1. Adicione 5 µL de DNA em cada tubo contendo Master Mix para os animais,
CP com [Link] 1/10 e CN de cão. A adição do CN de água já foi
realizada no mix.
2. Controles:
○ Controle negativo (CN - Branco): Água livre de nucleases
○ Controle negativo cão (CN de cão): DNA de cão não infectado
○ Controle positivo (CP): L. infantum 1/10
3. Fechar tubos e mixar com pipeta.
6. Amplificação no Termociclador
Local: Sala de Gel
Programa de Ciclagem:
● Iniciar reação com tubos fechados no termociclador.
● Programas específicos:
○ RV1RV2: Amplificação de Leishmania spp. – Banda esperada: 145 pb
○ GAPDH: Amplificação controle interno – Banda esperada: específica
para mamíferos.
● Deixar o termociclador rodando durante o dia todo e realizar o gel no dia
seguinte.
7. Eletroforese em Gel de Agarose 2%
Local: Sala de Gel (Pós-PCR)
Preparo do Gel:
1. Retirar as amostras do termociclador e desligar o aparelho
2. Pesar 2g de agarose ultrapura
3. Transferir 100 ml de TBE 1x para uma proveta
a. Como fazer: Adicionar na proveta 90ml de água destilada + 10 ml de
TBE 10x
4. Em um erlenmeyer, transferir primeiro a agarose e depois o TBE 1x
5. Colocar no microondas por 1 min e 30 seg. A cada 30 seg, pausar e mexer.
a. Utilizar bico de pato para evitar queimaduras
b. Realizar o processo até a agarose diluir
6. Adicionar 3 µL de gel red (primeira gaveta do gaveteiro)
7. Com o gel ainda quente, despejar na forma e incluir os pentes desejados
8. Esperar esfriar e secar completamente (por 30 min)
9. Quando estiver pronto, retirar a forma externa e colocar o gel na cuba
apoiado na forma interna transparente e retirar os pentes
10.Adicionar TBE 1x PARA CUBA até o limite indicado, deixando o gel submerso
Preparando a amostra:
1. Cortar um pequeno pedaço de parafina
2. Retirar da geladeira o corante azul e peso molecular 100pb, que estão na
caixa nomeada “Peso Molecular”
3. Pipetar 3µL de corante azul e colocar na parafina. Irá formar uma pequena
bolha azul. Repetir esse processo, fazendo “bolinhas” proporcionalmente ao
número de amostras utilizadas, sempre contando com 1 “bolinha” para peso
molecular
4. Adicionar 5µL de amostra na “bolinha”. Cada amostra é homogenizada com 1
“bolinha” individual
5. Transferir os 8µL (5µL de amostra + 3µL de corante) resultantes para um
poço no burraco feito pelo pente do gel
6. Passagem da corrente elétrica é através da polaridade eles atravessam o gel
a. O peso molecular é para saber onde fica cada marca. Por isso, ligar os
eletrodos (ânodo [+] e cátodo [-]) à fonte de energia.
7. Aplicação da voltagem ligando a corrente em 127v por 100 minutos
Como funciona:
● Visualização do DNA: Utilizar luz UV ao azul para visualizar as bandas de
DNA. Um ‘’ladder” de DNA com tamanhos conhecidos é usado para estimar o
tamanho dos fragmentos da amostra
● Se a amostra for negativa não aparece nada no gel de agarose
● Utilizar um tamanho de pente que faça poços a mais que o que necessário
● Usar pente com poços menores para correr melhor o gel
8. Interpretação dos Resultados
Amostra RV1RV2 (145 pb) GAPDH Interpretação
L. infantum 1/10 ✔ Positivo ✔ Positivo PCR válido
Controle negativo ✘ Negativo ✘ Negativo Sem
contaminação
Controle de água ✘ Negativo ✘ Negativo Reagentes
íntegros
Ações Corretivas:
● Falta de banda no controle positivo: Verificar qualidade do DNA, reagentes e
parâmetros do termociclador.
● Presença de banda no controle negativo: Suspeita de contaminação →
Repetir a extração com novos reagentes.
9. Fluxo de Trabalho e Biossegurança
Ambiente Atividades Permitidas Restrições
Sala de Extração Quantificação, diluição e Proibido retornar
adição de DNA ao mix materiais após saída
Sala de Mix PCR Preparo do Master Mix Proibido abrir tubos ou
manusear DNA
Sala de Gel Abrir tubos, carregar e Proibido retornar qualquer
visualizar gel material às salas
anteriores
● OBS.: Materiais usados em pós-PCR NÃO retornam para as outras salas.
10. Justificativa para Reações Separadas (RV1RV2 e GAPDH)
● Temperaturas ideais diferentes para cada par de primers.
● Evita competição por reagentes (ex: Taq, dNTPs).
● Minimiza formação de dímeros de primer e falsos negativos.
● Permite controle de qualidade individual por marcador (sensibilidade e
especificidade).
