Crescimento microbiano
Professora Dra Hellen Kempfer Philippsen
Fatores necessários para o crescimento
• Fatores físicos:
- Temperatura;
- pH;
- Pressão osmótica.
- Rotação/agitação
• Fatores químicos:
-carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio;
-Fatores de crescimento orgânicos (vitaminas, aminoácidos...).
Fatores físicos de crescimento
• temperatura
Fatores físicos de crescimento
• Pressão osmótica
Fatores físicos de crescimento
• Halófitos extremos se adaptaram tão bem às altas concentrações de
sais, que eles, de fato, necessitam dos sais para o seu crescimento.
Nesse caso, eles podem ser chamados de halófilos obrigatórios.
• Os halófilos facultativos são mais comuns e não requerem altas
concentrações de sais, mas são capazes de crescerem em
concentrações salinas de até 2%.
Fatores químicos: Nitrogênio, enxofre e fósforo
• A síntese de proteínas requer quantidades consideráveis de
nitrogênio e enxofre. A síntese de DNA e RNA também requer
nitrogênio e algum fósforo, assim como para a síntese de ATP, a
molécula responsável pelo armazenamento e pela transferência de
energia dentro da célula. O nitrogênio constitui cerca de 14% do peso
seco da célula bacteriana, e o enxofre e o fósforo juntos constituem
aproximadamente 4%.
Fatores químicos: oxigênio
• aeróbios obrigatórios: e precisam do oxigênio para viver;
• anaeróbios facultativos: microrganismos que têm a capacidade de
continuar a crescer na ausência do oxigênio; podem utilizar o oxigênio
quando ele está presente, mas são capazes de continuar a crescer
utilizando a fermentação ou a respiração anaeróbia quando o oxigênio não
está disponível.
• anaeróbios obrigatórios: são bactérias incapazes de utilizar o oxigênio
molecular nas reações de produção de energia.
• anaeróbios aerotolerantes : não podem utilizar o oxigênio para o seu
crescimento, porém toleram bem a sua presença
• Microaerófilos: Crescimento somente aeróbio; oxigênio requerido em
baixa concentração
Biofilmes
Na natureza, os
microrganismos
raramente vivem em
colônias isoladas de uma
única espécie, como
vemos em placas de
cultura no laboratório.
Eles normalmente vivem
em comunidades
chamadas de biofilmes,
os quais são uma camada
fina e viscosa envolvendo
bactérias que se aderem
a uma superfície.
• Um biofilme também pode ser considerado um hidrogel, polímero
complexo contendo muitas vezes o seu peso seco em água. Uma
comunicação química entre as células, ou quorum sensing, permite às
bactérias coordenarem sua atividade e se agruparem em
comunidades que fornecem benefícios não muito diferentes daqueles
de organismos multicelulares.
• Portanto, os biofilmes não são somente camadas limosas bacterianas,
mas sistemas biológicos; as bactérias são organizadas em uma
comunidade funcional coordenada. Os biofilmes geralmente são
fixados em superfícies, como uma pedra em um lago, um dente
humano ou uma membrana mucosa.
Microrganismos em um biofilme
provavelmente são 1.000 vezes mais
resistentes aos microbicidas
Fatores necessários para o crescimento:
fatores orgânicos
• Os compostos orgânicos essenciais incapazes de serem sintetizados
por um organismo são conhecidos como fatores de crescimento
orgânico; eles precisam ser obtidos diretamente do ambiente. Ex:
certas vitaminas e certos aminoácidos.
Meio de cultura
• O material nutriente preparado para o crescimento de
microrganismos em laboratório é chamado de meio de cultura.
• Os microrganismos que são introduzidos em um meio de cultura para
dar início ao crescimento são chamados de inóculo.
• Os micróbios que crescem e se multiplicam no interior ou sobre um
meio de cultura são chamados de cultura.
Quais critérios o meio de cultura deve
preencher?
• conter os nutrientes adequados para o microrganismo específico que
queremos cultivar.
• conter também uma quantidade de água suficiente, pH apropriado e
um nível conveniente de oxigênio, ou talvez nenhum.
• O meio deve ser estéril – isto é, inicialmente não deve conter
microrganismos vivos – dessa forma, a cultura conterá apenas os
microrganismos (e sua descendência) que foram introduzidos.
• a cultura em crescimento deve ser incubada em temperatura
apropriada.
Quando se deseja o crescimento das bactérias em meio sólido, um agente solidificante,
como o ágar, é adicionado ao meio. O ágar, polissacarídeo complexo derivado de uma
alga marinha, tem sido muito utilizado como espessante em alimentos, como gelatinas e
sorvetes
Propriedades do ágar:
• Poucos microrganismos podem
degradar o ágar, o que permite
que ele permaneça sólido.
• O ágar se liquefaz a cerca de
100°C (o ponto de ebulição da
água).
• Ao nível do mar ele permanece
líquido até a temperatura
diminuir até cerca de 40°C.
• Os meios com ágar geralmente
são contidos em tubos de ensaio
ou placas de Petri.
• As placas de Petri, assim
denominadas em homenagem
ao seu inventor, são placas rasas
com uma tampa que as recobre
até o fundo, a fim de evitar
contaminações; quando
preenchidas, são chamadas de
placas (ou culturas) de Petri.
• Os tubos de ensaio são chamados de meios inclinados quando a solidificação é
feita com o tubo inclinado em um ângulo de modo que uma grande área de
superfície esteja disponível para o crescimento
• Quando o ágar é solidificado em
um tubo mantido na vertical, ele
é chamado de meio profundo
Meio quimicamente definido
• um meio deve fornecer uma fonte de energia, assim como fontes de
carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e quaisquer outros fatores
orgânicos de crescimento que o organismo seja incapaz de sintetizar.
• Um meio quimicamente definido é aquele cuja composição exata é
conhecida.
• Os organismos que requerem muitos fatores de crescimento são
descritos como fastidiosos.
Meio complexo
• Os meios quimicamente definidos geralmente são reservados para
trabalhos experimentais em laboratório ou para o crescimento de
bactérias autotróficas.
• A maioria das bactérias e dos fungos, como aqueles analisados em
um curso de laboratório introdutório, é cultivada rotineiramente em
meios complexos feitos de nutrientes, como extratos de leveduras,
de carnes ou de plantas, ou de produtos de digestão de proteínas
destas ou de outras fontes.
• Nos meios complexos, as necessidades de energia, carbono,
nitrogênio e enxofre dos microrganismos em cultura são fornecidas
essencialmente pelas proteínas.
• As proteínas são moléculas grandes, insolúveis, que apenas uma
minoria de microrganismos pode utilizar diretamente. A digestão
parcial por ácidos ou enzimas reduz as proteínas a cadeias curtas de
aminoácidos, chamadas de peptonas.
• As peptonas são fragmentos pequenos e solúveis podem ser
digeridos pela maioria das bactérias.
• Vitaminas e outros fatores orgânicos de crescimento são fornecidos
pelos extratos de carne ou de levedura. As vitaminas solúveis e os
minerais das carnes ou das leveduras são dissolvidos na água de
extração, que é, então, evaporada para concentrar esses fatores.
• Os extratos de leveduras são particularmente ricos em vitaminas do
complexo B.
• Se um meio complexo se encontra na forma líquida, é chamado de
caldo nutriente. Quando ágar é adicionado, é chamado de ágar
nutriente. (Essa terminologia pode ser confusa. Deve-se ressaltar que
somente o ágar em si não é um nutriente.)
Meios e métodos para o crescimento
anaeróbio
Utilização de câmara anaeróbia;
A câmara é preenchida com gases inertes
(geralmente cerca de 85% de N2, 10% de H2 e
5% de CO2) e é equipada com sistemas de
transferência para a introdução das culturas e
dos materiais.
Meios e métodos para o crescimento
anaeróbio
• Em um sistema desenvolvido recentemente, cada placa de Petri
(OxyPlate) individual se transforma em uma câmara anaeróbia. O
meio na placa contém uma enzima, a oxirase, que combina o oxigênio
com o hidrogênio, removendo o oxigênio à medida que água é
formada.
• sci hub
Meios e métodos para o crescimento
anaeróbio
• Os laboratórios que trabalham com
relativamente poucas placas de cultura de uma
só vez podem utilizar sistemas de incubação
dos microrganismos em caixas e jarras seladas,
nas quais o oxigênio é quimicamente removido
após as placas de cultura serem introduzidas e
o recipiente selado. O envelope contendo as
substâncias químicas (o ingrediente ativo é o
ácido ascórbico) é aberto para expor o
conteúdo ao oxigênio presente na atmosfera
do recipiente. Em geral, a atmosfera nas jarras
tem menos de 5% de oxigênio, cerca de 18% de
CO2 e nenhum hidrogênio.
Técnicas especiais de cultura
• Mycobacterium leprae, o bacilo da hanseníase, hoje geralmente é
multiplicado em tatus, pois eles têm uma temperatura corporal
relativamente baixa, que atende às necessidades do microrganismo.
• Com poucas exceções, as bactérias intracelulares obrigatórias, como
riquétsias e clamídias, não crescem em meios artificiais. Como os
vírus, elas apenas podem se reproduzir em célula hospedeira viva
Técnicas especiais de cultura
• Muitos laboratórios clínicos têm estufas de dióxido de carbono especiais
para o crescimento de bactérias aeróbias que requerem concentrações de
CO2 mais altas ou mais baixas que a encontrada na atmosfera.
• Níveis de CO2 elevados também são obtidos com uma simples jarra com
vela. As culturas são colocadas em uma jarra grande, selada, contendo uma
vela acesa, que consome o oxigênio. A vela apaga quando o ar da jarra
apresenta uma concentração de oxigênio reduzida (cerca de 17% de O2
ainda são adequados ao crescimento de bactérias aeróbias).
• Os micróbios que apresentam um melhor crescimento em altas
concentrações de CO2 são chamados de capnofílicos.
• Pacotes plásticos, às vezes, são desenvolvidos especialmente para
fornecer concentrações definidas de dióxido de carbono (em geral
maiores que as obtidas em uma jarra de vela) e de oxigênio para o
cultivo de organismos, como a bactéria microaerofílica Campylobacter
Níveis de segurança
• Um laboratório de aula de microbiologia básica pode ser BSL-1. Os
organismos que apresentam risco moderado de infecção podem ser
manuseados em BSL-2, ou seja, em bancadas abertas de laboratório
com luvas apropriadas, avental de laboratório e, se necessário,
proteção para o rosto e os olhos. Os laboratórios BSL-3 são
destinados aos patógenos do ar altamente infecciosos, como o
agente da tuberculose. Gabinetes de segurança biológica com
aparência similar a de uma câmara anaeróbia. O laboratório em si
deve ter pressão negativa e ser equipado com filtros de ar para evitar
a liberação do patógeno.
Meios de cultivo seletivo e diferencial
• Servem para detectar microrganismos específicos.
• Para essa tarefa, meios seletivos e diferenciais são utilizados.
• Meios seletivos: O ágar Sabouraud dextrose, com pH de 5,6, é
utilizado para isolar os fungos que superam a maioria das bactérias
neste pH.
Meios seletivos
• Os meios seletivos são elaborados para impedir o crescimento de
bactérias indesejadas e favorecer o crescimento dos microrganismos
de interesse.
• Ex: o ágar sulfito de bismuto é um meio utilizado para o isolamento
da bactéria da febre tifoide, a gram-negativa Salmonella typhi, a partir
das fezes
• Ex: O ágar Sabouraud dextrose, com pH de 5,6, é utilizado para isolar
os fungos que superam a maioria das bactérias neste pH.
Meios diferenciais
• facilitam a diferenciação das colônias de um microrganismo desejado
em relação a outras colônias crescendo na mesma placa.
• O ágar-sangue (que contém hemácias) é um meio utilizado com
frequência pelos microbiologistas para identificar espécies
bacterianas que destroem hemácias. Estas espécies, como o
Streptococcus pyogenes, a bactéria que causa a faringite
estreptocócica, apresentam um anel claro ao redor de suas colônias,
na região onde elas lisaram as hemácias circundantes.
• Algumas vezes, as características
seletivas e diferenciais são combinadas
no mesmo meio. Imagine que
queiramos isolar a bactéria
Staphylococcus aureus, encontrada
comumente nas fossas nasais. Esse
organismo é tolerante a altas
concentrações de cloreto de sódio; ele
também pode fermentar o carboidrato
manitol para formar ácido. O ágar
hipertônico manitol contém 7,5% de
cloreto de sódio, o que impede o
crescimento de organismos
competidores e, portanto, seleciona
(favorece o crescimento de) S. aureus.
Esse meio hipertônico contém um
indicador de pH que altera a sua cor se
o manitol do meio é fermentado a
ácido; as colônias de S. aureus que
fermentam o manitol são, então,
diferenciadas das colônias de bactérias
que não fermentam o manitol. As
bactérias que crescem em concentração
elevada de sal e fermentam o manitol a
ácido podem ser facilmente
identificadas pela mudança de
coloração
Meios de enriquecimento
• Como as bactérias em pequeno número podem ser perdidas, em
particular se outras bactérias estiverem presentes em maior número,
algumas vezes é necessário utilizar uma cultura de enriquecimento.
• O meio (meio enriquecido) para enriquecer uma cultura geralmente é
líquido e fornece nutrientes e condições ambientais que favorecem o
crescimento de um microrganismo específico, e não de outros.
• Nesse sentido, também é um meio seletivo, mas elaborado para
amplificar até níveis detectáveis um número muito pequeno do
microrganismo de interesse.
Meios de enriquecimento
• Com frequência, essa metodologia é empregada com amostras de
solo ou fezes.
Obtenção de culturas puras
• Uma colônia visível teoricamente vem de um único esporo ou célula
vegetativa, ou de um grupo dos mesmos microrganismos ligados
uns aos outros em agregados ou cadeias.
• A maioria dos trabalhos de microbiologia requer culturas puras ou
clones da bactéria
Obtenção de
culturas puras
• O método de
isolamento mais
comumente utilizado
para a obtenção de
culturas puras é o
método do
esgotamento em placa
Preservação de culturas bacterianas
• A refrigeração pode ser utilizada para o armazenamento de culturas
bacterianas por curtos períodos.
• O ultracongealmento é um processo no qual uma cultura pura de
microrganismos é colocada em um líquido em suspensão e submetida
a um rápido congelamento em temperaturas variando entre 50 a
95°C. A cultura, em geral, pode ser descongelada e cultivada até
mesmo vários anos depois.
Preservação de culturas bacterianas
• A liofilização (criodessecação), uma suspensão de micróbios é
rapidamente congelada em temperaturas variando entre 54 a 72°C, e
a água é removida por um alto vácuo (sublimação). Ainda sob vácuo,
o recipiente é selado, derretendo o vidro com uma chama de alta
temperatura. O pó obtido desse processo, contendo os
microrganismos sobreviventes, pode ser armazenado por anos. Os
organismos podem ser reativados a qualquer momento por
hidratação com um meio nutriente líquido apropriado.
Crescimento de culturas bacterianas
O crescimento bacteriano se refere ao aumento do número de
bactérias, e não a um aumento no tamanho das células
individuais
Divisão bacteriana
• As bactérias
normalmente se
reproduzem por
fissão binária.
Divisão bacteriana
• Algumas espécies bacterianas se reproduzem por brotamento;
• elas formam uma pequena região inicial de crescimento (o broto),
que vai se alargando até atingir um tamanho similar ao da célula
parental, e, então, separa-se dela.
Curva de crescimento bacteriano
Medida direta do crescimento microbiano
• Diluição seriada;
• Contagem em placas;
• O método do número mais provável;
• Contagem de bactérias por filtração;
• Contagem microscópica direta;
• Determinação do número de bactérias por turbidimetria;
• Atividade metabólica;
• Peso seco.
