Curva padrão pelo método do DNS e Determinação de Açúcares

Redutores (AR) e Açúcares Redutores Totais (ART)

A. M. FIGUEIREDO, G. M. RUFATTO e V. B. OENNING

1. INTRODUÇÃO
A pesquisa por novas fontes alternativas de energia intensificou-se mundialmente
nas últimas décadas. Diante deste fato, o etanol emerge no Brasil, por volta de 1975, como
uma alternativa sustentável e limpa, sendo o principal concorrente dos combustíveis
fósseis (MACEDO; NOGUEIRA, 2004). Sua produção envolve um complexo processo
industrial que exige rigoroso controle de qualidade em todas as etapas, desde o cultivo da
cana-de-açúcar até a obtenção do produto final. O segmento de tais são fundamentais para
garantir que o produto atenda aos padrões estabelecidos pela resolução n° 946/2023 da
Agência Nacional do Petróleo (ANP), a qual regulamenta a comercialização de etanol
anidro pelas distribuidoras de combustível.
Entre essas etapas, a determinação da quantidade de açúcares redutores pelo método
DNS (3,5-dinitrosalicilato) desempenha um papel importante no controle de qualidade
das matérias-primas, assegurando que o produto esteja dentro dos parâmetros exigidos
pela legislação para o processamento.
O procedimento consiste em combinar o substrato (glicose) com o reagente DNS,
gerando uma coloração amarelada. Em seguida, a mistura é aquecida em banho-maria,
fornecendo a energia térmica necessária para que o DNS reaja com os grupos aldeído da
glicose, formando um composto colorido (vermelho-alaranjado) cuja intensidade é
proporcional à quantidade de glicose presente na amostra. A quantificação desse
composto é então realizada por meio de espectrofotometria.
Dessa forma, na cana-de-açúcar, a determinação de açúcares redutores (AR) e
açúcares redutores totais (ART) torna-se crucial para avaliar sua qualidade. Os açúcares
redutores, como a glicose e a frutose, possuem a capacidade de reagir diretamente com o
DNS. Já os açúcares totais incluem, além dos redutores, a sacarose, que precisa ser
transformada em açúcares simples por hidrólise antes da análise por DNS.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Este relatório abrange duas práticas realizadas em laboratório. A primeira prática
envolveu a construção de uma curva padrão para a determinação de açúcares redutores
pelo método DNS, com a glicose sendo empregada como padrão. O objetivo da prática
foi estabelecer uma curva padrão que permitisse quantificar a concentração de açúcares
redutores em amostras desconhecidas.
A segunda prática teve como objetivo a determinação de Açúcares Redutores (AR)
e Açúcares Redutores Totais (ART) no caldo de cana. Nela, buscou-se quantificar a
concentração de sacarose, glicose e frutose presentes na amostra, por métodos
apropriados para a análise de cada tipo de açúcar.

2.1 Curva padrão para determinação de açúcares redutores pelo método

DNS

2.1.1 Preparo da solução padrão de glicose

Montou-se uma solução padrão, consistida em 100 mL de água destilada em um
balão volumétrico, contendo 90 mg de glicose.
2.1.2 Montagem da curva padrão
A partir da solução padrão, monta-se pontos para a curva seguindo valores
apresentados no relatório, em 6 frascos de 15 mL, adiciona-se os seguintes volumes,
apresentados na tabela 1.
Tabela 1: resultados do espectrômetro
Numeração Volume de água destilada Volume da solução
(mL) padrão(mL)
1 – BRANCO 1 0
2 0,8 0,2
3 0,6 0,4
4 0,4 0,6
5 0,2 0,8
6 0 1
Fonte: Relatório da Prática (2024)
Após a montagem, adicionou-se 1 mL de DNS em cada tubo de ensaio, e todos os
tubos foram colocados em um banho-maria a 100°C por 5 minutos. Em seguida, retirou
 se os tubos e, após resfriarem, cada vidraria foi completada com 13 mL de água destilada.
Após esse processo, os frascos foram submetidos à medição da absorbância, com o
equipamento ajustado para um comprimento de onda de ʎ = 540 nm. As absorbâncias
medidas e seus respectivos valores foram registrados, os quais serão apresentados no
decorrer do relatório.

2.2 Açúcares redutores (AR) e açúcares redutores totais (ART)

2.2.1 Determinação de Açúcares redutores
Com o objetivo de determinar os açúcares redutores na amostra de caldo de cana,
realizaram-se diluições de 1, 5 e 10 mL da amostra em balões volumétricos de 100 mL,
completando-se o volume com água destilada. Após a diluição das amostras e suas
respectivas identificações, reservou-se as soluções para a análise de DNS, cujos
resultados serão apresentados posteriormente no relatório.
2.2.2 Determinação de açucares redutores totais (ART)
Para a determinação dos açúcares redutores na amostra, diluiu-se in natura 25 mL
da amostra em um balão volumétrico de 250 mL, com o acréscimo de 35 mL de água
destilada. Em seguida, a solução foi levada ao banho-maria até atingir a temperatura de
65°C. Ao alcançar essa temperatura, adicionaram-se 13 mL de HCl 1:1 como agente
redutor, o que permitiu a transformação dos açúcares de sacarose em monossacarídeos
por meio da hidrólise. Após homogeneizar a solução, deixou-se em repouso por 30
minutos. Em seguida, completou-se o balão até 250 mL com água destilada. Transferiram-
se então 2, 10 e 25 mL do hidrolisado para balões volumétricos de 100 mL, completando -
se o volume com NaOH 0,1 mol/L. Retirou-se 1 mL de cada solução, transferindo-os para
tubos de ensaio devidamente identificados.
2.2.3 Dosagem de açúcares pelo método DNS
Iniciou-se com a preparação de um padrão de glicose para obter a curva de
calibração e permitir a comparação das leituras das amostras. No decorrer do processo,
adicionou-se 1 mL do reagente DNS às amostras de ART e AR e, em seguida, colocou-se
as amostras em banho-maria por um período de 5 minutos. Com as amostras já resfriadas
e o branco preparado com 1 mL de água destilada e 1 mL de DNS, ajustou-se o
espectrofotômetro para um comprimento de onda de 540 nm e realizaram-se as medições
de absorbância. Os resultados serão apresentados no decorrer do relatório.
 Para avaliar o teor de açúcares redutores (glicose, frutose), açucares redutores totais
e sacarose, utilizou-se as equações abaixo.

(𝐶 𝑥 𝐵 𝑥 𝐹 𝑥 10 − 4) (1)
%𝐴𝑅 =
𝑝

(𝐴 𝑥 𝐵 𝑥 𝐹 𝑥 10 − 4) (2)
%𝐴𝑅𝑇 =
𝑝

% 𝑆𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑒 = [%𝐴𝑅𝑇 − %𝐴𝑅] 𝑥 0,95 (3)

Onde A e C representam as respectivas absorbâncias dos açúcares, B a concentração

do padrão glicose (µg/ml), P a absorbância do padrão glicose e F o fator de diluição das
amostras.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Determinação de açúcares redutores pelo método DNS

Após a realização de todas as medições de absorbância em relação às respectivas

concentrações, foi elaborada a Tabela 1 abaixo, dando sequência ao gráfico absorbância
x concentração.
Tabela 1: Dados de ABS média por Glicose
Água destilada Solução padrão
Tubos ABS média Glicose (ug/mL)
(mL) (mL)
branco 0 1 0 0
1 0,085 0,8 0,2 0,1808
2 0,1925 0,6 0,4 0,3616
3 0,287 0,4 0,6 0,5424
4 0,386 0,2 0,8 0,7232
5 0,4935 0 1 0,904
Fonte: Os autores (2024).
 Gráfico1: Concentração x Absorbancia

Fonte: Os autores (2024).

Com o auxílio do Excel para a construção do Gráfico 1, obteve-se um coeficiente
de determinação de aproximadamente 0,9995, indicando uma forte correlação para a
curva padrão das amostras. Esse resultado demonstra a padronização e a qualidade na
execução da prática experimental.

3.2 Dosagem de açúcares redutores e totais pelo método do DNS

Com a preparação das amostras de açúcares redutores e totais, realizou-se a
espectrofotometria a um comprimento de onda de ʎ = 540 nm para verificar se os valores
de absorbância estavam de acordo com as concentrações utilizadas. Em seguida, com os
valores obtidos, elaborou-se a Tabela 2, apresentada a seguir.

Tabela 2: Absorbâncias e Diluições

Diluição Absorbância Diluição Absorbância
(AR) (AR) (ART) (ART)
1 0,010 2 0,147
5 0,100 10 0,708
10 0,275 25 1,160
Fonte: Os autores (2024)
 Com os parâmetros da Tabela 2 e utilizando os cálculos descritos anteriormente,
quantificou-se a concentração de açúcares nas amostras de caldo de cana, vistos na Tabela
3 abaixo.
Tabela 3: teores de açúcares.
F (AR) F (ART) % AR % ART % Sacarose
100 500 0,1839 13,5135 12,6632
20 100 0,3677 13,01708 12,0169
10 40 0,5056 8,5309 7,6241
Fonte: Os autores (2024)
Por fim, os valores obtidos podem ser comparados com os valores recomendados
pela Embrapa para a cana-de-açúcar, conforme apresentado abaixo.
Imagem 1: valores recomendados para cana-de-açúcar

Fonte: Embrapa (2022)

Comparando os parâmetros, os valores de AR nas amostras analisadas (0,1839% a
0,5056%) estão abaixo do limite máximo recomendado pela Embrapa, de 0,8%. Esse
resultado indica que os teores de glicose e frutose se encontram dentro dos padrões
desejáveis para a cana-de-açúcar.
 O valor de ART (13,5135%) está na faixa considerada ideal, sendo desejável
alcançar o valor mais elevado possível. Esse aspecto sugere que a cana-de-açúcar
analisada apresenta um teor adequado de açúcares totais, o que inclui a sacarose
(dissacarídeo) juntamente com os monossacarídeos glicose e frutose.
Por fim, o valor de sacarose (12,6632%) encontra-se dentro da faixa esperada,
destacando-se como o principal açúcar presente na cana-de-açúcar, reforçando sua
importância no perfil sacarídeo da planta.
Nota: Valores discrepantes como %ART (8,5309) e de % Sacarose (7,6241) são
justificados por erro de prática, manuseamento de instrumentos, erro de diluição, que
ocasionaram os valores destoantes.

4. CONCLUSÃO
A determinação dos açúcares redutores e totais no caldo de cana-de-açúcar,
utilizando o método DNS, mostrou-se eficiente e precisa. A curva padrão de glicose
apresentou uma ótima linearidade, indicando a confiabilidade dos dados obtidos. Os
resultados encontrados para as amostras de caldo de cana estão dentro dos valores
esperados para a variedade analisada. Por fim, entende-se que a amostra analisada se
encontra dentro dos padrões nacionais para produção de Bioetanol.

5. REFERÊNCAIS BIBLIOGRÁFICAS
BRASIL. Ministério de Minas e Energias. BALANÇO ENERGÉTICO NACIONAL
2023. EPE, 2023.
MACEDO, I. C.; NOGUEIRA, L. A. H. Avaliação da Expansão da Produção de Etanol
no Brasil. CGEE - Prospecção Tecnológia Biocombustível. Brasília, 2024.
Fundamentos da Espectrofotometria. Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF, 2016.
Disponível em: <https://www2.ufjf.br/quimica/files/2016/08/Espectrometria -UV-
vis.pdf>. Acesso em 27/10/2024.

6. QUESTIONÁRIO
1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de açúcares
Há diferentes técnicas para mensurar açucares. A seguir, aborda-se 3 metodologias. Tais
como:
Métodos do Fenol-Ácido Sulfúdrico: Baseia-se com o ácido reagindo com carboidratos,
como resultado há desidratação dos açucares, como na sequência se formam compostos
furânicos. A reação fenol e compostos geram um complexo colorido, sendo detectáveis
pelo espectrofotômetro.
Reação de Somogyi-Nelson: Com intuito de quantificar açucares redutores, usam-se íons
cúpricos (Cu²⁺), quais serão reduzidos em íons cuprosos (Cu⁺), a formação de um
complexo colorido como arseno-molibdato, torna-se então possivel análise em um
espectrofotômetro.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC): HPLC consiste no uso do
equipamento para separação, identificação e quantificação de uma mistura liquida.

2) Quais as possíveis fontes de erro na prática em questão?

Vários fatores podem contribuir para margem de erro, sendo de irresponsabilidades
durante o manuseio, erros no manuseio de equipamentos, falta de atenção e perda do
tempo marcado para reações, baixa homogeneização das misturas antes da medição de
absorbância, repetição de uma mesma amostra supondo ser outra, dentre tantos erros
imprevisíveis.