PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) – Explicação Avançada Ingredientes detalhados

Contexto Histórico Componente Função

PCR foi inventada por Kary Mullis em 1983. Antes da PCR, para isolar ou DNA molde Contém a sequência-alvo a ser amplificada.
amplificar um gene, era necessário clonar o DNA em plasmídeos bacterianos Pequenos oligonucleotídeos (18–25
— um processo lento e laborioso. PCR mudou completamente isso, Primers
nucleotídeos), específicos.
possibilitando a amplificação de segmentos específicos de DNA em poucas Desoxinucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP,
horas. dNTPs
dTTP) — "tijolos" da nova fita.
Em 1993, Mullis ganhou o Prêmio Nobel de Química por essa invenção. DNA polimerase Catalisa a adição de nucleotídeos.
Mantém pH e fornece Mg²⁺ (essencial como
Mecanismo Molecular Profundo Tampão (Buffer)
cofator da polimerase).
PCR é um ciclo repetitivo baseado nos seguintes fundamentos bioquímicos:
1. Desnaturação (94–98 °C, 20–30 segundos) Estabiliza interações entre o DNA e a
Íons de magnésio (Mg²⁺)
• O calor quebra as pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas polimerase.
complementares do DNA de fita dupla (A-T, C-G).
• Resultado: duas fitas simples de DNA disponíveis como moldes. Efeito Exponencial da PCR
Importante: Temperaturas muito baixas podem não separar completamente as Cada ciclo duplica a quantidade de DNA.
fitas; temperaturas muito altas podem danificar o DNA. Então, idealmente:
DNA final=DNA inicial×2n\text{DNA final} = \text{DNA inicial} \times
2. Anelamento dos primers (50–65 °C, 20–40 segundos) 2^nDNA final=DNA inicial×2n
• Baixando a temperatura permite que os primers sintéticos se liguem às Onde n = número de ciclos.
regiões específicas do DNA molde. Exemplo: com 30 ciclos → 230≈1092^{30} \approx 10^9230≈109 vezes a quantidade
• A temperatura de anelamento precisa ser otimizada para: inicial!
o Alta especificidade (temperatura adequada para que só o alvo seja
copiado). Erros e Contaminações
o Estabilidade da ligação primer–molde. PCR é altamente sensível, o que é bom, mas qualquer contaminação com DNA
Importante: A escolha da temperatura depende do conteúdo de GC (guanina e estranho também será amplificada.
citosina) dos primers (mais GC → temperatura de anelamento mais alta). Fontes comuns de erro:
• Aerosóis contendo DNA.
3. Extensão (72 °C, 30–60 segundos) • Pipetas contaminadas.
• A DNA polimerase termoestável (ex: Taq polimerase) adiciona dNTPs à • Uso de reagentes contaminados.
extremidade 3’ do primer. Soluções:
• Polimerização ocorre no sentido 5' → 3'. • Dividir ambientes de trabalho (preparação vs amplificação).
A velocidade típica de extensão é cerca de 1000 bases por minuto para Taq. • Usar pontas de pipeta com filtro.
Controle negativo (sem DNA molde).
 Tipos de PCR e Suas Funções
Tipo de PCR Função Principal Aplicações Específicas
Amplificar uma sequência específica de DNA para Clonagem de genes, detecção de
PCR convencional
visualização ou análise posterior. presença/ausência de sequências específicas.
Converter RNA em DNA (cDNA) e depois amplificar
Quantificação de RNA viral (ex: HIV, SARS-CoV-2),
RT-PCR (PCR com transcrição reversa) esse cDNA. Permite estudar a expressão gênica, já
expressão de genes em células.
que o RNA reflete quais genes estão ativos.
Quantificar a quantidade de DNA durante a própria
reação, monitorando a fluorescência em tempo
Diagnósticos rápidos, estudos farmacogenéticos,
qPCR (PCR em tempo real / PCR quantitativa) real. Medição precisa da carga viral, expressão
pesquisa de câncer.
gênica, análise de copy number (número de cópias
gênicas).
Amplificar múltiplas sequências diferentes Detecção simultânea de múltiplos patógenos ou
PCR multiplex simultaneamente usando vários pares de primers mutações (ex: painéis de infecção respiratória,
no mesmo tubo. Economiza tempo e amostra. mutações em genes de câncer).
Aumentar a especificidade da amplificação usando
Quando o DNA-alvo é raro ou contaminado com
dois pares de primers em duas rodadas
Nested PCR muito DNA não específico, como em detecção de
sucessivas. Primeiro um produto maior, depois uma
vírus em amostras clínicas sujas.
parte interna é amplificada.
Prevenir reações inespecíficas iniciando a atividade
da DNA polimerase somente após a primeira
Reações de alta especificidade, especialmente em
Hot-start PCR desnaturação em alta temperatura. Impede que
diagnósticos clínicos e amostras complexas.
primers se liguem de forma errada à baixas
temperaturas.
Melhorar a especificidade começando o
anelamento em uma temperatura alta e abaixando Amplificação difícil ou quando os primers têm baixa
Touchdown PCR
gradativamente a cada ciclo. Assim, as primeiras especificidade.
cópias são superespecíficas.
Quantificar exatamente o número de moléculas- Detecção de mutações raras, quantificação de DNA
Digital PCR (dPCR) alvo ao dividir a reação em milhares de circulante tumoral, análise de edição gênica
compartimentos. Detecta variações mínimas. (CRISPR).
 Eletroforese – Explicação Profunda Componentes da Técnica
O que é? 1. Gel (Agarose ou Poliacrilamida)
A eletroforese é uma técnica usada para separar moléculas carregadas (como • Porosidade variável: quanto maior a concentração, menor os poros →
ácidos nucleicos ou proteínas) com base em seu tamanho, carga elétrica e/ou separa moléculas menores.
conformação. • Agarose: gel mais espesso, fácil de manipular, baixa toxicidade.
Funciona aplicando um campo elétrico sobre um gel ou meio líquido. As • Poliacrilamida: gel mais fino, alta resolução, mas tóxico durante a
moléculas migram nesse campo com velocidade proporcional à sua carga e preparação.
inversamente proporcional ao seu tamanho. 2. Tampão eletrolítico
• Fornece íons para o campo elétrico.
Princípio Físico-Químico • Mantém o pH estável (ex: TBE, TAE, SDS).
As moléculas como DNA, RNA e proteínas têm cargas elétricas líquidas em pH 3. Fonte de corrente contínua
fisiológico. • Aplica o campo elétrico (tipicamente 80–150 V).
Quando aplicadas em um campo elétrico, essas moléculas migram: 4. Corante intercalante (p/ DNA)
•DNA/RNA: sempre do polo negativo (cátodo) para o positivo (ânodo), pois • Ex: brometo de etídio (EtBr), SYBR Safe.
têm carga negativa (grupo fosfato). • Permite visualização sob luz UV.
•Proteínas: podem migrar para ambos os lados, dependendo de seu ponto
isoelétrico (pI) e do pH do meio. Como funciona a separação
A matriz de separação é geralmente um gel poroso: ➤ DNA/RNA:
•Gel de agarose → DNA e RNA. • Todos têm carga negativa constante → migram com mesma força elétrica.
•Gel de poliacrilamida (PAGE) → proteínas (e DNA de pequeno tamanho). • A diferença na velocidade de migração é devido ao tamanho.
• Fragmentos menores passam mais facilmente pelos poros → migram
mais rápido.
Tipos de Eletroforese ➤ Proteínas:
Tipo Uso principal Característica • Têm cargas variáveis → precisa-se padronizar com SDS (um detergente
Eletroforese em gel de DNA e RNA de 100 a >10.000 aniônico) que:
Simples, baixa resolução. o Desnatura as proteínas.
agarose pb
o Atribui carga negativa proporcional à massa.
Eletroforese em gel de Proteínas ou DNA pequeno
Alta resolução. • Resultado: proteínas migram apenas segundo seu peso molecular.
poliacrilamida (PAGE) (até 1000 pb)
Separar proteínas apenas SDS mascara a carga da Interpretação dos Resultados
SDS-PAGE (SDS + PAGE)
por massa proteína. • Após a corrida, os fragmentos aparecem como bandas visíveis no gel.
Eletroforese em 2D (2D- Separar proteínas por carga • A posição da banda está inversamente proporcional ao tamanho
Alta resolução proteômica.
PAGE) (pI) e massa molecular.
Separação ultra-rápida e Automação, uso clínico e • Usa-se uma escada (ladder) molecular com tamanhos conhecidos para
Eletroforese capilar
precisa forense. comparar.
 Variações e Técnicas Relacionadas
•Eletroforese em gel desnaturante: Mantém DNA ou proteínas em
estado linear/desnaturado (ex: uréia, formamida).
•Southern blot: DNA → separado por eletroforese e transferido para
membrana.
•Western blot: Proteína → separado por SDS-PAGE e detectado com
anticorpos.

Limitações
•Difícil separar fragmentos de mesmo tamanho.
•Tóxicos (EtBr, acrilamida).
•Não é quantitativo (a menos que use software de densitometria).

Aplicações práticas

Área Aplicação
Verificar integridade e tamanho de
Genética
DNA (ex: após PCR ou extração).
Identificação de mutações por PCR +
Diagnóstico eletroforese (doenças genéticas,
câncer).
Confirmar sucesso de clonagem,
Biologia molecular
digestões enzimáticas, etc.
Analisar composição proteica (SDS-
Proteômica
PAGE, 2D-PAGE).
Comparação de perfis genéticos
Medicina forense
(STRs).
 Técnicas de Extração e Purificação de Ácidos
Nucleicos

1. Extração fenol-clorofórmio 2. Extração por kits comerciais (colunas de 3. Precipitação com etanol/isopropanol
Princípio: sílica) Princípio:
• Baseada na diferente solubilidade de proteínas e Princípio: • Ácidos nucleicos são pouco solúveis em
ácidos nucleicos em misturas orgânicas (fenol, • Ácidos nucleicos aderem à matriz de sílica álcoois (etanol ou isopropanol) em presença
clorofórmio) e em fase aquosa. em presença de alta concentração de sais de sais (NaCl, acetato de sódio).
• Ácidos nucleicos são hidrofílicos → permanecem na caotrópicos (como guanidina). • Precipitam fora da solução, podendo ser
fase aquosa. • Impurezas são lavadas. recuperados por centrifugação.
• Proteínas se desnaturam e ficam na interface/fase • DNA/RNA é posteriormente eluído com água
orgânica. ou tampão de baixo sal. Passo a passo (simplificado):
Após a extração (por fenol ou kits, ou mesmo
Passo a passo (simplificado): Passo a passo (simplificado): diretamente de lisados), adiciona-se:
Células/tecidos são lisados (quebrados) para liberar o Lisar células com tampão lítico contendo agentes o Etanol frio 2–2,5 volumes (ou
conteúdo. caotrópicos. isopropanol 1 volume).
Adição de mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. Adicionar a solução à coluna de sílica e centrifugar o Sal (ex: acetato de sódio 0,3 M).
Vortex (agitação vigorosa) e centrifugação → separação em → DNA/RNA adere. Incubar (às vezes a -20 °C ou -80 °C para maior
3 fases: Lavar a coluna com tampões de lavagem → precipitação).
o Fase aquosa (superior): DNA/RNA. remove contaminantes (proteínas, sais). Centrifugar → DNA/RNA forma um pelotão (pelet).
o Interface: proteínas desnaturadas. Eluir o DNA/RNA com água ou tampão Tris-EDTA. Lavar o pelotão com etanol 70% para remover sais
o Fase orgânica (inferior): lipídios e restos residuais.
celulares. Vantagens: Secar e ressuspender em água ou tampão.
Recupera-se a fase aquosa com cuidado. • Muito rápido (15–30 minutos).
O DNA/RNA é precipitado (geralmente com etanol frio e sais • Resultados limpos e reproduzíveis. Vantagens:
como acetato de sódio). • Evita o uso de solventes tóxicos (fenol). • Método clássico e barato.
• Fácil para técnicos não muito experientes. • Permite concentrar ácidos nucleicos em
Vantagens: Desvantagens: pequenos volumes.
• Muito eficaz para obter DNA ou RNA muito puros. • Custo relativamente mais alto (kits são • Pode ser combinado após qualquer método de
• Remove eficientemente proteínas e lipídios. caros). extração.
Desvantagens: • Em alguns casos, o rendimento de DNA de Desvantagens:
• Uso de fenol e clorofórmio → extremamente tóxicos alto peso molecular pode ser menor. • Não remove proteínas → geralmente feito
e voláteis. após uma extração fenol-clorofórmio.
• Requer experiência técnica e boas práticas de • Se precipitar rápido sem cuidado → risco de
laboratório. co-precipitar sais contaminantes.
 Clonagem Molecular – Explicação Completa 3. Construção de vetores (plasmídeos, cosmídeos, BACs)
A clonagem molecular é o conjunto de técnicas usadas para O que são vetores?
isolar, cortar, inserir e replicar um gene ou sequência de DNA Moléculas de DNA autônomas e replicáveis, usadas para carregar e propagar genes
dentro de outro DNA chamado de vetor, que será introduzido numa inseridos.
célula hospedeira (geralmente uma bactéria). Tipos principais de vetores:
Tipo Características Uso principal
1. Digestão enzimática com enzimas de restrição
Princípio: DNA circular de ~3–10 kb. Tem
As enzimas de restrição (endonucleases de restrição) reconhecem origem de replicação e genes de
Plasmídeos Clonagem comum em bactérias.
sequências específicas de DNA e cortam nessas regiões. seleção (ex: resistência a
São naturais de bactérias, onde funcionam como defesa contra antibiótico).
vírus. Plasmídeo + sequências do fago λ
Como funcionam: Cosmídeos (cos sites). Carregam fragmentos Clonagem de genomas grandes.
• Reconhecem sequências palindrômicas (ex: EcoRI → 5'- maiores (35–45 kb).
GAATTC-3'). BACs (Bacterial Artificial Vetores grandes (100–300 kb). Clonagem de genomas inteiros
• Cortam gerando: Chromosomes) Replicam-se como cromossomos. (genômica estrutural).
o Extremidades coesivas ("sticky ends") → com YACs (Yeast Artificial Vetores que replicam em Clonagem de DNA humano em
sobreposição.
Chromosomes) leveduras. Carregam até 1 Mb. grande escala.
o Extremidades cegas ("blunt ends") → sem
sobreposição. 4. Transformação, Transdução, Transfecção
Função na clonagem: Essas são as formas de inserir DNA recombinante em células vivas.
• Cortar o vetor (ex: plasmídeo) e o gene de interesse com a Transformação
mesma enzima → garante complementaridade. • Entrada de DNA plasmidial em bactérias (ex: E. coli).
• Facilita a ligação posterior com DNA ligase. • Métodos:
o Choque térmico com CaCl₂ (torna a membrana permeável).
2. Ligação (com DNA ligase) o Eletroporação (campo elétrico abre poros).
Princípio: Transdução
A DNA ligase catalisa a formação de ligações fosfodiéster entre • Transferência via vírus bacteriófago.
os nucleotídeos das extremidades do DNA. • Vetores virais são usados para inserir DNA em bactérias ou células eucarióticas.
• Une fragmentos com extremidades compatíveis. Transfecção
• Pode ligar fragmentos com extremidades coesivas ou cegas. • Introdução de DNA em células eucarióticas (ex: mamíferas).
Aplicação: • Métodos:
• Inserir o gene de interesse dentro do vetor (plasmídeo, o Lipidios (lipofecção): DNA encapsulado em lipossomos.
cosmídeo etc.). o Eletroporação.
• Gera um DNA recombinante, que pode ser replicado dentro Vírus (ex: lentivírus, adenovírus)
de células.
 Por que criar um DNA recombinante?
Definição: 4. Terapia gênica
DNA recombinante é uma molécula de DNA formada por fragmentos • Criação de vetores com genes saudáveis para substituir genes defeituosos em
de DNA de diferentes origens que foram unidos artificialmente. Ele pacientes.
não ocorre naturalmente, mas é criado em laboratório, geralmente • Inserção por vírus modificados, diretamente no organismo.
com o uso de vetores (plasmídeos, vírus) e enzimas (restrição e ligase). Exemplo:
• ADA-SCID (Imunodeficiência Severa) já foi tratada com sucesso com DNA
Finalidades principais de se criar DNA recombinante recombinante.

1. Produção de proteínas recombinantes 5. Vacinas e imunoterapia

Criamos DNA recombinante contendo genes de interesse (ex: insulina • DNA recombinante permite expressar antígenos virais ou bacterianos em culturas
humana), inserimos em bactérias (como E. coli) ou células eucarióticas celulares.
→ elas passam a produzir a proteína desejada. • Base de vacinas modernas, como:
Exemplos clássicos: o Vacina contra hepatite B (com antígeno HBsAg).
• Insulina humana (tratamento do diabetes). o Vacinas de DNA ou mRNA (como Pfizer/BioNTech para COVID-19, que usaram
• Hormônio de crescimento (hGH). tecnologia recombinante para projetar as sequências genéticas do spike viral).
• Fator VIII (para hemofílicos).
• Vacinas recombinantes, como a da hepatite B. 6. Criação de sondas e marcadores genéticos
• DNA recombinante com genes como GFP (proteína fluorescente verde) é usado para
2. Estudo da função de genes rastrear expressão gênica, localização celular, sinalização.
Clonamos genes específicos e os introduzimos em organismos para
ver:
• Como eles são expressos. O que é necessário para criar DNA recombinante?
• Em que tecidos.
• O que acontece quando são mutados. Recurso Função
Isso é a base da engenharia genética experimental. Enzimas de restrição Cortam DNA em locais definidos.
DNA ligase Junta fragmentos criando uma molécula única.
3. Criação de organismos geneticamente modificados (OGMs) Vetores (plasmídeos, vírus) Carregam e replicam o DNA recombinante.
• Criamos DNA recombinante contendo genes de interesse agrícola Células hospedeiras (bactérias, leveduras,
ou ambiental. Expressam e multiplicam o DNA introduzido.
mamíferas)
• Inserimos esse DNA em plantas ou animais.
Exemplos:
• Milho Bt: planta que expressa toxina contra insetos.
• Arroz dourado: biossíntese de betacaroteno.
• Salmão transgênico: crescimento mais rápido.
• Cabras que produzem proteínas humanas no leite.
 Qual é a relação entre DNA recombinante e vacinas? Exemplos de vacinas baseadas em DNA recombinante:
Em resumo: Hepatite B
DNA recombinante é usado para produzir antígenos • O gene HBsAg (antígeno de superfície) do vírus B é clonado e expresso em
virais/bacterianos em laboratório, sem precisar do leveduras (Saccharomyces cerevisiae).
microrganismo inteiro. Esses antígenos são usados como base • A proteína produzida é purificada e injetada como vacina.
para criar vacinas seguras e eficazes. • 100% baseada em DNA recombinante.
Papilomavírus humano (HPV) – vacina Gardasil
Vamos por partes — como funcionam vacinas "clássicas"? • A proteína L1 do HPV é expressa via DNA recombinante em células de levedura ou
As vacinas tradicionais usavam: inseto.
• Vírus atenuados (ex: sarampo). • Monta-se uma partícula viral-like (VLP) sem DNA viral → segura e eficaz.
• Vírus inativados (ex: hepatite A). Vacinas COVID-19 (mRNA e vetores virais)
• Ou apenas partes do microrganismo, como toxinas ou Embora não sejam DNA recombinante clássico, foram projetadas usando engenharia
proteínas (vacina contra difteria, tétano). genética recombinante:
Desvantagens: • Vacina da Pfizer/BioNTech e Moderna (mRNA): o RNA é feito in vitro com base
• Produção demorada. no DNA recombinante do gene spike.
• Risco (pequeno) de reativação no caso de vírus vivos. • Vacina de Oxford/AstraZeneca (vetor viral): o gene spike recombinante é
• Dificuldade de cultivar certos patógenos. inserido em um adenovírus modificado que serve como vetor.

Entra o DNA recombinante…

Em vez de usar o vírus inteiro, cientistas isolam o gene que
codifica uma proteína importante do vírus (ex: a proteína spike Vantagens de vacinas recombinantes
do coronavírus, ou o antígeno de superfície do vírus da hepatite B). Vantagem Explicação
Esse gene é clonado usando técnicas de DNA recombinante:
Sem uso do vírus inteiro → risco muito
• Inserido em plasmídeos. Segurança
menor.
• Expressado em células de levedura, bactérias ou
mamíferas. Foca só na parte imunogênica mais
Precisão
• A proteína resultante é purificada e usada como antígeno importante (ex: proteína spike).
na vacina. Pode ser feita em células de cultura com alta
Produção em escala
eficiência.
Fácil modificar o gene se o vírus sofrer
Adaptabilidade
mutações.
 Sequenciamento de DNA III. PRINCIPAIS MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO
(Resumo técnico, aplicado e aprofundado) 1. Método de Sanger (sequenciamento por terminação de cadeia)
Técnica clássica, considerada o “padrão ouro” para sequenciamento de regiões curtas com alta
I. DEFINIÇÃO precisão.
O sequenciamento de DNA é a técnica utilizada para determinar a Como funciona:
ordem exata das bases nitrogenadas (A, T, C, G) em uma molécula • Usa DNA polimerase, primers, nucleotídeos normais e modificados (ddNTPs) que
de DNA. terminam a síntese.
Essa ordem carrega toda a informação genética de um organismo. • Cada base (A, T, C, G) é marcada com cor fluorescente.
Saber essa sequência permite: • Fragmentos gerados são separados por eletroforese capilar, gerando um eletrograma
• Identificar genes com a sequência.
• Detectar mutações
Características:
• Entender doenças genéticas
• Analisar linhagens microbianas Característica Valor
• Desenvolver terapias personalizadas Leitura típica 500–1000 pb
Alta fidelidade
II. OBJETIVOS E USOS DO SEQUENCIAMENTO Tempo/custo Moderado
Painéis genéticos, confirmação de mutações,
Aplicação Exemplos práticos Aplicações
uso forense
Identificação de mutações causadoras de
Diagnóstico genético
doenças hereditárias
2. NGS – Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing)
Identificar mutações tumorais para tratamento
Oncologia molecular Conjunto de tecnologias que permitem o sequenciamento massivo e paralelo de milhões de
direcionado
fragmentos de DNA, de forma automatizada.
Classificar bactérias e vírus com base em seu
Microbiologia clínica Etapas gerais:
genoma
Fragmentação do DNA
Projetos como o Genoma Humano ou
Pesquisa genômica Ligação a adaptadores
genomas bacterianos
Amplificação por ponte (bridge PCR)
Ancestralidade / genética populacional Testes de DNA para genealogia e etnias
Sequenciamento por síntese (com fluorescência ou pirosequência)
Leitura e montagem do genoma por softwares bioinformáticos
Características:
Característica Valor
Volume de dados Muito alto (milhões de fragmentos)
Velocidade Muito rápida
Custo por base Baixo (em larga escala)
Aplicações principais Exomas, transcriptomas, metagenômica
Requer bioinformática? sim, para análise de grandes volumes
 Outros métodos menos usados: VII. COMO CAI EM PROVAS
• Pirosequenciamento (Roche): usa liberação de pirofosfato como sinal. FÁCIL:
• Nanopore (Oxford Nanopore): passa DNA por um poro e lê alterações de corrente “O sequenciamento de Sanger é baseado em:
elétrica. a) Amplificação por RT-PCR
• SMRT (PacBio): permite ler fragmentos longos (long read). b) Inibição de replicação por ddNTPs
c) Marcadores enzimáticos
IV. COMPARAÇÃO: Sanger vs NGS d) Leitura de microarranjos”
Critério Sanger NGS Resposta correta: b)
Milhões de fragmentos (100–
Capacidade de leitura 500–1000 pb MÉDIA:
300 pb cada)
“Qual a principal vantagem do sequenciamento de nova geração
Tempo de análise Mais lento Muito mais rápido
(NGS) em relação ao método de Sanger?”
Custo por base Mais alto Mais barato por base
Resposta: Volume de dados e velocidade de leitura
Volume de dados Baixo Muito alto
Regiões específicas, Genomas inteiros, exames DIFÍCIL:
Uso ideal
validação complexos “Em um laboratório, deseja-se sequenciar todas as mutações possíveis
em um câncer de pulmão. Qual técnica é mais indicada, considerando
V. EXEMPLOS DE USO PRÁTICO
sensibilidade e abrangência?”
Área Sequenciamento usado para: Resposta: NGS
Identificar mutações BRCA1/2 em câncer de
Medicina personalizada
mama VIII. CONCEITOS RELACIONADOS
COVID-19 Identificar novas variantes do SARS-CoV-2 • Mutação pontual: detectada facilmente por Sanger ou NGS
Genética forense Comparação de DNA em cenas de crime • Genotipagem: identificação do perfil genético
• Bioinformática: indispensável na análise de dados do NGS
Tipagem de cepas de Mycobacterium
Microbiologia • Análise de variantes (SNPs, deleções, inserções): feitas após o
tuberculosis
sequenciamento bruto
Controle de qualidade de organismos
Biotecnologia
modificados

VI. LIMITAÇÕES
Técnica Limitações principais
Sanger Não detecta variantes em baixa frequência ou mistas
Requer expertise em bioinformática e validação
NGS
posterior
Sequenciar não é o mesmo que interpretar – depende
Ambas
do contexto clínico
 Hibridização Molecular 3. Dot blot / Slot blot
(Resumo técnico, aplicado e detalhado) Similar aos blots clássicos, mas dispensa eletroforese.
A amostra é colocada diretamente na membrana e hibridizada com a sonda.
I. CONCEITO Aplicações:
A hibridização molecular é uma técnica baseada na capacidade de sequências complementares • Diagnóstico rápido
de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) se unirem entre si por pontes de hidrogênio. • Triagem de mutações
É o fundamento de diversas técnicas de biologia molecular, pois permite:
• Detectar sequências específicas de DNA ou RNA 4. FISH (Hibridização in situ fluorescente)
• Localizar genes ou mutações Detecta sequências de DNA diretamente nas células ou tecidos, com sondas
• Diagnosticar doenças infecciosas ou genéticas fluorescentes.
Aplicações principais:
II. PRINCÍPIO DA TÉCNICA Área Exemplos
• Uma sonda (pequeno fragmento de DNA ou RNA conhecido) é marcada com uma molécula Diagnóstico de aneuploidias (ex:
de detecção (radioativa, fluorescente ou enzimática). Genética Síndrome de Down), deleções (ex: Cri-du-
• Essa sonda é hibridizada (ligada) a uma sequência-alvo que é complementar a ela. chat)
• Se houver complementaridade, a sonda se liga à amostra. Identificação de translocações (ex: BCR-
• O sinal é então detectado visualmente ou por leitura digital. Oncologia
ABL em leucemia mieloide crônica)
Exame de amniocentese para diagnóstico
III. TIPOS DE HIBRIDIZAÇÃO Citogenética pré-natal
de anormalidades genéticas
1. Southern blot (DNA)
Detecta sequências específicas de DNA em uma amostra.
5. Microarrays (ou biochips)
Etapas:
Uso de milhares de sondas fixadas em uma lâmina para hibridizar com
Extração e digestão do DNA com enzimas de restrição
Separação por eletroforese em gel de agarose
amostras de DNA/RNA.
Transferência para membrana (blotting) Permite analisar expressão de milhares de genes ao mesmo tempo.
Incubação com sonda marcada
Detecção do sinal
Aplicações:
• Detecção de mutações, deleções, rearranjos genéticos
• Identificação de transgênicos
• Estudos de fingerprint genético

2. Northern blot (RNA)

Detecta RNA mensageiro (mRNA) específico → analisa expressão gênica.
Aplicações:
• Comparar níveis de expressão gênica entre tecidos
• Estudar genes que se expressam em câncer ou inflamação
 IV. MARCAÇÃO DAS SONDAS
VIII. COMO ISSO CAI EM PROVAS?
Tipo de marcação Método de detecção Exemplo de uso
FÁCIL:
Filme de raios-X “A técnica de hibridização molecular baseia-se na:
Radioativa (³²P) Southern clássico
(autoradiografia)
a) Replicação do DNA por polimerase
Fluorescente Microscopia de fluorescência FISH b) Ligação específica entre sequências complementares de ácidos nucleicos
Blots com detecção c) Edição genética de um gene defeituoso
Enzimática (ex: HRP) Substratos cromogênicos
colorimétrica d) Amplificação inespecífica de RNA”
Resposta correta: b)
V. APLICAÇÕES PRÁTICAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
MÉDIA:
Área Aplicação
“A técnica FISH é útil para:
Diagnóstico de doenças cromossômicas e
Genética clínica a) Sequenciar todo o genoma
mutações hereditárias
b) Identificar a ordem de aminoácidos em proteínas
Oncogenética Identificação de genes de fusão em leucemias
c) Detectar translocações cromossômicas com precisão
Identificação de patógenos específicos por d) Avaliar resistência a antibióticos”
Microbiologia clínica
hibridização com DNA Resposta correta: c)
Pesquisa genômica Mapeamento de genes e expressão gênica
Estudo de marcadores moleculares em tecidos DIFÍCIL:
Embriologia médica
em desenvolvimento “Assinale a alternativa INCORRETA:
VI. DIFERENÇAS ENTRE OS MÉTODOS
a) O Northern blot detecta mRNA específico
b) O Southern blot permite identificar deleções genéticas
Técnica Detecta Amostra Marcação Uso principal c) O FISH exige prévia extração de DNA
Detecção de d) A hibridização depende da complementaridade entre sondas e sequências alvo”
Southern blot DNA DNA isolado Radioativo/enzima
genes, mutações Resposta correta: c) — FISH não exige extração, pois atua diretamente em
Avaliar expressão cromossomos ou células fixadas.
Northern blot RNA RNA isolado Idem
gênica
Localizar genes
VII. LIMITAÇÕES DAS TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO
em
FISH DNA ou RNA Células inteiras Fluorescente
cromossomos/teci Limitação Consequência
dos Exige conhecimento da sequência-alvo Não detecta mutações desconhecidas
Expressão gênica Pode haver hibridização inespecífica Resultados falso-positivos
Microarray RNA ou DNA RNA ou DNA Fluorescente
global, triagem
Detecção de pequenas variações pode
Menor sensibilidade que PCR ou NGS
falhar
 Microarranjos de DNA (DNA Microarrays)
V. TIPOS DE MICROARRANJOS
(Resumo técnico, aprofundado, prático e aplicado)
Tipo Descrição Aplicação principal
I. O QUE SÃO MICROARRANJOS? Avaliam níveis de mRNA Oncologia, imunologia,
Os microarranjos de DNA, também chamados de biochips, são lâminas sólidas (geralmente de vidro Gene expression arrays
(expressão gênica) resposta a drogas
ou sílica) sobre as quais são fixadas milhares de sondas de DNA conhecidas. Essas sondas hibridizam Detectam polimorfismos de Farmacogenética,
com amostras de DNA ou RNA marcadas, permitindo a análise simultânea de milhares de sequências SNP arrays
base única (SNPs) ancestralidade, doenças
genéticas.
Array-CGH (comparative Detecta ganhos e perdas de Síndromes genéticas,
II. FINALIDADE E USOS genomic hybridization) DNA (deleções, duplicações) alterações cromossômicas

Aplicação Exemplos práticos VI. DIFERENCIAL DOS MICROARRANJOS

Comparar quais genes estão ativos em células Microarranjos são ideais para análises amplas, rápidas e custo-efetivas quando
Expressão gênica em larga escala
normais vs. tumorais se conhece o que se quer investigar.
Identificar polimorfismos genéticos (SNPs)
Genotipagem em larga escala Permite analisar
relacionados a doenças hereditárias
quantos genes
Perfis genéticos de câncer, farmacogenômica, Técnica Custo por gene Tempo Sensibilidade
Diagnóstico molecular simultaneamente
detecção de patógenos múltiplos
?
Diferenciar cepas microbianas ou populações
Comparação de linhagens PCR (qPCR) 1 por vez Alto Rápido Alta
humanas
Sequenciamento
III. COMO FUNCIONA A TÉCNICA? Milhões Variável Médio Muito alta
(NGS)
1. Preparação do chip
Alta (moderada
• Sondas específicas de DNA são fixadas em pontos precisos na lâmina (cada ponto = um gene ou Dezenas de
Microarray Muito baixo Rápido para mutações
sequência conhecida). milhares
2. Coleta e preparo da amostra novas)
• Coleta-se RNA mensageiro (mRNA) da amostra (ex: tecido tumoral).
• O RNA é convertido em cDNA e marcado com corante fluorescente (ex: Cy3 verde, Cy5 VII. LIMITAÇÕES
vermelho). Limitação Explicação
3. Hibridização
Só detecta o que tem sonda correspondente
• O cDNA marcado é colocado sobre o chip. Não detecta mutações desconhecidas
no chip
• Ele se liga (hibridiza) apenas às sondas complementares.
4. Leitura por scanner a laser Pode haver hibridização cruzada Leva a falsos positivos/negativos
• O chip é lido por um scanner que detecta os sinais fluorescentes. Requer validação por PCR/NGS Para confirmação dos achados relevantes
• A intensidade do sinal indica o nível de expressão gênica.
IV. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
• Se um gene está altamente expresso, o local correspondente no chip terá fluorescência intensa.
• A comparação entre dois grupos (ex: tecido normal e tumoral) permite ver:
o Genes superexpressos no câncer
o Genes reprimidos
Genes exclusivos de cada condição
 VIII. COMO CAI EM PROVAS
FÁCIL:
“A técnica de microarranjos permite:
a) Detectar apenas mutações pontuais
b) Aumentar o número de cópias de um gene específico
c) Analisar simultaneamente a expressão de milhares de genes
d) Sequenciar genomas completos”
Resposta correta: c)

MÉDIA:
“Qual das alternativas descreve uma aplicação direta dos microarranjos?
a) Detecção de proteínas por ELISA
b) Comparação da expressão gênica entre tecidos normais e cancerígenos
c) Amplificação de genes por PCR
d) Clonagem gênica em vetores plasmidiais”
Resposta correta: b)

DIFÍCIL:
“Assinale a incorreta sobre microarranjos de DNA:
a) Permitem comparar padrões de expressão gênica
b) Podem ser usados para detectar deleções cromossômicas
c) São baseados em hibridização com sondas específicas
d) Detectam qualquer mutação no genoma humano, incluindo novas mutações”
Resposta correta: d) — não detectam novas mutações, só aquelas para as quais há sonda
no chip.
 CRISPR-Cas9 V. VANTAGENS
(Resumo aprofundado, explicativo e aplicado para provas e prática científica)
Vantagem Explicação
I. DEFINIÇÃO Alta precisão Atua em locais específicos do genoma
CRISPR-Cas9 é uma técnica de edição genética que permite cortar o DNA de forma precisa em Facilidade de uso Mais simples que técnicas anteriores (como TALEN)
locais específicos e, assim, corrigir, remover ou inserir genes. Pode ser usada em praticamente qualquer
Versatilidade
CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats organismo
Cas9 = CRISPR-associated protein 9, uma endonuclease (enzima que corta DNA) Baixo custo Relativamente barato e acessível em laboratórios

II. ORIGEM NATURAL VI. LIMITAÇÕES E RISCOS

O CRISPR-Cas é um sistema imunológico adaptativo natural de bactérias e arqueas, que usam
fragmentos de DNA viral para reconhecer e cortar novos ataques virais. Limitação / Risco Detalhes
O homem adaptou esse sistema como ferramenta de engenharia genética. Cas9 pode cortar regiões semelhantes → mutações
Edições fora do alvo (off-target)
indesejadas
III. COMO FUNCIONA? Bioética Riscos em edição de embriões, seleção genética
Componentes principais: Regulação jurídica Restrita ou proibida em diversos países
Cas9 → enzima que corta o DNA
gRNA (RNA guia) → molécula de RNA sintética que orienta a Cas9 até a sequência-alvo do DNA VII. VARIANTES DA TÉCNICA
DNA alvo → sequência que será editada
Variante O que faz
Etapas:
Design do gRNA para reconhecer a sequência-alvo Cas9 nickase Corta apenas uma fita → reduz off-targets
Cas9 + gRNA se ligam ao DNA alvo Não corta → usada para regulação gênica
dCas9 (dead Cas9)
Cas9 corta ambas as fitas do DNA (dupla quebra) (ativação/inibição)
A célula tenta reparar: CRISPRa / CRISPRi Ativa ou inibe genes sem alterar DNA
o NHEJ (junção não homóloga): pode causar deleções ou inserções (knockout) CRISPR-Cas12/Cas13 Novas enzimas que atuam em DNA ou RNA
o HDR (recombinação homóloga): permite inserir sequência nova com molde (knockin) Prime editing Nova forma de edição sem causar quebras duplas

IV. PRINCIPAIS APLICAÇÕES VIII. DIFERENÇAS ENTRE CRISPR E OUTRAS TÉCNICAS

Área Exemplos
Técnica Característica-chave
Pesquisa genética "Desligar" genes para entender sua função (knockout)
CRISPR-Cas9 Edição precisa e dirigida de DNA
Correção de mutações como anemia falciforme,
Doenças genéticas RNAi Inibe a tradução (pós-transcrição)
distrofia muscular
Modificação de células imunes (ex: CAR-T contra TALEN / ZFN Técnicas mais antigas e complexas de edição
Oncologia Insere genes por vetores, sem cortar o genoma
leucemia) Clonagem molecular
Desenvolvimento de plantas transgênicas, animais diretamente
Biotecnologia
modificados
Culturas resistentes a pragas, seca ou com maior
Agricultura
produtividade
 IX. COMO CAI EM PROVA
FÁCIL:
“O CRISPR-Cas9 atua principalmente:
a) Amplificando o RNA de interesse
b) Cortando DNA em locais específicos guiado por RNA
c) Hibridizando anticorpos fluorescentes
d) Inibindo diretamente proteínas da célula”
Resposta correta: b)

MÉDIA:
“A principal enzima utilizada no sistema CRISPR é:
a) DNA polimerase
b) RNAse H
c) Taq polimerase
d) Cas9”
Resposta correta: d)

DIFÍCIL:
“No processo de edição gênica via CRISPR-Cas9, a recombinação homóloga (HDR) é usada
quando:
a) Deseja-se apenas inativar o gene
b) Quer-se inserir uma sequência exógena específica
c) Pretende-se amplificar o gene de interesse
d) Quer-se regular a expressão gênica sem cortar o DNA”
Resposta correta: b)
 Western Blot (Imunoblotting)
IV. CONTROLES IMPORTANTES
(Resumo técnico, aplicado e aprofundado)
Controle Função
I. O QUE É Verificar se foi carregada mesma quantidade de
Controle de carga
O Western blot é uma técnica de detecção e análise de proteínas específicas em uma amostra proteína
biológica. Ele combina separação eletroforética (SDS-PAGE) com detecção por anticorpos, Proteína referência Actina, tubulina, GAPDH
permitindo identificar se uma proteína está presente, em que quantidade e em qual tamanho (peso Controle negativo Sem proteína-alvo ou sem anticorpo primário
molecular). Amostra sabidamente positiva (ex: célula
É considerado o padrão ouro para validação da expressão de proteínas. Controle positivo
expressante)

II. APLICAÇÕES PRINCIPAIS V. TIPOS DE DETECÇÃO

Área Exemplo de uso
Tipo de detecção Descrição
Confirmar expressão de proteínas em células ou
Pesquisa biomédica Colorimétrica Produz cor visível no local da proteína
tecidos
Quimioluminescente (ECL) Reação emite luz captada por filme ou câmera
HIV, doenças autoimunes, detecção de prions (vaca
Diagnóstico clínico Fluorescente Anticorpos ligados a fluoróforos (ex: Alexa)
louca)
Oncologia molecular Avaliar proteínas sinalizadoras (p53, HER2, etc.) VI. VANTAGENS E LIMITAÇÕES
Validar proteínas recombinantes, produção de
Biotecnologia
anticorpos Vantagens Limitações
Neurociência Detecção de proteínas sinápticas, neurodegenerativas Alta especificidade e sensibilidade Técnica relativamente demorada
III. ETAPAS DO WESTERN BLOT Detecta proteínas por tamanho e quantidade Requer anticorpos bem validados
1. Extração de proteínas Pode comparar diferentes condições biológicas Interpretação pode variar com o fundo
• Quebra celular com detergentes e inibidores de protease. VII. DIFERENÇAS COM TÉCNICAS RELACIONADAS
• Quantificação da proteína (ex: método de Bradford).
2. SDS-PAGE (Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS) Localização ou
Técnica Detecta Base técnica
• SDS → confere carga negativa e desnatura a proteína. quantificação?
• As proteínas são separadas por peso molecular. Eletroforese + Quantificação e
Western blot Proteína específica
3. Transferência para membrana (blotting) anticorpos identidade da proteína
• Proteínas do gel são transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF. Quantificação exata (não
4. Bloqueio ELISA Proteína Anticorpos em poço
por tamanho)
• Evita ligações inespecíficas com proteínas como BSA ou leite desnatado. Anticorpo + Localização celular ou
5. Incubação com anticorpos Imunofluorescência Proteína
fluorescência tecidual
• Anticorpo primário: reconhece a proteína de interesse.
Expressão gênica (nível
• Anticorpo secundário: reconhece o primário e está ligado a uma enzima (ex: HRP). RT-qPCR mRNA Amplificação
transcricional)
6. Detecção
• A enzima do anticorpo secundário reage com substrato → gera sinal químico, fluorescente ou
quimioluminescente.
7. Análise dos resultados
Bandas reveladas correspondem à proteína alvo → intensidade = quantidade
 VIII. COMO CAI EM PROVAS
FÁCIL:
“O Western blot permite:
a) Analisar a expressão de mRNA por PCR
b) Detectar proteínas específicas por anticorpos após separação eletroforética
c) Clonar genes em plasmídeos
d) Identificar DNA por hibridização com sonda”
Resposta: b)

MÉDIA:
“Para confirmar a presença da proteína p53 em uma linhagem celular após irradiação, a técnica mais adequada é:
a) RT-PCR
b) ELISA
c) Western blot
d) Southern blot”
Resposta: c)

DIFÍCIL:
“Na detecção de proteínas por Western blot, o uso de anticorpo secundário conjugado com peroxidase visa:
a) Romper ligações de dissulfeto
b) Ativar a fluorescência do anticorpo primário
c) Gerar um sinal detectável após reação com substrato
d) Facilitar a migração da proteína no gel”
Resposta: c)
 ELISA — Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Exemplo de ELISA indireto (anticorpos):
• Antígeno viral é fixado na placa
(Resumo detalhado, didático e com aplicação prática)
• Soro do paciente é adicionado
• Se o paciente tem anticorpos → eles se ligam
I. DEFINIÇÃO • Anticorpo secundário marcado + substrato → coloração
O ELISA é uma técnica imunológica que permite detectar e quantificar proteínas, antígenos, • Leitura por espectrofotômetro
anticorpos ou hormônios em soluções, utilizando a especificidade da ligação antígeno-anticorpo e a
ação de enzimas que geram sinal detectável (cor). V. COMPONENTES TÍPICOS
“ELISA” significa: ensaio imunoenzimático ligado a enzima em fase sólida.
Componente Função
Antígeno ou anticorpo Alvo da reação
II. PRINCIPAIS USOS
Anticorpo primário Reconhece o antígeno específico
Área Exemplos práticos Anticorpo secundário Ligado a enzima (ex: HRP, fosfatase alcalina)
Diagnóstico clínico HIV, hepatites, dengue, COVID-19, Zika, sífilis Produz cor ao ser convertido pela enzima (ex:
Endocrinologia Dosagem de TSH, insulina, HCG, cortisol Substrato cromogênico
TMB)
Imunologia Pesquisa de anticorpos IgG/IgM Espectrofotômetro Quantifica intensidade da cor (leitura óptica)
Quantificação de citocinas, fatores de crescimento,
Pesquisa biomédica
etc. VI. CONTROLES E CUIDADOS
Testes de contaminação biológica em alimentos ou Fonte de erro comum: lavagem inadequada → falso positivo/negativo
Controle de qualidade
vacinas
Controle Função
III. PRINCÍPIO GERAL Controle positivo Confirma que o sistema está funcionando
Um antígeno ou anticorpo é fixado numa placa (fase sólida). Controle negativo Verifica ausência de reatividade indesejada
A amostra é adicionada → se o alvo estiver presente, ele se liga. Padrões (curva padrão) Permite quantificação exata
Um anticorpo marcado com enzima é adicionado → liga-se ao alvo.
Adiciona-se o substrato da enzima, que gera uma cor ou sinal detectável. VII. VANTAGENS E LIMITAÇÕES
A intensidade da cor é proporcional à quantidade da substância.
Vantagens Limitações
IV. TIPOS DE ELISA Alta sensibilidade e especificidade Exige reagentes de alta qualidade
Custo acessível e fácil automação Pode haver reações cruzadas
Tipo Como funciona Usos principais
Quantitativo e qualitativo Interpretação errada sem curva padrão
Antígeno fixado + anticorpo Rápido, mas pouca amplificação de
Direto Amplo uso clínico e laboratorial Requer equipamentos (leitor de placa)
marcado sinal
Antígeno fixado + anticorpo VIII. COMPARAÇÃO COM OUTRAS TÉCNICAS
Indireto Mais sensível e econômico
primário + anticorpo secundário Técnica Detecta Tipo de amostra Localização celular? Quantificação?
Anticorpo fixado + antígeno da Proteínas solúveis (ex:
Muito sensível → usado para ELISA Soro, plasma, saliva Não Sim
Sanduíche amostra + segundo anticorpo anticorpos)
proteínas, hormônios
marcado Proteína específica +
Western blot Lisado celular Não Semi-quantitativo
Antígeno da amostra compete com Quantifica pequenas moléculas (ex: peso molecular
Competitivo Células/tecidos
antígeno marcado pelo sítio toxinas) Imunofluorescência Proteína in situ Sim Visual
inteiros
 IX. COMO CAI EM PROVAS
FÁCIL:
“A técnica de ELISA é baseada na:
a) Ligação entre anticorpo e antígeno, com detecção enzimática
b) Hibridização de DNA com sondas fluorescentes
c) Eletroforese de proteínas por carga
d) Amplificação de RNA viral”
Resposta correta: a)

MÉDIA:
“Na técnica de ELISA do tipo sanduíche, o alvo detectado na amostra é:
a) Um anticorpo secundário marcado
b) Um antígeno específico
c) O substrato da enzima
d) Um DNA complementar”
Resposta correta: b)

DIFÍCIL:
“Qual vantagem o ELISA do tipo indireto apresenta sobre o tipo direto?
a) Menor número de etapas
b) Maior risco de contaminação
c) Maior amplificação do sinal e sensibilidade
d) Dispensa uso de anticorpo secundário”
Resposta correta: c)