INSTITUTO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR DE BRASÍLIA

BACHARELADO EM BIOMEDICINA
MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA CLÍNICA
PROF: JHONES N. DIAS

Nome: MISAEL MELO NASCIMENTO

PLACAS- AULA PRÁTICA MICROBIOLOGIA

Introdução

A fase pré-analítica deve ser realizada de forma condizente e padronizada, já que a

contaminação pode acontecer em decorrência de uma falha humana ou de equipamento, que
existe em maior probabilidade nesta fase, colocando em risco a saúde do paciente. O falso
diagnóstico (positivo ou negativo) devido a algum erro na fase pré-analítica gera uma
sequência de tentativas de soluções, sendo a mais grave delas o uso de antibióticos sem
necessidade (falso positivo), podendo levar à resistência bacteriana, ou ao atraso no início de
um tratamento realmente necessário (falso negativo). Assim, a relevância dos erros
pré-analíticos como problema de saúde pública fica patente tanto como dano potencial aos
pacientes quanto nos custos ao sistema de saúde, ambos desnecessários e evitáveis (Soderberg
et al, 2009).
A possibilidade de cultivar um determinado microrganismo em laboratório é essencial para o
seu isolamento e caracterização do ponto de vista morfológico, fisiológico, bioquímico ou
genético. Deve ter-se em consideração que, dependendo das condições de cultura, o
microrganismo em estudo vai revelar diferentes características. Assim, a cultura de um
microrganismo em laboratório constitui o primeiro passo que vai conduzir ao seu estudo. É
também a partir desta cultura que este pode ser classificado e se pode proceder à identificação
da espécie a que pertence.
Os meios de cultura que se utilizam em laboratório e em condições controladas, podem ser
sólidos ou líquidos. Os meios de cultura sólidos são usados para contagem de colónias de
microrganismos e para a multiplicação, isolamento e conservação dos microrganismos
isolados. O isolamento de determinados microrganismos é conseguido com maior rapidez e
eficácia se for realizado em meios de cultura selectivos/diferenciais.
Os meios de cultura líquidos possibilitam o desenvolvimento de espécies contidas em
populações mistas e permitem a realização de estudos de crescimento e nutrição. A
capacidade de manter no laboratório culturas é fundamental para uma boa prática
microbiológica. A concretização eficaz deste método é crucial por razões de segurança e
manutenção da qualidade dos trabalhos a desenvolver.
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Objetivos
Realizar coleta de amostras com os dedos indicados na placa, seguindo as instruções
corretamente;
Preparação de culturas com estrias em placas já inoculadas em cada divisão;
Realizar a coloração de gram;
Observar e analisar microscopicamente as bactérias;
Identificar as espécies de bactérias e qual grupo e gênero compreende.

Desenvolvimento
Preparo de colônia de bactérias a partir dos dedos

Protocolo 1: Preparação do meio de cultura

Como a placa já estava pronta com ágar, não foi necessário preparar o meio de cultura
(geralmente ágar nutritivo).

Protocolo 2: Marcação da placa

Na parte de baixo da placa (lado do ágar), foi utilizado uma caneta para marcar o nome e
possíveis divisões ( mão lavada vs mão suja), dividido em 4 números.

Protocolo 3: Inoculação com os dedos (com Bico de Bunsen)

1. Com ajuda de outro colega para abrir a placa de petri bem próximo ao fogo, assim que
aberto, um toque suave com a ponta do dedo indicador ou polegar sujo no número 1, fazendo
leve pressão, o outro colega sempre próximo ao fogo para evitar contaminações externas;

2. Com o mesmo dedo higienize com água e sabão, secando com um papel e inoculando no
número 2.

3. Agora higienizado com álcool 70%, aguardando secar por completo, depois tocando na
marcação de número 3.

4. A marcação de número 4 irá servir como controle da amostra.

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Protocolo 4: Incubação

Depois de feito e fechado a placa de petri, foi colocado em uma estufa a 35–37°C por 24–48
horas

Protocolo 5: Observação dos resultados

Após o tempo de incubação, observe o crescimento de colônias, cada ponto ou mancha visível
é uma colônia bacteriana que se originou de uma célula ou grupo de células dos dedos ( foi
observado um coccus posteriormente).

Preparo de culturas com estrias em placas já inoculadas (esgotamento)

Protocolo 1: Esterilização da alça de platina

Após os procedimentos feito pelo professor, usando alça de platina flambe no bico de Bunsen
até incandescente para esterilizar por completo, esperando esfriar (pode tocar rapidamente no
meio estéril para isso), mas é necessário esperar para não matar as bactérias no momento que
fazer a coleta.

Protocolo 2: Coleta da amostra

Tocando com a alça em uma área onde há crescimento bacteriano (pode ser uma colônia
visível ou área mais densa).

Protocolo 3: Estrias nos setores (esgotamento)

fazer estrias simples ou em zigue-zague dentro de cada divisão da placa ao lado do bico de
bunsen, após cada estria pode esterilizar a alça novamente (ou usar uma nova) para evitar
cruzamento entre os setores, o objetivo é espalhar bem a amostra para obter colônias isoladas
nas extremidades das estrias até esgotar ao máximo todas as bactérias.​

Protocolo 4: Incubação

Colocar as placas na estufa (35–37°C) por 24–48h com a tampa virada para baixo (água de
condensação não pinga no meio) e esperar até crescer as colônias.
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Protocolo 5: Observação dos resultados

Crescimento bacteriano por área e isolamento de colônias.

Coloração de gram (positivas e negativas)

Protocolo 1: Preparo do esfregaço bacteriano

Com alça estéril, retire uma pequena quantidade da colônia bacteriana, espalhe sobre a lâmina
com uma gota de água (caso a amostra esteja muito espessa), formando uma película fina e
deixando o ar secar.

Protocolo 2: Fixação da lâmina

Passe rapidamente a lâmina (com a amostra virada para cima) na chama do Bunsen 2 a 3
vezes, isso fixa as bactérias à lâmina e mata os microrganismos.

Protocolo 3: Coloração

Cristal violeta: cobrindo o esfregaço e deixando agir por 1 minuto, logo após enxágue com
água.
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Lugol (solução iodada): cubra a lâmina e deixe por 1 minuto, enxágue com água. (O lugol
age como mordente, fixando o cristal violeta na parede celular.)​

Descorante (álcool ou álcool-acetona): aplique por 10–20 segundos e imediatamente

enxágue com água. (Gram-negativas perdem o corante; Gram-positivas o retêm.) As gram
positivas tem a parede celular Espessa, com várias camadas de peptidoglicano e as gram
negativas a parede celular Fina, com uma camada mais estreita de peptidoglicano, isso faz
com que elas percam a coloração do cristal violeta​

Safranina: cubra e deixe agir por 1 minuto, enxágue com água. Esse é o momento que as
gram negativas se coram de vermelhas ou rosas por causa da sua camada fina da parede
celular.

Protocolo 4: Secagem

Aguardando a secagem ao ar.

Análise e identificação das bactérias no microscópio

Protocolo 1: lâmina no microscópio

Com a parte da amostra voltada para cima, ajustar a platina e o foco até visualizar a amostra
em campo nas objetivas menores até a de 40x, fazendo o foco fino.

Protocolo 2: Aplicação do óleo de imersão

Gire a objetiva para o espaço entre 40x e 100x, pingando 1 gota de óleo de imersão
diretamente sobre a amostra na lâmina, para observar os detalhes das bactérias (cor, forma,
agrupamento).

Foram observadas as seguintes bactérias:

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klebsiella pneumoniae

É uma espécie de bactéria gram-negativa, encapsulada, anaeróbia facultativa em forma de

bastonete. É o mais importante membro do género Klebsiella e importante membro da
Família das enterobactérias, é uma bactéria anaeróbica facultativa, ou seja que precisa do
oxigênio para crescer, porém pode se adptar se não houver oxigênio, ela é positiva para
catalase, isso significa que possuem a enzima catalase, que decompõe o peróxido de
hidrogênio em água e oxigênio. Fermenta açúcares como lactose e sacarose.

Escherichia coli

Escherichia coli, é uma bactéria bacilar Gram-negativa que se encontra normalmente no trato
gastrointestinal inferior dos organismos de sangue quente, pertence a família
Enterobacteriaceae, é uma bactéria anaeróbia facultativa, catalase positiva, e também
fermenta lactose, produzindo ácido e dióxido de carbono. A fermentação da lactose pode ser
verificada pela formação de gás e/ou ácido em meios de cultivo contendo lactose. O ácido
produzido pela fermentação da lactose faz com que o indicador vermelho de fenol no ágar
fique amarelo. O dióxido de carbono é observado como bolhas ou rachaduras no ágar e em
meios de cultura contendo lactose, as espécies que fermentam lactose desenvolvem colônias
rosadas.

Obs:

A E. coli também pode não fermentar lactose. Um estudo do PubMed Central sugere que a E.
coli não fermentadora de lactose é tão capaz quanto as formas fermentadoras de lactose de
causar infecções.
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Referências bibliográficas

Alcântara, F.; Cunha, M.A.; Almeida, M.A. (2ª edição).Microbiologia: Práticas Laboratoriais.
Edições Universidade de Aveiro, Portugal.

Lopes, A. M. e Fonseca, A. (1996) Biologia Microbiana. Universidade Aberta; Portugal.

Madigan, M. T., Martinko, J. M. e Parker, J. (10ª edição). Brock - Biology of

Microorganisms. Prentice Hall international, New Jersey.

MAZUMDER, R. et al. Non-lactose fermenting Escherichia coli: Following in the footsteps

of lactose fermenting E. coli high-risk clones. Frontiers in Microbiology, v. 13, 3 nov. 2022.

Soderberg, J.; Brulin, C.; GranKvist, K.; Wallin, O. Preanalytical errors in primary health
care: a questionnaire study of information search procedures, test request management and
test tube labelling. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 479(2):195-201, 2009.