1 INTRODUÇÃO
A eletroforese é uma técnica baseada na separação de partículas, que ocorre
quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas em um eletrólito, através do qual
uma corrente elétrica é aplicada. É também usada na identificação de substâncias,
no estudo de homogeneidade de sistemas biológicos e na determinação de pontos
isoelétricos (MARIN et al, 2009).
A visualização do DNA por eletroforese baseia-se na carga negativa que os
fosfatos conferem ao DNA. Um gel é preparado com pequenos poços – utiliza-se um
pente antes de o gel secar – para a deposição do material. O gel é então submetido
a uma diferença de potencial elétrico. A presença da carga negativa deve ser
combinada com a adição de solução salina para maior eficiência na condução
elétrica. Posteriormente, há um deslocamento dos ácidos desoxirribonucléicos de
acordo com o tamanho das moléculas, as de menor massa apresentam maior
velocidade de migração enquanto as de maior massa são mais lentas (SANDOVAL
et al, 2009).
O tipo de matriz que é usada (agarose ou poliacrilamida) depende do
tamanho dos fragmentos de DNA que se pretende separar e visualizar. Devido à
diferença no tamanho dos poros dessas matrizes, utiliza-se normalmente o gel de
agarose para a separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb (1 kb = 1000
pares de bases) e o gel de poliacrilamida para separação de fragmentos pequenos,
de até 1kb. Alternativamente para a resolução de fragmentos superiores a 1 kb
podese utilizar a agarose com baixo ponto de fusão que é um tipo de agarose
derivada de síntese orgânica (CORRÊA; POSSIK, 2019).
Apesar de ser mais efetivo para separar fragmentos pequenos, o gel de
poliacrilamida apresenta algumas desvantagens. Entre elas, destaca-se o fato da
poliacrilamida em solução, isto é, quando não polimerizada, ser neurotóxica. Assim,
a preparação do gel exige certa cautela. Além disso, a preparação é mais laboriosa,
requerendo a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida para ajudar na
polimerização e mais tempo para que a polimerização ocorra propriamente.
Já o gel de agarose é feito apenas através da mistura de um tampão e
agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é mais rápida e o gel pode
ser reciclado após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração de outros géis.
Além disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como método analítico
ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir
do gel.
Entretanto, dependendo do método utilizado para a visualização do DNA, o
gel de agarose pode ser desvantajoso. Frequentemente se utiliza a coloração com
brometo de etídio (EtBr), uma substância mutagênica. Em adição, para a
visualização do DNA corado com EtBr, é necessária a utilização de transiluminador
de luz ultravioleta. Para a utilização de tal aparelho e para a o uso do brometo de
etídio, é necessário o cuidado com a biossegurança não somente do manipulador,
mas de todos os que compartilham o uso do laboratório.
2 METODOLOGIA
2.1 Materiais
2 amostras de DNA (1 funcional e 1 preparada na aula anterior [1000pb])
Gel de agarose (pó)
100 ml de água (50ml fria, 50ml quente)
500ml de solução tampão TAE (evita variações de pH)
Peso molecular (para comparar o peso do fragmento que foi extraído e
amplificado)
Tampão de carreamento (deixa a molécula mais pesada e faz ela adentrar no
gel melhor)
2 Pipetas eletrônicas
Cuba de eletroforese
Suporte para gel de agarose
Fonte
2.2 Métodos
O gel de agarose foi preparado pela professora anteriormente. Para isso foi
necessário misturar o pó a 50ml de água quente e depois a 50ml de água fria.
Ele foi deixado em um aquecedor magnético até o momento do início da aula;
Quando a aula se iniciou o primeiro passo foi prepara as amostrar. Então em
um tubo (1ª amostra) colocamos o DNA extraído por nós na aula passada
(10µm) e 6µm de tampão de carreamento. Na 2ª amostra colocamos 10µm do
DNA funcional e 6µm do tampão de carreamento;
Depois disso colocamos o gel em um suporte, juntamente com um pente
(para formar canaletas) e esperamos esfriar e endurecer;
Quando endureceu retiramos o pente e as laterais do suporte;
Colocamos esse suporte na cuba de eletroforese que já estava com solução
tampão TAE;
Após colocar o suporte terminamos de colocar TAE, até cobrir o gel;
O próximo passo então foi colocar as amostras nas canaletas (16µm de DNA
funcional com tampão de carreamento; 16µm de DNA extraído por nós com
tampão de carreamento; 10µm de padrão de peso molecular com tampão de
carreamento);
Feito isso, fechamos a cuba, conectamos os polos positivos e negativos e
ligamos a fonte a 20V por 20 minutos e depois essa voltagem teria que ser
alterada para 70V e as amostras correriam por 2 horas.
3 DISCUSSÃO
Ao deixar o gel de agarose esfriar acabamos congelando o gel e tivemos que
produzir um gel de amido com ágar ágar. Esse tipo de gel não é mais utilizado, pois
as amostras demoram muito a correr nele.
Ao término deste trabalho de pesquisa concluímos que a eletroforese é um
processo analítico de separação de misturas, cujo principal agente é o campo
elétrico. Essa técnica passou por evoluções, com a introdução de um suporte como
papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido
ou poliacrilamida, entre outros.
Atualmente o campo de aplicação da eletroforese tem sido amplamente
difundido, devido á simplificação de aparelhagem utilizada e também á
disponibilidade de meios de suporte altamente purificados, o que veio diminuir em
muito o tempo gasto na separação.
A eletroforese é de grande importância para as ciências, permitindo a
separação e identificação de moléculas de DNA por meio da diferença de velocidade
de migração, identificação de pessoas em testes de paternidade pela comparação
de DNA, na indústria farmacêutica e até mesmo na agropecuária.
4 CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS
RELATÓRIOS DE AULA PRÁTICA:
PCR
1 INTRODUÇÃO
Reação em cadeia da polimerase ou Polymerase Chain Reaction - PCR é
uma técnica utilizada na biologia molecular para amplificar uma única cópia ou
algumas cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando
milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA.
O PCR é agora uma técnica comum e frequentemente indispensável usada
em laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações.
Estes incluem a clonagem de DNA para sequenciação, clonagem e manipulação de
genes, mutagênese de genes; construção de filogenias baseadas em DNA, ou
análise funcional de genes; diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias;
amplificação do DNA antigo; análise de impressões digitais genéticas para o perfil de
DNA (por exemplo, na ciência forense e teste de parentesco); e detecção de
patógenos em testes de ácido nucleico para o diagnóstico de doenças infecciosas
(SANTANA, 2018).
A grande maioria dos métodos de PCR dependem do ciclo térmico, o que
envolve a exposição dos reagentes a ciclos de aquecimento e resfriamento
repetidos, permitindo diferentes reações dependentes da temperatura -
especificamente, a fusão do DNA e a replicação de DNA orientada por enzimas -
para prosseguir rapidamente várias vezes em sequência. Os iniciadores (fragmentos
de DNA curtos) que contêm sequências complementares à região alvo, juntamente
com uma polimerase de DNA (por exemplo, Taq polimerase), após o qual o método
é designado, permitem amplificação seletiva e repetida. O PCR representa uma
forma de "clonagem in vitro" que pode gerar, bem como modificar, fragmentos de
DNA de comprimento definido e sequência em uma simples reação automatizada.
Além de suas muitas aplicações na pesquisa biológica molecular básica, o PCR
promete desempenhar um papel crítico na identificação de sequências medicamente
importantes, bem como um diagnóstico importante na sua detecção (WIKIPEDIA,
2019).
2 METODOLOGIA
2.1 Materiais
5 tubos ependorf
Água (diluente)
Solução tampão (mantém o pH)
Cloreto de magnésio (co-fator)
Oligonucleotídeos
Primer (se liga por complementariedade ao fragmento a ser amplificado)
Taq Polimerase
Capela de fluxo laminar
Termociclador
2.2 Métodos
Deixamos a mistura da extração na capela de fluxo laminar por 20 minutos
com a luz UV;
Após isso, retiramos apenas o DNA extraído e colocamos no fundo de cada
tubo ependorf;
Sendo assim adicionamos no primeiro tubo somente 8µm de água; no
segundo tubo 8µm solução tampão com 8µm de água (para diluir); no terceiro
tubo 10µm de água e 8µm de cloreto de magnésio; no quarto tubo 8µm de
primer reverso com 8µm de água e 8µm de primer forward com 8µm de água;
no quinto tubo 8µm de dNTP e 10µm de água; no sexto tudo taq polimerase e
8µm de água; no sétimo somente a amostra de DNA extraída;
Após isso, unimos no primeiro tubo que continha apenas 8µm de água, 4µm
de tampão diluído, 2µm de cloreto de magnésio, 2µm do primer reverso, 2µm
do primer forward, 4µm de dNTP, 2µm de taq polimerase diluída e 2µm de
DNA;
Colocamos esse tubo na geladeira e depois disso no termociclador para fazer
35 ciclos.
3 DISCUSSÃO
Compreendemos que a técnica de PCR é bastante eficaz nas suas diversas
aplicabilidades, uma técnica precisa e confiável, onde ajuda na resolução de várias
situações problema, como testes de paternidade, diagnósticos moleculares para
várias patologias entre outras, também pode-se aprender um dos protocolos de
extração do DNA. Posso afirmar a aptidão adquirida em executar tais protocolos de
maneira precisa e exata tal como, nos foi mostrado no decorrer das aulas, tendo,
portanto, o máximo de aproveitamento das aulas práticas, podendo assim redigir o
relatório em questão.
4 CONCLUSÃO
Sendo assim, observamos que, com os materiais supracitados, foi possível
realizar o preparo para a eletroforese. E percebemos que a prática laboratorial é de
suma importância para nossa formação acadêmica e profissional, pois foi
desenvolvido de forma eficiente. Além disso, a prática nos permitiu familiarização
com métodos usados em laboratórios e nos trouxe resultados satisfatórios e
esperados, alcançando assim o objetivo da aula.
REFERÊNCIAS
SANTANA, Ernesto da Silva. Relatório de Tecnologia Genética: Diagnóstico Molecular e
Bioinformática. Rio de janeiro, 2018. Disponível em: <https://www.academia.edu
/36558325/Relat%C3%B3rio_PCR.pdf>. Acesso em: 08 de dezembro de 2019.
WIKIPEDIA. Reação em cadeia da polimerase. 2019. Disponível em: <https://pt.wikipedia.
org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase>. Acesso em: 08 de dezembro
de 2019.
