1/2021
Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
Como obter o DNA e analisá-lo.
Extração de DNA de Sangue Total – Método “Salting Out” (modificado)
Modificado de Miller et al, 1988 – NAR 16:1215
1. Volume Inicial de sangue 750 ul em 750 ul de Buffer A
2. Misturar e manter em gelo por 2 minutos
3. Centrifugar a 5000 RPM, durante 15 minutos (6000 rpm por 5 min.)
4. Descartar o sobrenadante com CUIDADO para NÃO perder o pellet
5. Ressuspender o pellet em 700 ul de Buffer A
6. Centrifugar a 5000 RPM, durante 15 minutos (6000 rpm por 5 min.)
7. Descartar o sobrenadante com CUIDADO para NÃO perder o pellet
Buffer A (pH=7,6)
0,32 M Sacarose
10 mM ou 0,01M de Tris HCl pH 7.6
5 mM ou 0,005M MgCl2
1% de Triton X 100
8. Ressuspender o pellet em 350 ul de Buffer B
9. Adicionar 35 ul de SDS 10% e 5,5 ul de Proteinase K (10mg/ml estoque)
10. Incubar a 37 ºC over night (ou 55 ºC durante 60 min)
Buffer B (pH=8,0)
25 mM EDTA pH 8,0
75 mM NaCl
11. Adicionar 100 ul de NaCl Saturado (Aproximadamente 6M). Agitar
por 15 seg.
12. Centrifugar a 2500 RPM por 15 minutos (4000 rpm por 8 minutos)
13. Transferir o sobrenadante para outro tubo de 1,5ml (cerca de 450 ul)
14. Adicionar 2x o volume de etanol - 900 ul (gelado – 95%)
15. Inverter o tubo até precipitar o DNA
16. Centrifugar a 2500 RPM durante 2 minutos (4000 rpm por 2
minutos)
17. Repetir os procedimentos 14, 15 e 16 com etanol a 70%
18. Descartar o etanol e deixar o restante evaporar
19. Adicionar 100 ul do Tampão TE
20. Incubar durante 1 hora em banho-maria à 37 ºC
21. Centrifugar (spin) durante 30seg
Fonte: [Link]
content/uploads/sites/4/2020/04/PreQC-
[Link]
Utiliza um DNA de concentração conhecida (Lambda DNA 20 ng/ul e 100 ng/ul) para
comparação de intensidade da banda.
Foram aplicados 3 ul de cada Lambda e de cada amostra em um gel de agarose 1%.
1- 3 ul de DNA a 20ng/ul = 60 ng de DNA
1 2 3 4 5 6
2- 3 ul de DNA a 100ng/ul = 300 ng de DNA
Por comparação, estima-se a concentração das amostras extraídas:
3- ~500 ng de DNA Em 3ul. Então, 167 ng/ul de amostra
4- ~800 ng de DNA Em 3ul. Então, 267 ng/ul de amostra
5- ~50 ng de DNA Em 3ul. Então, 17 ng/ul de amostra
6- ~600 ng de DNA Em 3ul. Então, 200 ng/ul de amostra
É um espectrofotômetro que mede a absorbância da luz em um determinado comprimento
de onda.
260 nm – ácidos nucleicos 280 nm – proteínas 230 nm – Fenol, Guanidina, EDTA,
Carboidratos
Pela razão 260/280 pode-se inferir a
pureza da amostra:
DNA mais puro > 1,8
Razão < 1,8 – indica contaminação por
proteínas
É um fluorômetro.
As amostras são misturadas a fluoróforos que
se ligam especificamente à molécula a ser
quantificada. DNA, RNA ou Proteína
PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Desenvolvida em 1983 por
Kary Mullis (1944 – 2019)
Prêmio Nobel de Química em
1993
Clonagem in vitro de
determinada sequência
de DNA – amplificação
exponencial
REAÇÃO EM
PCR
CADEIA DA
POLIMERASE
UTILIZAÇÃO DE UM PAR DE
PRIMERS QUE FLANQUEIAM A
REGIÃO DE INTERESSE
POR AÇÃO DA DNA
POLIMERASE, AS FITAS SÃO
EXTENDIDAS PELA
INCORPORAÇÃO DE dNTPs
APÓS VÁRIOS CICLOS TEM-SE
BILHÕES DE CÓPIAS DA
REGIÃO DESEJADA
Como acontece?
Sentido 5’-3’ do primer!!!!
A Taq polimerase
- Isolada da bactéria Thermus
aquaticus Morning Glory Pool, Yellowstone
National Park, Wyoming, USA
- Como é uma enzima termoestável,
veio resolver o problema de se ter Replicação a 70-74°C,
mas aguenta até 40 min
que acrescentar novamente a a 95°C
polimerase no início de cada ciclo da
PCR.
- Comprada junto com o tampão e o
MgCl2 (que pode vir misturado ao
tampão). Geralmente recombinante.
PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
DO QUE PRECISAMOS?
Primers
DNA molde
Tampão
MgCl2 (cofator da Taq)
dNTPs
Taq-polimerase
VARIAÇÕES DE TEMPERATURA Termociclador:
Desnaturação (96 ºC) as temperaturas
25-30x Anelamento (48 – 62ºC) e o número de
Extensão (72ºC) ciclos são
programados
PCR – POLYMERASE CHAIN REACTION
•
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
Exemplo de PCR
Volume Final conc.
Component
1X
10X PCR buffer minus Mg 10 μl
10 mM dNTP mixture 2 μl 0.2 mM each
1.5 mM
50 mM MgCl2 3 μl
Primer mix (10 μM each) 5 μl 0.5 μM each
Template DNA
1–20 μl n/a
Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 0.2–0.5 μl 1.0–2.5 units
Autoclaved distilled water to 100 μl n/a
[Link]
amplification-and-expression-profiling/pcr-protocol/taq-dna-polymerase
Como programar o termociclador?
Desnat. Inicial • 95ºC – 5 min
Desnaturação • 95ºC – 1 min
Anelamento • 45 – 60ºC* – 30 seg Repetir 30 a 35 vezes
Extensão • 72ºC – 20 seg a 1 min
Extensão final • 72ºC – 5 min
• 4ºC
*
[Link]
OTIMIZAÇÃO DA PCR
• Aumenta a eficiência da reação (produção)
• Aumenta a especificidade
• Melhora a reprodutibilidade
PRIMEIRO PASSO – TEMPERATURA
DE ANELAMENTO DO PRIMER. PCR DE GRADIENTE
Temperatura de anelamento = 5ºC abaixo do Tm real dos primers
> CONTEUDO DE GC = >TM
OTIMIZAÇÃO DA PCR
Se não conseguir
bom resultado com o
ajuste da TA, parte-se
ajuste de outros
parâmetros da
reação (concentração
de dNTP, MgCl,
composição do
tampão, etc)
COMO VERIFICAR SE A PCR FUNCIONOU?
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
- O DNA vai ser conduzido por corrente elétrica através de um gel de
agarose que conduz a eletricidade, mas cria uma resistência.
OS FRAGMENTOS MENORES (menor massa
molecular) TEM MAIS FACILIDADE EM MIGRAR
ATRAVÉS DO GEL E SÃO MAIS RÁPIDOS.
UMA SUBSTÂNCIA FLUORESCENTE (BROMETO DE
ETÍDEO, GEL RED, SYBR GREEN) MISTURADA À
AMOSTRA SE LIGA AO DNA E FAZ COM QUE ELE
SEJA VISÍVEL QUANDO EXPOSTO À LUZ UV.
[Link]
LADDER – MARCADOR DE PESO MOLECULAR
O peso molecular de um fragmento é inversamente proporcional à
sua taxa de migração em uma malha de gel.
• Geralmente obtidos
através da digestão de
DNA de plasmídeos.
• Existem várias marcas e
vários tipos de ladders, com
fragmentos de tamanho
variados.
Variação de tamanho (inserção/deleção)
