Controle de qualidade biológico e microbiológico

Aula 1
Ensaios biológicos
São procedimentos destinados a avaliar a potência de princípios ativos contidos nas matérias-primas e preparações
farmacopeicas, utilizando reagentes biológicos tais como micro-organismos, animais, fluidos e órgãos isolados de
animais. É baseado na atividade biológica das moléculas.
Ensaios biológicos  bioensaios
Preparações farmacopeicas
Procedimentos  avaliar a potência de princípios ativos
Matérias primas

Regentes biológicos  microrganismos, animais, fluidos, sangue, células, órgãos isolados

Potência  é a atividade biológica, ação da molécula sobre determinado parâmetro
 Exemplo:
 Determinação de potência de sulfato de neomicina (mistura de substancia: neomicina B, neamina,
neomicina C, neomicina D, neomicina E, neomicina LP b e LPc). Nesse caso, o sulfato de neomicina é
um conjunto de substancias que possuem potencial antimicrobiano mas em níveis diferentes. É
possível determinar a potência das neomicinas através de HPLC

Doseamento microbiológico – Exemplo: cálculo da potência através da variação do diâmetro do halo e da

concentração de um antibiótico em um antiobiograma. Em um antibiograma é possível determinar a potencia da
molécula do antibiótico interagindo com o reagente microbiológico que no caso é o microrganismo
Potência x teor
Potencia está relacionado com doseamento microbiológico e teor está relacionado com doseamento físico químico. O
fundamento do método modifica de acordo com o procedimento. O fundamento do método em doseamento
microbiológico é baseado na atividade biológica da molécula/antimicrobiana.
Regentes biológicos  microrganismos, animais, fluidos, órgãos isolados

Variabilidade (tempo, dos indivíduos testados, modo de realização do teste)

Variabilidade de ensaios biológicos > variabilidade de testes físico químicos

 Padrões de referencia para determinação de teor e potencia

 Métodos estatísticos para analisar a precisão dos resultados obtidos
 A característica dos reativos biológicos é sua variabilidade, por exemplo, o tempo. Enquanto os reativos
físico-químicos podem ser definidos e padronizados para fornecerem resultados idênticos em todos os
laboratórios, é impossível definir totalmente os reagentes biológicos, apesar dos esforços de entidades
internacionais nesse sentido. Essa variabilidade inerente aos reativos biológicos torna imprescindível: 1) o
emprego de padrões de referência adequados para se obter potências relativas e 2) o emprego de métodos
estatísticos para os delineamentos experimentais e analise dos resultados.
Padrões de referência – Definição
Propriedade  comparação e padrão de amostra
Pureza elevada e conhecida
Produtos Estáveis quanto possíveis
Estabelecidos e distribuídos a autoridades farmacopeicas
Ensaios biológicos
 Comparação: potência da preparação da amostra X potencia da preparação do padrão
 Padrão e amostra  analisados em paralelo no mesmo dia
 Padrão de referência
 Primário  farmacopeia, OMS
 Secundário  matéria prima padronizada, mais barato, a partir de um padrão primário
Aula 2
Delineamentos experimentais
O delineamento de um ensaio compreende: a) seleção do conjunto de doses do padrão (P) e das amostras do
desconhecido (A) que serão ensaiados; b) especificação das unidades experimentais (animais, micro-organismos,
antissoros, sangue etc.); c) regras pelas quais se distribuirão as doses para as unidades experimentais; d) especificações
das medidas ou outros registros que devam ser procedidos em cada unidade experimental. O melhor delineamento
experimental é aquele que produz a informação desejada com a maior eficiência. Por dificuldades práticas, pode ser
impossível alcançar esse objetivo. Portanto, para cada ensaio podem empregar-se diferentes delineamentos
experimentais, de acordo com a disponibilidade de pessoal, reagentes e tempo. Todos os delineamentos que forneçam
ensaios válidos e de precisão adequada como resultado são cientificamente aceitáveis. Além disso, devem
compreender algum sistema que assegure distribuição ao acaso das unidades experimentais para as diversas doses
utilizadas.
 Planejamento do experimento
 Doses do padrão (P) e amostra (A)
 Reagentes biológicos (RB)  necessidade de réplicas. O reagente biológico varia de método para
método. O n é superior a 1
 Distribuição das doses para os RB. Dependendo da forma como é feito pode impactar na analise do
resultado
 Medidas e outros registros realizados em cada RB.
Delineamentos experimentais- tipos (Como o procedimento deve ser executado e como analisar o resultado)
Delineamento inteiramente ao acaso
 Conhecido também como delineamento inteiramente casualizado
 Delineamento mais simples e comum
 Distribuição dos tratamentos é irrestritamente ao acaso/aleatória. Não há critério especifico para definir.
Haverá interferência da variação da fonte.

Ensaios biológicos  diferentes casos

Tratamento P (grupo P)
RB (camundongos)
Tratamento A (grupo A)

Sorteio
Delineamento em blocos ao acaso
Possibilita segregar uma fonte de variação tal como a sensibilidade de diferentes ninhadas de animais ou a variação
entre as placas de Petri no ensaio microbiológico por difusão. Esse planejamento obriga que cada tratamento seja
aplicado uma vez em cada bloco (ninhada, placa, etc.) e só pode ser realizado quando o bloco for suficientemente
grande para acomodar todos os tratamentos.
 Conhecido também como delineamento em blocos casualizados
 Possibilita segregar uma fonte de variação (bloco) dentro de uma condição analítica em que o doseamento é
executado. Essas condições analíticas podem interferir na resposta, por exemplo, a concentração do
antibiótico interferindo na área do halo de inibição. Outro exemplo é a quantidade de célula no inoculo,
quanto menor o número de células maior o diâmetro do halo de inibição e vice-versa. Além disso, quanto
maior o volume do meio de cultura inoculado menor o halo de inibição e vice-versa. Se essas condições não
foram controladas existirá interferência nos resultados.

o No caso de blocos ao acaso, essa segregação/separação se refere ao isolamento de uma condição

analítica que interfere na resposta e ocorre a tentativa de eliminar e/ou reduzir sua interferência no
teste. Essa condição de variação que definirá que o delineamento será em blocos
 Cada bloco deve conter todos os tratamentos (padrão e amostra)
 Cada bloco deve ser o mais homogêneo possível
 Os blocos poderão se deferir entre si (entre as réplicas). As replicas passam pelo mesmo procedimento, podem
ter diferença entre uma placa e outra, mas isso não inviabiliza a analise, pois as amostras e o padrão estão na
mesma condição analítica
 A distribuição dos tratamentos dentro do bloco é ao acaso
  O fato da concentração do padrão e da amostra ser igual não significa que a potencia será a mesma pois ela
depende da atividade biológica
 Se a potência do antibiótico é maior o halo de inibição será maior. Para realizar a determinação de potência
não pode haver outra condição analítica, por exemplo, volume de meio de cultura, interferindo como no
exemplo 1, pois não há como determinar se o halo de inibição da amostra é maior em razão da sua potência ou
se é em razão do menor volume de meio de cultura inoculado.
 No exemplo 2, tanto o padrão quanto a amostra estão submetidos a mesma condição analítica, ou seja, no
mesmo volume de meio, eliminando assim essa interferência, em razão disso é utilizado o delineamento ao
acaso, pois a placa utilizada no doseamento microbiológico de antibiótico foi transformada em bloco. Em uma
placa haverá todas as soluções, medidas sob a mesma condição analítica, ou seja, a potência.

Delineamento cruzado
Utilizar esse planejamento quando o experimento puder ser ajustado em blocos. Contudo, só é possível aplicar dois
tratamentos por bloco. Por exemplo, um bloco pode ser um animal possível de ser testado em duas ocasiões diferentes.
Tem-se como objetivo aumentar a precisão, eliminando a influência da variação dos animais, ao mesmo tempo que se
equilibram os efeitos de qualquer diferença entre os níveis gerais de resposta, nas duas etapas do ensaio. Denominar
duplo cruzado o ensaio com duas doses do padrão e da amostra, e triplo cruzado aquele de três doses de cada
preparação. Proceder o ensaio em duas fases conforme o período de tempo definido no método. Distribuir os animais
em quatro ou seis grupos e realizar um tratamento em cada grupo na primeira fase. Na segunda fase, os animais que
receberam uma preparação receberão outra; os animais que receberam doses menores, nessa etapa receberão as
maiores
 Cada RB recebe dois ou mais tratamentos  possibilita avaliar o efeito de cada preparação em cada RB 
menor erro  elimina o efeito de diferença entre um RB e outro
 Cruzado duplo  duas doses de cada preparação, duas etapas
 Cruzado triplo  três doses de cada preparação, três etapas
 A resposta não pode ser a morte do individuo
 No doseamento microbiológico não há como realizar delineamento cruzado.

Exemplo: delineamento cruzado duplo

 Experimento realizado em duas etapas: 1 etapa  intervalo de tempo adequado  2 etapa
 Determinação de potência de insulina  baixo nível de glicose no sangue de coelhos

Grupos de animais 1 etapa 2 etapa

1 A1 P2
2 A2 P1
 3 P1 A2
4 P2 A1
o É dividido em 4 grupos de animais pois há quatro soluções preparadas (A1, A2, P1, P2)
o Nesse delineamento, é possível coletar e analisar a resposta do padrão e da amostra em um mesmo
individuo, gerando maior precisão e menor chance de erro, reduzindo a interferência de indivíduos
diferentes. O mesmo reagente biológico recebe os dois tratamentos, em duas etapas, após o intervalo
de tempo (para que o organismo entre em homeostase e
elimine aquele tratamento antes de receber o outro A1 = P1 < A2 = P2
tratamento)
A1 e P1 = 25ug/mL
o Os que recebem a maior concentração na primeira etapa
recebem e menor concentração na segunda etapa e vice- A2 e P2 = 50ug/mL
versa
o O delineamento define a formula que vai ser utilizada para estimar a potencia
o Poderia ser utilizado 4 etapas, o mesmo individuo poderia receber os 4 tratamentos, mas demoraria
mais e não compensaria para a empresa
Analise estatística
É o procedimento matemático aplicado aos resultados experimentais com o objetivo de estimar a potência da amostra
e avaliar a validade e precisão do ensaio. Os métodos de análise estão relacionados aos delineamentos experimentais
utilizados.
Precisão
Parâmetro que avalia o máximo de variação que pode ocorrer no resultado do teste
 Potencia verdadeira da amostra impossível de ser determinada, tem como ser estimada
 Intervalo de confiança de 95% Intervalo que abrange a verdadeira potencia relativa da amostra
Precisão com a qual a potencia tem sido estimada
 Intervalo de confiança largo  menor precisão do ensaio, gera maior incerteza dos dados
Aula 3 e 4
Doseamento microbiológico de antibiótico
Fundamento: inibição do crescimento microbiano independentemente do método (ágar ou turbidimetrico)
Concentração do antibiótico  efeito de inibição do crescimento microbiano

Ensaio indireto quantitativo

 Se a concentração aumenta, o efeito inibitório sobre o crescimento microbiano aumenta e vice-versa
 Variação de resposta conforme a mudança de concentração (se não tiver essa variação invalida o teste)
Ensaio indireto quantitativo
 Resposta mensurável  diâmetro do halo ou a turvação. Depende da concentração ou da dose
 Doses são fixas  determina – se amplitude do efeito  efeito é dose – dependente
 Maior a dose maior é o efeito
Resposta da amostra X resposta do padrão  potencia relativa /estimativa da amostra é comparada ao do padrão, não
é a potencia verdadeira
Métodos farmacopeicos: difusão em aguar e turbidimetrico
1. Método por difusão em ágar
1.1 – Delineamento experimental: blocos ao acaso
Diâmetro dos halos de inibição X log da concentração do antimicrobiano (imagem)

 Há regiao que não é ideal para o doseamento (onde não há variaçao de resposta com a variação de
concentração)  Com o aumento de concentraçao não há variaçao, variaçao praticamente nula
 A regiao central é a melhor area para doseamento (há variaçao de resposta de acordo com a variaçao de
concentração)

1.2 – Delineamento experimental: blocos ao acaso 3x3 (3 diferentes

concentrações da amostra e 3 diferentes do padrão)
 Os tratamentos diferentes no caso são a diferenças das
concentrações

1.3 - Delineamento experimental: blocos ao acaso 2x2 (2 concentrações da

amostra e 2 do padrão)

1.4 - Delineamento experimental: blocos ao acaso 5x1, bloco incompleto (5 concentrações do padrão 1 da
amostra)
 Pode ter união de halo se colocar todas as diferentes em uma mesma placa
 A placa não contem todos os tratamentos (por isso se chama incompleto)
 Contem sempre dois tratamentos diferentes, sendo que o P3 está em todos os tratamentos  ponto
central da curva. É usado para corrigir as possíveis diferenças que podem ter nas placas
 As retas precisam ser parelelas, a distancia entre as retas não pode ser distinta

 Se o teste não compre todos resquisitos, não há confiança nos dados gerados, não pode se confiar nos
diametros dos halos, não cumprindo os parametros farmacopeicos não se pode confiar no valor de
portencia, pois os dados que geraram aqueles valores não sao confiaveis, o que inviabiliza o
liberamento do lote.
 Se um parametro não der adequado, deve se repetir o teste
 Os parametros valiam de acordo com o delineamento
  Há variação de concentração e variação de resposta (halos)
 O valor da inclinação (b) tem que ser diferente de zero
 Ter regressão significativa não significa que tem que ter uma reta. Uma curva, por exemplo, pode ter
regressão significativa, ou seja, uma diferente concentração gerando uma variada resposta
 Esse parâmetro é avaliado no bloco ao acaso 3x3, 2x2, 5x1

 A inclinaçao da reta do padrao não pode ser diferente da inclinação da reta do amostra, a distancia entre
elas tem que ser a mesma
 A inclinaçao é relacionada a substancia e não ao tipo de preparação
 O ideal é não ter desvio de paralelismo significativo, as retas sao paralelas
 Se houver desvio de paralelismo significativo as retas não sao parelas, esse desvio pode ser gerado
atraves de uma diluiçao errada por exemplo
 O ideal é que o desvio de linearidade não seja significativo, não há presença de curvatura, a situaçao não
existe
 A presença de curvatura signicativa indica que o perfil é de curva
 Esse parametro não é aplicado no delineamento 2x2 pois dois pontos gera reta de qualquer forma
 Se o t mesma direção é superior ao t tabelado e o t direçao oposta é inferior ao t tabelado significa que não
há reta, não há curvatura na direção oposta mas há situaçao de curvatura na mesma direçao o que invalida
o teste, não interessa se há curvatura na mesma direçao ou não, o que não pode existir é a curvatura.

 Quanto mais largo o intervalo de confiaça menor a precisao, maior a dispersao/variabilidade dos
dados
 Se o limite de confiança do Lc calculado, tanto inferior quanto superior, não estiver dentro do Lc
farmacopeico corrigido indica que a precisao dos dados não é adequada, não pode confiar nos dados e
neim no valor de potencia.
Aula 5
1. Método por difusão em ágar – procedimento
 Quanto maior o diâmetro do halo de inibição maior a concentração do antibiótico
 Quanto menor o diâmetro do halo de inibição menor a concentração do antibiótico
1.2 – Preparo do inoculo
 Microrganismo sensível (cepa padrão – ATCC)
 Cultura de 24 h
 Suspensão em salina (T= 25% de transmitância a 580 nm)
 Adição no ágar fundido (46 – 48 oC)
1.3 – Preparo do inoculo
 Placas: fundo plano e com dimensões 20x100mm
 21 mL de ágar sem microrganismo – camada base
 Solidificação do meio em superfície plana
 4 mL de ágar inoculado com microrganismo – camada superfície
 Também pode ser utilizado o método de monocamada (somente a camada inoculada)
Camada superfície (inoculada) 4 mL
Camada base (não inoculada) 21 mL
1.4 – Preparo das placas – cilindros (O fármaco precisa ter boa solubilidade em meio aquoso)
 Diâmetro: interno 6 + ou - 0,1 mm e externo 8 + ou - 0,1mm
 Altura: 10 + ou - 0,1 mm
 Introdução dos cilindros na placa, maiores concentrações longe umas das outras
 Volume adicionado no cilindro: 200 uL (espera que se difunda – se e forma o halo de inibição)

1.5 – Preparo das placas – orifícios – pocinho no meio de cultura onde irá colocar a solução (O fármaco precisa
ter boa solubilidade em meio aquoso)
 Diâmetro 5 a 8 mm

1.6 - Preparo das placas – discos de papel

 Adição da solução do antibiótico no disco
 Adição de geração de 30 uL no disco de papel
 Imersão (tempo padronizado que fica mergulhado na solução)
 Micropipeta (padronização de volume máximo que o papel consegue absorver)
 Emprego de solventes orgânicos (não é comum no de cilindro e no de orifícios)
 Para fármacos que não são solúveis em meio aquoso (não consegue alcançar uma concentração
que tenha atividade) portanto o emprego de solventes orgânicos em discos de papel é uma
 estratégia para realizar o procedimento. O solvente é eliminado na etapa em que é colocado na
estufa, etapa de impregnação, para que não ocorra interferência e fique ali só o fármaco
 Uma desvantagem é que o solvente pode ter atividade antimicrobiana e gerar interferência.
Comparação dos procedimentos
 Cilindros e orifícios  + sensíveis e trabalhosos. São mais sensíveis se trabalha com concentrações mais
baixas
 Discos  uso de solventes. Possui a vantagem de trabalhar com solventes orgânicos

1.7 – Fatores que influenciam no diâmetro dos halos

 Inoculo
o Maior concentração do inoculo  o maior número de células que faz com que seja menor
velocidade de difusão do antibiótico  menor diâmetro do halo e vice-versa
o Se adiciona maior volume de suspensão maior será a concentração do inoculo
 Meio de cultura
o Conteúdo de água  halos irregulares que pode interferir no halo de inibição
 pH do meio de cultura e das soluções
o o pH ótimo interfere no crescimento do microrganismo e na condição de atuação biológica da
molécula do fármaco.
 Tempo e temperatura de incubação
o
 Espessura da camada de ágar inoculado (variação da camada superfície)
o menor espessura da camada superfície  maior diâmetro dos halos e vice-versa
(inversamente proporcional)
o monocamada
Modificação do procedimento
 tempo de pré – difusão (proposta em que há halos pequenos)
o tempo de pré difusão  maior diâmetro dos halos. Está favorecendo a difusão do antibiótico
em razão do maior tempo determinado, mas não está favorecendo o crescimento microbiano
(taxa de crescimento menor)
 tempo de pré – incubação (proposta em que há halos muitos grandes)
o tempo de pré – incubação  menor diâmetro dos halos. A taxa de crescimento do
microrganismo é favorecida e não ocorre difusão do antibiótico, pois nesse método o
antibiótico foi adicionado depois da incubação da placa com os microrganismos, o que
favorece um maior número de células na placa
Doseamento microbiológico de antibiótico

Método turbidimetrico
 Quanto mais turvação maior a quantidade de células e vice-versa
 Se aumenta concentração do antibiótico aumenta a transmitância  relação direta
 Se aumenta a concentração do antibiótico diminui a absorbância  relação inversa
o turvação  espectrofotômetro  % transmitância e absorbância
 o maior concentração do antibiótico  maior efeito da inibição do crescimento, menor número de
células  menor turvação  maior % transmitância e menor a absorbância
o menor concentração do antibiótico  menor efeito de inibição do crescimento, maior número de
células  maior turvação  menor % transmitância e maior a absorbância

Procedimento

 Não há como distinguir se a turvação é do microrganismo teste ou se é contaminação, as soluções devem ser
estéreis. Precisa evitar contaminação durante a execução do teste
 No método em difusão em ágar há como diferenciar o crescimento de colônias que são contaminação dos que
são do microrganismo teste
Aula 6

Método turbidimetrico – delineamentos experimentais

Método turbidimetrico – delineamentos experimentais – blocos ao acaso 3x3

 Branco inoculado e branco não inoculado são os controles positivo e negativo, respectivamente.
 No branco inoculado há o meio de cultura inoculado com o microrganismo teste e o diluente que não há
atividade antimicrobiana, a turvação comparada aos outros tubos deve ser maior, pois não há antibiótico para
inibir o crescimento. A função do BI é verificar se o crescimento do microrganismo ocorre de forma correta.
Se não houve crescimento no BI, alguma coisa está errada na execução do teste, se ele não ocorreu
crescimento pode ser que o erro esteja no caldo inoculado (meio de cultura) ou o microrganismo está velho,
não pode se confiar no teste, os demais tubos não são confiáveis. A porcentagem de transmitância é menor
que os demais e absorbância é maior aos demais, há maior turvação de células que os demais. Funciona como
um controle positivo
 Branco não inoculado, controle negativo, o meio de cultura não foi inoculado com o microrganismo teste, o
intuito é verificar a esterilidade do material que está trabalhando, o caldo e o diluente são estéreis, o esperado
é que não ocorra turvação. Se turvou, houve contaminação, o que pode indica que há contaminação nos outros
tubos, o teste deverá ser repetido. A porcentagem de transmitância é maior, 100%, que os outros tubos e a
absorbância é menor que os demais. O branco não inoculado é utilizado para zerar o equipamento.
 Por mais que os outros parâmetros como desvio de paralelismo, avaliação da regressão, presença de curvatura,
limite de confiança e potencia estejam dentro dos valores estabelecidos pela farmacopeica, se um ou os dois
controles falharem, os demais tubos não têm validade, a condição analítica não funcionou, então o teste deverá
ser repetido.
Método turbidimetrico – delineamentos experimentais – blocos ao acaso 2x2
 o que muda é o número de tubos
Método turbidimetrico – delineamentos experimentais – blocos ao acaso 5x1 – bloco completo
 o que muda é o número de tubos. Será 5 concentrações diferentes do padrão e 1 concentração da amostra
Método turbidimetrico x Difusão em ágar
  O método turbidimetrico é mais sensível, trabalha – se com concentrações menores que o método de difusão
em ágar. No método de difusão o fármaco precisa de difundir no ágar para gerar o halo.
 O tempo gasto no turbidimetrico é menor, execução, leitura e interpretação no mesmo dia
 O turbidimetrico exige condições mais bem controladas (chance maior de contaminação)
 Há uma proposta de 9,9 mL e 0,1 mL de padrão ou amostra quando a soluções do padrão e da amostra sao
preparadas em solventes orgânicos. Geralmente a proporção é 9 mL de caldo e 1 mL de solução padrão da
amostra

 Também pode se trabalhar com fármacos que possuem baixa solubilidade em meio aquoso
Teste de esterilidade
Os testes de esterilidade aplicam-se a insumos farmacêuticos, medicamentos e produtos para saúde que, de acordo
com a Farmacopeia, devem ser estéreis, sendo adequados para revelar a presença de bactérias e fungos. Contudo, um
resultado satisfatório indica que não foi encontrado micro-organismo contaminante somente na amostra examinada.
Conceito de esterilidade
 É a ausência de microrganismos viáveis
 Total ausência de formas viáveis capazes de reprodução

Incerteza
 Não é possível testar todas as fontes de contaminações
 Não é possível testar todas as unidades
Aplicação
 Insumos farmacêuticos
 Medicamentos (produtos parenterais, oftálmicos e outros)
 Produtos para saúde (seringas, materiais cirúrgicos, gaze, próteses e outros)
 Validação de processo de esterilização
Local
 Cabine de segurança biológica de classificação adequada ao produto
 Áreas limpas, classe B.
 Utilizada somente para a execução do teste de esterilidade
 Não é uma área estéril
 Classificação  qualidade do ar  número de partículas viáveis e não viáveis
Analista
 Principal fonte de contaminação  homem
 Treinamento e qualificação
 Vestimenta para áreas limpas
Monitoramento do ambiente
 Limpeza periódica  procedimento validado (material, frequência de limpeza). Reduzir o número de
partículas
 Monitoramento  qualidade do ambiente
 Monitoramento do ar
o Contadores de partículas (não viáveis e viáveis)
o Contadores de partículas totais
o Técnica de sedimentação
  Monitoramento de superfícies
o Através de swab e placas de contato
 Teste de segurança biológica  comprovar esterilidade dos produtos

Amostragem (para que o resultado da amostragem possa se estender ao restante do lote)

 Matéria prima
 n = √ N ; N é numero de unidades do lote da matéria prima adquirida
 n = número que será amostrado
o exemplo n = √ 100 = n = 10
 Produto acabado, segue os procedimentos que devem ser realizados
Exemplo
Produto: água para injetáveis – cada ampola tem 2 mL de água. Tamanho do lote: 60 unidades
 Se encaixa na situação de preparações parenterais (até 100)
60 unidades ----- 100%
X ---- 10%
X= 6 unidades (maior que 4 unidades) então deverá ser amostrado 6 unidades da água para injetáveis para o teste de
esterilidade
 Como a ampola tem 2 mL se encaixa na situação de 1 a 40 mL deverá ser amostrado metade de 2 mL (1 mL)
e inocular no meio de cultura
 Se fosse 1 mL deveria amostrar todo o conteúdo
Método de inoculação direta
 Método de filtração de memebran
Método de filtração em membrana (indireto)
 O produto é filtrado e a membrana que é colocada no meio de cultura
Os dois tipos de métodos de esterilidade é o método de inoculação direta e filtração por membrana. Para esses dois
métodos é utilizado o meio de tioglicolato quanto a caseína soja. Esses meios são altamente nutritivos.
Meio fluido tioglicolato
 Bactérias anaeróbicas (principalmente) máximo 1/3 do volume total do meio
 Bactérias aeróbias
 Incubação  30 a 35 C
 Composição
 L-cistina
 Cloreto de sódio
 Dextrose
 Agar granulado
 Extrato de levedura
 Caseína
 Tioglicolato de sódio
  Resazurina sódica
 Água purificada
Meio caldo caseína soja
 Levedura
 Fungos
 Bactérias aeróbias
 Incubação  20 a 25 C
Testes para avaliação da qualidade dos meios de cultura

 Teste de verificação da esterilidade (controle negativo do meio de cultura)  garantir que a contaminação é
proveniente da amostra e não do meio de cultura (avalia se o processo de autoclavação foi eficaz na
esterilização dos meios de culturas)
 Se houve turvação é indicio que a autoclavação não foi eficiente, o meio não é estéril (contaminação),
a turvação do meio pode gerar falso positivo, o meio não está adequado para a realização do teste
 Se um dos tubos apresenta resultado positivo já se desconfia
 Se não ocorreu turvação o meio é estéril

 Teste de promoção de crescimento (controle positivo do meio de cultura)

 O meio é contaminado com o microrganismo, a resposta que se espera é de turvação. Verifica – se o
meio possibilita o crescimento do microrganismo (nutrientes e condições adequadas)
 Se o microrganismo não cresce significa que o meio apresenta algum componente que impede esse
crescimento, não gera condições adequadas para que ocorra o crescimento
 O teste é preparado em um meio de cultura que não haja mais que 100 UFC
 Qualquer falha que exista nos controles positivo ou negativo invalida o teste de esterilidade, o
resultado não pode ser liberado para liberar o laudo (tem que estar dentro da condição especificada na
farmacopeia)

Método de inoculação direta

 O procedimento é transferir o material analisado para o meio de cultura (contato entre a amostra e meio de
cultura)
 A quantidade de meio de cultura tem que ser de forma que volume de amostra adicionado no tubo não seja
maior do que 10% do volume de meio. Os volumes de meio podem variar desde que não infrinja a
especificação
 A proporção do meio e da amostra interfere no teste (diluição do meio interfere na recuperação do
microrganismo)
  Todos os controles são avaliados juntamente com a amostra

 O volume de 1 mL de amostra foi definido de acordo com a tabela

 O exemplo 1 cumpre a especificação e o exemplo 2 não cumpre
 O volume máximo de meio de cultura é de 1L
Aula 7
Exemplo 1:
Lote de 90 unidades de solução injetável de dipirona, cujo volume é 1 mL
90 -------- 100%
x----- 10%
x = 9 unidades (maior
que 4 unidades)
A especificação da farmacopeia informa que o volume mínimo a ser inoculado em cada meio para recipiente de 1 a 40
mL deve ser metade do conteúdo, mas não menos que 1 mL. Como a quantidade da ampola em questão é de 1 mL não
seria possível amostrar 0,5 mL (metade do conteúdo), pois é menos que 1 mL, assim todo o conteúdo da ampola (1
mL) deverá ser amostrado.
 9 unidades é insuficiente para o teste, precisaria do dobro de unidades já que todo o conteúdo da ampola será
usado, a quantidade de amostra não é suficiente pra inocular nos dois meios de cultura (tioglicolato e caseína
soja). Nesse caso seria 18 unidades de amostra
Exemplo 2:
Lote de 90 unidades de solução soro fisiológicos estéril, cujo volume é 500 mL
90 unidades --- 100% 500 mL -----100%
x ---- 2% X -----10%
x= 1,8 unidades (2 unidades) X= 50 mL (amostragem)
Parenterais de grande volume
 De uma mesma amostra é possível coletar uma alíquota e transferir para o tioglicolato e para a caseína. Não há
necessidade de dobrar. Dois tubos de tiogliocolato e dois tubos de caseína

Validação do método de inoculação direta

 Em alguns casos como produtos oleosos é necessário adicionar tensoativo para dispersar a amostra no meio de
cultura aquoso. Há variáveis que podem ocorrer para cada tipo de amostra
 Após passar 14 dias de incubação observa – se há turvação/crescimento de microrganismo nos tubos da
amostra e se os tubos dos controles estão de acordo com a especificação
 Além do princípio há excipientes que possa interferir no teste, então é necessário validar antes de realizar o
teste descrito na farmacopeia para eliminar as possíveis interferências.
 Objetivos  verificar se amostra interfere no teste de esterilidade e eliminar a interferência causada pela
amostra
 Possíveis interferências  incompatibilidade físico – química entre amostra e meio de cultura e atividade
antimicrobiana da amostra
 Existem alguns produtos que ao entrarem em contato com o meio de cultura provocam a turvação.
Exemplo: amostra que possui baixa solubilidade em meio aquoso e precipita e gera turvação
(incompatibilidade da amostra com o meio de cultura).
Verificação da incompatibilidade físico química entre amostra e meio de cultura
 Antes de definir que o método será o método direto, é necessário saber se a amostra ao entrar em contato com
o meio de cultura se ela gera turvação do meio de cultura. Uma alíquota da amostra é adicionada em um tubo
com o meio de cultura e observar se há ou não turvação. Se for observada uma turvação após esse contato, o
crescimento é indicativo de incompatibilidade da amostra com o meio de cultura e não de crescimento
microbiano (não deu tempo de crescer se fosse de fato um microrganismo presente). Pode ser instantemente
ou pode demorar um pouco mais de tempo para observar essa turvação
 Essa situação não pode ser utilizada na rotina, pois a amostra interfere na condição analítica da farmacopeia

Turvação do meio de cultura

Amostra Tubo com meio de cultura

Maneiras de eliminar a interferência da incompatibilidade promovida pela amostra
A. Transferência de meio de cultura
Turvação Volume > 1mL
do meio

Inoculação por 14 dias

Amostra Tubo com meio de cultura Tubo novos meio de cultura

Leitura Incubação por mínimo 4 dias (tubos antigos + tubos novos)
(Após esse procedimento se houver turvação é sinal de contaminação na amostra)
 O objetivo da transferência é para verificar se a turvação é por conta da amostra ou se é por conta de uma
possível contaminação da amostra
 Como uma alíquota é transferida da amostra é transferida para um novo tubo, está se realizando uma diluição
da amostra e esse processo pode reduzir ou eliminar a interferência da incompatibilidade da amostra com o
meio e não turvar mais ou não.
 Havendo turvação nos tubos novos após a incubação de 4 dias é indicio de contaminação, desde que todos os
controles estejam adequados, a contaminação/turvação não está sendo gerada pela amostra, pois no momento
da transferência provavelmente não haveria turvação só do contato da amostra diluída no meio com o meio de
cultura
 Depois da incubação de 4 dias, havendo turvação, há a possibilidade de realizar o plaqueamento e se houver
crescimento de colônias é indicação de contaminação presente na amostra

B. Emprego do método de filtração por membrana (a amostra não fica em contato direto com o meio de
cultura)
Filtro de membrana amostra é descartada não entra em contato com o meio de cultura
 E uma alternativa porque a amostra não fica em contato direto com o meio de cultura. A membrana que
fica em contato com o meio de cultura
Verificação da atividade antimicrobiana da amostra
 O princípio ativo/amostra pode interferir no crescimento de uma possível contaminação (atividade
antimicrobiana)
 Se o princípio ativo tem atividade antimicrobiana essa interferência durante a realização do teste não deveria
existir. Pode ser que o produto esteja contaminado e não seja detectado em razão dessa atividade
antimicrobiana (falso negativo)
 O teste de bacteriostase e fungiostase verifica essa interferência
 Para realização destes testes é preparado uma suspensão com microrganismo que é inoculado no produto.
Espera que obtenha – se turvação no tubo da amostra já que foi adicionado microrganismo no tubo
 O tubo controle contém o meio de cultura + suspensão do microrganismo
 Tubo teste tem a amostra + suspensão do microrganismo

Tubo teste
0,1 mL Tubo com meio de cultura + microrganismo + amostra

Suspensão de microrganismo amostra

(~ 100 UFC/ 0,1 mL) Incubação por no máximo 5 dias
0,1 mL Tubo controle
Tubo com meio de cultura + suspensão de microrganismo
Avaliação dos resultados
 Tubo teste = tubo controle (o produto não apresenta atividade antimicrobiana). Pode se usar a condição que
está descrita na farmacopeia, as condições não precisam ser modificadas
 Tubo teste tubo controle (o produto apresenta atividade antimicrobiana). A amostra interfere no
crescimento do microrganismo, cresceu menos do que deveria, turvou menos que o controle, não cresce na
mesma proporção ou não cresce. As condições analíticas do teste não podem ser realizadas. Existe a
possibilidade de liberar um lote com resultado falso negativo (a amostra impediu o aparecimento da
contaminação)
Maneiras de eliminar a interferência de atividade antimicrobiana promovida pela amostra
A. Diluição da amostra  maior volume de meio de cultura

Enlenmeyer com meio de cultura

Tubo com meio de cultura amostra Amostra

 Atividade antimicrobiana é dependente da concentração, se aumentar o volume de meio de cultura irá

reduzir a concentração de amostra presente no tubo e assim eliminar/reduzir a interferência provocada pela
amostra

B. Adição do agente neutralizante (inibe a interferência da amostra que possui atividade antimicrobiana)
Preparo do meio de cultura Realização do teste

Meio de cultura
Contendo tween 80 esterilizar

Meio de cultura com twenn 80 amostra com parabeno

 Esse método será aplicado quando se sabe que a substância possui atividade antimicrobiana e que o agente
neutralizante consiga neutralizar essa substância

C. Emprego de filtração de membrana

Filtro de membrana amostra é descartada não entra em contato com o meio de cultura
 Essas formas de eliminação de interferência da amostra podem ser conciliadas
Membrana
 Porosidade máxima de 0,45 um
 Diâmetro 50mm
 Estéreis de celulose compõe a membrana
Fluidos de lavagem
 A composição do fluido de lavagem dependera da natureza do produto analisado
 Há 3 tipos de fluidos
 A membrana é lavada com o fluido porque fica resíduo do produto na membrana
Controles realizados
 Controle do ambiente
  Controle negativo do meio de cultura

 Controle positivo do meio de cultura

 Controle negativo da membrana
 A membrana tem que ser estéril. O controle negativo consiste na inoculação da membrana no meio de
cultura, espera que não haja turvação. Se houver turvação significa que a membrana não está estéril e
não se pode confiar nos resultados do teste
 Controle negativo do fluido de lavagem
 O fluido tem que ser estéril. O controle negativo consiste na filtração do fluido de lavagem na
membrana, espera que não haja turvação. Se houver turvação significa que o fluido não está estéril e
não se pode confiar nos resultados do teste
Método de filtração em membrana
 A membrana que é inoculada no meio de cultura (inoculação indireta)
Validação do método de filtração em membrana
Verificação da atividade antimicrobiana da amostra (Bacteriostase/Fungistase)
Antes de se estabelecer um procedimento para o teste de esterilidade de insumos farmacêuticos, medicamentos ou
produtos para saúde, deve-se garantir que qualquer atividade bacteriostática ou fungistática inerente ao produto não
tem influência adversa sobre a confiabilidade do teste, demonstrando-se que o procedimento utilizado é adequado para
o produto sob exame. O teste de validação para bacteriostase e fungistase deve ser realizado quando o teste de
esterilidade for realizado pela primeira vez para um produto e sempre que houver modificações na formulação do
produto e/ou nas condições experimentais do teste. A validação deve ser feita previamente ao teste de esterilidade do
produto sob exame
Maneiras de eliminar a interferência promovida pela amostra no método filtração por membrana
A. Aumentar o número de lavagens
 Aumentar o número de porções para lavar a membrana
 Fazer o teste de validação novamente para verificar se ainda tem a interferência
B. Adição de agentes neutralizantes
 Testar se o agente neutralizante é eficaz na eliminação da interferência comparando o tubo controle com o
tubo teste
C. Associação das duas
 Para a realização do teste de esterilidade em pomadas de base oleosa, pelo método de filtração em membrana em
membrana, podem ser utilizados o solvente orgânico miristato de isopropila e o aquecimento da amostra a 40 0C.
O miristato de isopropila utilizado deve ser estéril, cujo extrato aquoso deve apresentar pH superior ou igual a 6,5,
além de não possuir atividade antimicrobiana nas condições de realização do teste
Avaliação do teste de esterilidade em si no produto (condição analítica bem definida após a validação e avalia-se a
qualidade do produto)

 Condições assépticas adequadas  Como foi realizado o teste, controle do ambiente, (contagem de
partículas totais e viáveis, avaliação da superfície), controle negativo e positivo do meio de cultura,
controles da membrana (negativo da membrana e negativo do fluido de lavagem) adequados para confiar no
resultado do tubo da amostra
  Condições assépticas não adequadas
 Exemplo: tudo do controle negativo apresentando resultado positivo e tubo do controle positivo
apresentando resultado negativo
o Ausência de turvação no tubo da amostra e o controle positivo está negativo 
microrganismo não cresceu, se não desenvolveu crescimento nesse tubo, desconfia-se da
ausência de turvação no tubo da amostra pois o meio de cultura não fornecia condições
adequadas para o crescimento
o Presença de turvação no tubo da amostra e controle negativo está positivo  o meio de
cultura não estava estéril então a turvação do tubo da amostra pode ser por causa de uma
contaminação do meio e não da própria amostra
Aula 8
Pirogênios e teste de endotoxinas bacterianas
Pirogenios
Qualquer substância capaz de induzir elevações térmicas, em resposta a injeção ou infecção, em animais e humanos
 Exógeno: bactérias, fungos, vírus, fármacos e outros
 Endógenos: interleucinas, interferons, TNF, prostaglandinas e outros
 É permitido a presença de pirogenio, pois o efeito do mesmo é dependente da concentração

Dose dependente (alta, intermediaria e baixa)

Efeitos biológicos

Pirogenio

(princípios ativos, solventes) Fontes de contaminação (outros, agua)

Equipamentos Manipulação
Endotoxinas
São complexos de alto peso molecular associados a membrana externa de bactérias Gram negativas

P
Pirogenios Endotoxinas

 Há um limite de endotoxinas para cada produto estabelecido na farmacopeia, não se pode ter um numero
elevado no produto final
 Há três métodos para determinação de endotoxinas: de coagulação em gel, cromogênio e fotométrico
Método farmacopeico
Teste de pirogenio in vivo elevação de temperatura corporal

Métodos farmacopeicos
 Teste de endotoxina

In vitro reação de coagulação do LAL

Teste de endotoxinas bacterianas
Fundamento: As endotoxinas são capazes de ativar uma serie de reações em cascatas e causar uma coagulação chama
de LAL. Os amebócitos são células presentes na linfa de um artrópode. Essa célula possui enzimas que são
semelhantes a cascata de coagulação. A linfa desse animal em contato com a endotoxina gera um coagulo.
Endotoxina bacteriana + lisado de amebócitos de Limulus (LAL) coagulação do LAL
Fatores interferentes na reação
química:
 pH (6 a 8)
 temperatura
 tempo
 concentração de cátions
divalentes
 concentração de endotoxina

 Sensibilidade a endotoxina padronizada 0,015; 0,03; 0,06; 0,125; 0,25 UE/mL

 UE  unidade de endotoxina
 1 UE = 1 UI
Teste de endotoxinas bacterianas – Coagulação em gel
 A formação de gel no tubo é gerada pela ativação da endotoxina na cascata de coagulação
Preparo de endotoxina padrão

Água grau reagente LAL

Agitação por 30 min

Endotoxina Geladeira por 14 dias
Preparo do reagente LAL

Água grau reagente LAL

0,1 mL
Homogeneizar lentamente
LAL Manter a -20 C
Confirmação da sensibilidade do LAL

 É preparado algumas soluções de endotoxina para a realização do teste (2 λ, λ, 0,5 λ, 0,25 λ). Para ajustar a
concentração do LAL que será utilizado
 λ (sensibilidade rotulada do LAL)  é a menor concentração de endotoxina que promove formação de gel
 0,12 UE/mL
0,06 UE/mL 0,015 UE/mL
0,03 UE/mL
Exemplo:
LAL: λ = 0,06 UE/mL

Diluições em água grau

reagente LAL
Endotoxina padrão reconstituída 2λ λ 0,5λ 0,25λ
 É preparado 4 tubos com 100uL de LAL para cada concentração de endotoxina
 É preparado também 4 tubos do controle negativo (100 uL de LAL + água grau reagente) para avaliar o
processo de execução do teste (não há endotoxina nos tubos). Não se espera formação de gel
Leitura
Formação de gel (+)

Não há formação de gel (-)

Verter o tubo
Interpretação dos resultados

 No controle negativo há LAL + água grau reagente livre de endotoxina, não espera – se formação de gel,
sendo adequado indicando que não houve contaminação durante a realização do teste. Se no controle negativo
 der formação de gel (+) indica contaminação que gera dúvida quanto a confiabilidade do teste, invalidando o
teste, portanto o teste deverá ser repetido ate que o controle negativo de resultado negativo
 Ponto final se refere a menor concentração de endotoxina onde ouve a formação de gel
 O λ calculado avalia o que está sendo sugerido (0,5 ≤ λ ≤ 2 λ). O teste é utilizado para confirmar a
sensibilidade rotulada. Refere – se que o LAL está apto/adequado para ser aplicado no teste
 Se o valor de λ calculado estiver fora do especificado indica que o LAL não tem sensibilidade adequada para a
realização dos demais testes, ou seja, estaria com algum problema não respondendo adequadamente em
relação a formação de gel.

Exemplo de preparo
24 UE-------------- 1 mg 240 UE ---------- 5 mL
x------------ 10 mg x ----------- 1 mL
x = 240 UE x = 48 UE/mL (solução estoque)
Aula 9

 É necessário ver se o produto interfere ou não na resposta que é avaliada. No teste de coagulação em gel é
avaliado se a própria amostra contém substancias que podem inibir ou potencializar a formação de gel
(validação, etapa antes de avaliar a qualidade do lote). Há substancias presentes na amostra, além das
endotoxinas, que podem causar essa interferência levando a formação de gel ou inibindo – a.
 O teste de inibição e potencialização é uma etapa previa (validação) a execução do teste na rotina. Se o
produto interferir na reação da formação de gel, essa interferência deverá ser eliminada

 Na solução B, controle positivo da amostra, é utilizado a amostra como diluente da endotoxina. Ela que
mostrará se a amostra interfere ou não na formação de gel, espera que ocorra formação de gel, se não houver é
porque a amostra age sobre a formação de gel, inibindo-a (100ul de LAL + 100 uL de solução de endotoxina
preparada na amostra)

λ = 0,12 UE/mL, 2λ = 0,24 UE/mL, 0,5λ = 0,06 UE/mL, 0,25λ = 0,03 UE/mL

 O objetivo da solução A (amostra) é avaliar a qualidade do produto, observar se quantidade de endotoxina está
alta. Espera que não haja formação de gel, se houver é porque tem endotoxina na amostra. Havendo formação
de gel passa a desconfiar da qualidade da amostra
  O controle negativo é verificado para testar a execução e confiabilidade do teste (verificar se houve
contaminação)
 O controle positivo, solução C, é para reconfirmar a sensibilidade do LAL, avalia se o LAL se responde de
forma adequada a endotoxina (100 LAL + solução de endotoxina preparada em agua  diluente)
 A amostra pode conter endotoxina dentro do limite especificado na farmacopeia
 A partir dos resultados do controle positivo da amostra, calcula – se o lambida (sensibilidade) na presença da
amostra e se essa sensibilidade estiver dentro da especificaçao, a amostra não interfere na formaçao de gel.
 So é possivel confiar nos resultados do controle positivo se todos os controles estiverem adequados (controle
negativo estando com resultados negativos nas duas replicas, o lambida calculado do controle positivo estando
entre o intervalo especificado e os tubos da amostra apresentando ausencia de formaçao gel)
Interpretação dos resultados
O ensaio é valido, ou seja, pode confiar nos resultados dos tubos do controle positivo da amostra se:
 Tubos controle negativo  -
 Se der positivo indicaria uma contaminação
 λ calculado para controle positivo estiver entre o intervalo de 0,5λ e 2λ  amostra não interfere na formação
de gel
 Se estiver fora do intervalo indica que o LAL está respondendo de forma diferente ao esperado frente
a administração de endotoxina, estabilidade não está adequada, se a sensibilidade diminuiu, por
exemplo, a concentração de endotoxina para a formação de gel se tornou maior, então o LAL perdeu a
atividade
 Os tubos da amostra apresentam resultado negativo
 Se der positivo significaria que a quantidade de endotoxina presente na amostra talvez é superior ao
esperado ou esse resultado é justificado pela própria interferência da amostra (o contato da amostra
com gel já provoca o resultado positivo).
 Para avaliar se é a presença de endotoxina ou a própria amostra avalia – se o λ calculado do controle
positivo da amostra. Se o valor de λ calculado estiver dentro do especificado é a endotoxina que está
presente na amostra. Se o λ calculado estiver fora do especificado é a própria amostra que interfere na
formação de gel, potencializando ou inibindo
Esses três parâmetros indicam se pode confiar no controle positivo da amostra, se houver falha em um deles, poderá
haver má interpretação do resultado. Se um dos parâmetros estiver fora, ao avaliar o λ calculado do controle positivo
da amostra, podemos achar que a amostra em si está interferindo, talvez potencializando a formação de gel, mas não é
amostra que estará reagindo, na verdade é a endotoxina que está em quantidade maior
0,5 λ ≤ calculado na presença da amostra ≤ 2λ  amostra não interfere na formação de gel
 Se o λ calculado é menor que o 0,5 λ significa que é necessário menos endotoxina para ocorrer a formação de
gel → amostra potencializa a formação de gel, o que justifica o tubo com resultado positivo → tem que diluir
a amostra
 Se o λ calculado é maior que o 2λ, precisa de muita endotoxina pra formação do gel →amostra inibe a
formação de gel → desconfia da qualidade da amostra (falha)/não há justificativa para esse resultado positivo
 Se o λ calculado estiver dentro do intervalo especificado, a justificativa do resultado positivo da amostra seria
a presença de endotoxina (a amostra em si não interfere)
 O único resultado que justificaria os resultados positivos nos tubos da amostra seria a potencialização da
amostra
 O controle negativo está adequado (as duas replicas deram negativo, indicando que as condiçoes em que
foram realiazadas o procedimento estão adequadas, não houve contaminação)
 O controle positivo está adequado pois o valor de λ está dentro do intervalo especificado, indicando que o
LAL ainda tem estabilidade, não teve alteração na sua sensibilidade/atividade, ainda tem a qualidade
adequada para ser aplicado no teste, pode confiar, a partir do resultado do controle positivo, no resultado do
teste em que será obtido quando utilizado esse LAL

 As 4 replicas da amostras deram resultados negativos, o que indica que o conteudo de endotoxina nessa
amostra seria adequado para realização do teste. Pode confiar no resultado do teste, o ensaio é valido, pode
confiar no resultado do controle positivo da amostra
 Após o cumprimento de todos os paramentros , pode se confiar no controle positivo e deve – se realizar a
avaliação do controle positivo para ver se a amostra interfere ou não no teste
 Para esta amostra, a amostra não interfere na formaçao de gel, indicando que pode confiar no procedimento
descrito na farmacopeia, não tendo necessidade de modicar-lo para eliminar a anterferencia, não precisa
modificar o teste, pois não houve interterferenica. Se houvesse interferencia seria necessario modificar o
metodo.

 Como a amostra interfere no teste é necessário modificar o procedimento e realizar a diluição da amostra,
assim, a concentração do interferente também reduz (eliminação da interferência), independente se o valor de
λ menor ou maior dos limites especificados
  A amostra diluída que deverá ser utilizada no novo teste. Após a diluição, se os resultados positivos dos tubos
da amostra derem negativo, significa que era a amostra mesmo que estava interferindo e não a quantidade de
endotoxina
 Dilui até chegar no MDV (fator de diluição máxima)  não pode se ultrapassar esse fator, se diluir mais que
o fator máximo de diluição pode haver erro de sensibilidade para enxergar a quantidade de endotoxina
presente na amostra
Teste de endotoxinas bacterianas – coagulação em gel
 Há um limite máximo de endotoxina que pode estar contido em cada amostra
Teste de inibição ou potencialização (interferentes)
 Máxima diluição da amostra  limite de endotoxina determinado
Limite de endotoxina = UE/mg de fármaco ou UE/UI de fármaco
 MDV = limite de endotoxina x concentração do fármaco no produto/λ (sensibilidade rotulada)
Limite de endotoxina  UE/mL de solução
 MDV= limite de endotoxina/λ (sensibilidade rotulada)
 Se for alcançado o MDV e o λ calculado do controle positivo da amostra ainda estiver fora do especificado,
deverá ser modificado a sensibilidade do LAL, usar um LAL com sensibilidade maior (que consiga enxergar
concentrações de endotoxinas menores, reduzir o λ ). A sensibilidade e o valor de λ são indiretamente
proporcionais, ou seja, quanto menor o valor de λ maior será a sensibilidade

Teste propriamente dito

 Ensaio limite
  Ensaio que avalia se a concentração de endotoxina estaria fora ou dentro do limite especificado, a partir da
avaliação dos tubos controles, não determina o conteúdo de endotoxina. O ensaio limite é menos preciso e
exato que o ensaio semi- quantitativo
 Solução D controle negativo  100 ul + 100 ul de água livre de reagente (não espera- se formação de gel, se
o teste der positivo invalida todo teste, pois é indicio de contaminação)
 Solução C controle positivo  solução de endotoxina na concentração de 2 λ prepara em água como diluente,
espera que ocorra formação de gel, se não houve desconfia da qualidade/atividade do lal
 Solução B controle positivo da amostra  solução de endotoxina na concentração de 2 λ prepara em amostra
como diluente adicionada ao LAL espera que ocorra formação de gel (se não houver formação de gel a
amostra interfere na formação de gel). Só dá pra saber nesse caso se a amostra inibe a formação de gel.
Realiza – se esse controle positivo da amostra para garantir que as variações de produção não interferiram no
teste
 Tubos da amostra  lal + amostra (espera que não haja formação de gel)
 Tubos do C positivo  +
 Tubo do controle positivo da amostra  +
 Tubo do controle negativo  -
 Resultados iguais  amostra aprovada
 Resultados diferentes destes  o teste deverá ser repetido

Todos os tubos são incubados por 1 hora a 37 C  leitura dos resultados (formação de gel)

 Em uma situação em que um tubo da amostra apresenta resultado negativo e outro

positivo é necessário o reteste.
Aula 10

Teste pela coagulação em gel (semi – quantitativo)  calculo de concentração de endotoxina

 A amostra é diluída seguindo os fatores de diluição, a partir desses tubos que se calcula o conteúdo de
endotoxina presente na amostra
 Controle positivo, controle positivo, controle positivo da amostra (se inibe a formação de gel) avaliam a
veracidade dos resultados dos tubos da amostra

 No caso desta situação, todos os controles estão adequados

 Pf nesse caso é o maior fator de diluição em que houve a formação de gel
 Media do log PF x λ = - 0,470
 O limite de endotoxina da amostra é especificado na farmacopeia
 Caso 1 - O fator de diluição 10 foi determinado no teste de inibição e potencialização, etapa de validação.
Essa amostra que deverá ser utilizada no teste semi-quantitativo para encontrar a concentração de endotoxina.
O resultado que deve ser comparado com o limite de endotoxina especificado na farmacopeia é aquele que
considera a diluição
 Caso 2 – não há formação de gel em nenhum tubo, não é possível afirmar que a amostra não tem endotoxina
pois o método não tem sensibilidade suficiente pra falar sobre ausência. A quantidade de endotoxina é tão
baixa que não permite a formação de gel, mas a endotoxina está presente. Se nenhuma das diluições da
amostra teste for positiva, expressar o resultado da concentração de endotoxina como menor que a
sensibilidade do LAL (λ) ou menor do que a sensibilidade do LAL multiplicado pelo menor fator de diluição
da amostra, ou seja, a quantidade de endotoxina da amostra é menor que a sensibilidade rotulada, o produto
será aprovado.
 Se todas as diluições da amostra apresentarem reações positivas, a concentração de endotoxina é expressa
como igual ou maior que λ multiplicado pelo mais alto fator de diluição da amostra.
Teste de pirogenio
 O teste de pirogenio é feito em animal vivo. Permite avaliar a presença de qualquer tipo de pirogenio, é menos
sensível e seletivo que o teste de endotoxina
 O teste de pirogenio não gera valor de pirogenio, ele é um ensaio limite. A partir da reação do coelho se o
produto é seguro ou não
 O fundamento do método é verificar se houve aumento de temperatura no animal após a administração de uma
solução de pirogenio, avalia- se como reposta em si como a temperatura do animal varia durante a execução
do teste
  Quando há necessidade de fazer um reteste é necessário um maior numero de animais, 5
Procedimento
Medir a massa dos animais (a quantidade de solução administrada no animal depende de seu peso  colocar os
animais em gaiolas de contenção
 Introduzir o termômetro no reto do animal. Realizar as medidas de temperatura inicial e depois de 30 min
mede – se a temperatura novamente, a média da primeira temperatura e da segunda será a temperatura inicial
do animal antes da administração do produto para depois saber qual foi a variação de temperatura frente a
administração
 Aquecer produto a ser testado  injetar solução teste na veia marginal da orelha do coelho
 Proceder o registro da temperatura de 30 min em 30 min até o total 3 horas de acompanhamento
 O teste de realização do teste de endotoxinas é mais rápido
Analise do resultado
 No tempo de 3 h há a medida de 6 temperaturas (30,60, 90, 120, 150 e 180 min). A partir dessas medidas
observa – se os valores das 6 medidas e identificar qual que foi o valor maior de temperatura que foi obtido ao
longo destas 3 horas de execução do teste
 O Tx é maior medida de temperatura no intervalo de 3h
 Para cada animal calcula – se o delta T que será utilizado para analisar o parâmetro descrito na farmacopeia,
comparando o valor de delta t para cada indivíduo, se os 3 animais apresentaram valor de delta t menor que
0,5 oC indica que o produto cumpre o teste
 Se no pré – teste o animal, sem a administração do produto, nas condições em que são analisadas, apresentar
variação de temperatura maior que 0,5 oC o animal não é utilizado no teste, a própria condição de execução do
teste já gera a resposta que não é considerada a mais adequada
 Se algum animal apresenta o valor de delta 5 igual ou superior a 0,5 oC há a necessidade de fazer o reteste.
 Para o reteste é feito com mais 5 animais diferentes
 Observa – se o resultado do delta t do teste e do reteste (no máximo 3 dos 8 coelhos)
 O somatório do delta t dos 8 coelhos tem que ser menor que 3,3 oC
 Em casos de delta t negativo, a farmacopeia considera o resultado como 0
 Nesse caso o produto cumpre o teste
  Cumpre com as duas especificações  produto aprovado
Estatística aplicada
1. Conceitos
2. Teste t de student
3. Analise de variância
4. Teste de media
Teste de hipóteses
Exemplo 1 – seleção de desintegrante para comprimido de captopril
 Desintegrantes: A x B
 Procedimento: determinação do tempo de desintegração de ambas as formulações (n=6)
 Resultados: tempo de desintegração (segundos)

A B
29 24
27 26
25 28
29 28
24 28
25 28
média = 26,5 média = 26,667
1. Teste de hipóteses
Hipótese nula
Não existe diferença significativa entre as medias do tempo de desintegração
Hipótese alternativa
Há diferença significativa entre as medias do tempo de desintegração
População x amostra
Comparação
 2 medias  teste t de student
 2 ou + medias  analise de variância (anova)
Exigência para aplicar os testes
 Variável continua
 Seguir a distribuição de Gauss
Controle de qualidade de produtos não estéreis
1. Introdução
2. Métodos farmacopeicos para contagem do numero de microrganismos mesofilicos
2.1 filtração por membrana
2.2 contagem em placa
2.3 número mais provável
Introdução
Produtos não estéreis  presença limitada de carga microbiana  Tipo de utilização do produto
Ausência ou presença limitada de microrganismos patogênicas
 problemas devido a contaminação microbiana

Aplicação
  matéria prima
 medicamentos
 cosméticos
fontes de contaminação
 matéria prima
 locais de produção
 pessoal
 consumidor
amostragem

 matéria prima √ n ou √ n+1

 controle em processo, inicio (3), meio (4) e fim (3)
 produto acabado
 triplicata – pool