Genética

Introdução às Técnicas Moleculares

 Sumário
Desenvolvimento do material Introdução às Técnicas Moleculares
Juliana Amaral Santos
Para Início de Conversa... ................................................................................ 3
Objetivos ..................................................................................................... 3
1ª Edição 1. FISH (Hibridização Fluorescente in Situ) .............................................. 4
Copyright © 2023, Afya.
2. Southern e Northern Blotting ................................................................. 7
Nenhuma parte deste material poderá ser reproduzida,
transmitida e gravada, por qualquer meio eletrônico, 3. Sequenciamento de DNA ............................................................................ 11
mecânico, por fotocópia e outros, sem a prévia
autorização, por escrito, da Afya. Referências ..................................................................................................... 16
Para Início de Conversa... Objetivos
Neste capítulo, serão abordadas as técnicas que permitem a visualização, ▪ FISH (hibridização fluorescente in situ)
a análise e a manipulação dos ácidos nucleicos, com ênfase especial ▪ Southern e Northern blotting
em quatro técnicas essenciais: FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), ▪ Sequenciamento de DNA
Southern blotting, Northern blotting e sequenciamento de DNA.

Ao longo deste capítulo, você descobrirá como a FISH nos permite

rastrear e identificar sequências específicas de DNA e RNA dentro de
células e tecidos, revelando informações sobre localização e presença.

Em seguida, mergulharemos no Southern blotting, uma técnica

que desvenda a organização do DNA em fragmentos menores,
desempenhando um papel fundamental na detecção de mutações
genéticas e na análise de polimorfismos. Ainda, iremos estudar o Northern
blotting, que nos permite investigar a expressão gênica ao medir os níveis
de RNA mensageiro em diferentes condições. Essa técnica desempenhou
um papel central em nossa compreensão dos processos de regulação
gênica e na investigação de doenças genéticas.

Por fim, iremos compreender o sequenciamento de DNA, uma das

maiores inovações na história da biologia molecular. Com ele, é possível
determinar a ordem precisa das bases nitrogenadas em uma molécula
de DNA, abrindo portas para o estudo aprofundado de genomas, a
identificação de genes e o diagnóstico de doenças genéticas.

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1. FISH (Hibridização Fluorescente in Situ) de fluorescência, permitindo a visualização das regiões de interesse no
material genético.
A hibridização fluorescente in situ, frequentemente abreviada como O DNA é composto por quatro bases nitrogenadas:
FISH, é uma técnica poderosa na área da biologia molecular e genética
que permite a localização e a identificação de sequências específicas ▪ Adenina (A);
de DNA, RNA ou até mesmo proteínas dentro de amostras biológicas. ▪ Timina (T);
Essa técnica, desenvolvida nas últimas décadas, desempenha um papel ▪ Citosina (C);
fundamental na pesquisa genética, diagnóstico clínico e biologia celular. ▪ Guanina (G).
A FISH, uma sigla para “Fluorescence In Situ Hybridization”, é uma As bases A e T formam pares complementares, assim como as bases C e
técnica que utiliza sondas de ácido nucleico (geralmente, DNA ou RNA) G. A FISH aproveita esse princípio, projetando sondas de DNA ou RNA que
marcadas com fluoróforos para se ligarem a sequências específicas de são complementares à sequência específica que se deseja investigar. Por
ácido nucleico dentro de células, tecidos ou outros tipos de amostras exemplo, se a sequência-alvo contém ATGCTA, a sonda será projetada
biológicas. Essa hibridização permite a detecção e a localização precisa com a sequência TAGCAT.
de sequências-alvo, proporcionando informações valiosas sobre a
organização e a distribuição de material genético. Ainda, desempenha um papel crucial em várias áreas da biologia e da
medicina: ela possibilita a análise de anormalidades cromossômicas, a
Essa técnica se baseia no princípio da complementaridade de localização de genes específicos, a identificação de mutações genéticas e
bases nitrogenadas. As sondas de FISH são projetadas para serem a investigação de rearranjos cromossômicos. Além disso, a FISH é usada
complementares a sequências específicas do DNA ou RNA que
em estudos de expressão gênica e em pesquisas de câncer, auxiliando
se deseja investigar, que são moléculas de ácido nucleico curtas,
na compreensão das bases genéticas de várias doenças.
frequentemente DNA ou RNA, marcadas com fluoróforos (moléculas
que emitem fluorescência quando excitadas por luz específica) para O seu desenvolvimento ao longo dos anos é um ponto relevante. A
permitir sua detecção. Quando as sondas se ligam a suas sequências- técnica evoluiu de hibridizações in situ tradicionais para métodos
alvo, a fluorescência dos fluoróforos é detectada sob um microscópio altamente sensíveis e específicos, incluindo FISH multicolorida e FISH

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de alta resolução, que permitem a análise de múltiplas sequências Ainda, os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA que
simultaneamente e a identificação precisa de variações genéticas. desempenham um papel essencial na regulação pós-transcricional da
expressão gênica. Sondas de FISH projetadas para se ligarem a miRNAs
As sondas de DNA são as mais comuns na FISH e são frequentemente
específicos são usadas para estudar sua localização e expressão em
usadas para investigar sequências de DNA. Elas são projetadas para
células. Isso é importante para entender como os miRNAs influenciam a
serem complementares a sequências-alvo de DNA em amostras
regulação de genes e os processos biológicos.
biológicas. Quando hibridizadas com o DNA-alvo, a fluorescência dos
fluoróforos na sonda de DNA emite luz, permitindo a detecção das
sequências de interesse. São amplamente utilizadas na identificação de
genes específicos, estudos de cromossomos e diagnóstico de doenças A escolha do tipo de sonda de FISH depende das sequências-alvo e
genéticas. das perguntas de pesquisa. A capacidade de utilizar diferentes tipos de
sondas permite explorar uma ampla gama de aplicações na genética,
Por outro lado, as sondas de RNA são projetadas para se ligarem biologia molecular, biologia celular e diagnóstico clínico. A compreensão
a sequências específicas de RNA em amostras biológicas. Elas são dos tipos de sondas disponíveis é essencial para o planejamento e a
valiosas para a detecção de transcrição gênica e expressão de genes. A execução bem-sucedidos de experimentos de FISH.
hibridização com sondas de RNA permite a localização de moléculas de
RNA mensageiro (mRNA) em células, revelando quais genes estão sendo
expressos em um determinado momento. Isso é essencial para estudos O processo de hibridização na FISH envolve várias etapas. Primeiramente,
de expressão gênica e pesquisa em biologia molecular. a amostra biológica deve ser preparada adequadamente; isso envolve
a fixação das células ou tecidos, geralmente com paraformaldeído,
Além de sondas de ácido nucleico, a FISH também pode utilizar sondas para preservar sua estrutura e conteúdo de ácido nucleico - a fixação
peptídicas, que são projetadas para se ligarem a proteínas específicas é crucial para manter a integridade das amostras durante o processo.
em amostras biológicas. A hibridização com essas sondas permite a Em seguida, é realizada a desnaturação do DNA ou RNA na amostra;
identificação e a localização de proteínas dentro de células ou tecidos, o isso envolve a aplicação de calor ou agentes químicos para separar as
que é fundamental em estudos de biologia celular e diagnóstico clínico. cadeias complementares de ácido nucleico, tornando-as acessíveis para

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a hibridização com as sondas. A temperatura e o tempo de desnaturação
são críticos para o sucesso da FISH.

As sondas de FISH, previamente projetadas para serem complementares

à sequência-alvo, são adicionadas à amostra. As sondas podem ser
marcadas com fluoróforos de cores diferentes, permitindo a identificação
de múltiplas sequências em uma única amostra. A hibridização é
realizada em uma temperatura específica que permite que as sondas
se liguem de forma seletiva às sequências-alvo. Após a hibridização, a
amostra é submetida a uma série de lavagens para remover quaisquer
sondas não ligadas. Essa etapa é crucial para minimizar o ruído de fundo
e garantir a especificidade da técnica.

A visualização das sequências de ácido nucleico marcadas com FISH

ocorre graças à emissão de luz fluorescente pelos fluoróforos. A cor e
Figura 1: Representação da hibridização fluorescente in situ. Fonte: Adaptada de Wikimedia
a intensidade da fluorescência são usadas para determinar a presença Commons.
e a quantidade das sequências-alvo na amostra. A análise das imagens
obtidas permite a identificação precisa das sequências, sua localização A FISH é frequentemente usada para detectar anormalidades
nas células ou tecidos, e a interpretação de dados genéticos relevantes. cromossômicas, como deleções, duplicações e translocações. Isso é
Os fluoróforos utilizados nas sondas de FISH podem emitir luz em essencial no diagnóstico de doenças genéticas, como a síndrome de
diferentes comprimentos de onda, permitindo a marcação de múltiplas Down, a síndrome de Turner e leucemias, permitindo uma análise
sequências em uma única amostra. Isso possibilita a realização de precisa do cariótipo dos pacientes. A técnica é valiosa na identificação
FISH multicolorida, na qual diferentes sequências são marcadas com e localização de genes específicos em cromossomos, sendo crucial
fluoróforos de cores distintas, fornecendo informações detalhadas sobre para a pesquisa genética e para a compreensão de como os genes são
a organização do material genético na amostra. organizados e regulados no genoma.

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Além disso, permite o estudo da expressão gênica em nível celular. Por Em resumo, a hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma técnica
meio da detecção de RNA mensageiro (mRNA) em tecidos ou células, poderosa que oferece uma ampla variedade de aplicações. Sua
os pesquisadores podem determinar quais genes estão ativos em um capacidade de detectar e localizar sequências de ácido nucleico com
determinado contexto, contribuindo para a compreensão dos processos alta especificidade contribui significativamente para a compreensão dos
biológicos. Na biologia celular, é usada para estudar a localização processos biológicos e doenças. A FISH desempenha um papel central
e a dinâmica das sequências de ácido nucleico dentro das células; em avanços científicos e médicos, possibilitando o estudo de genes,
isso é essencial para entender como as células funcionam e como as cromossomos, RNA e proteínas em diversas áreas da biologia e da
informações genéticas são distribuídas no interior celular. medicina.

Embora essa técnica seja poderosa e amplamente utilizada, ela também

apresenta algumas limitações e desafios que devem ser considerados ao
planejar experimentos e interpretar resultados: a qualidade da amostra 2. Southern e Northern Blotting
é crucial para o sucesso da FISH; a fixação inadequada, a degradação do
O blotting molecular é um conjunto de técnicas essenciais na biologia
ácido nucleico ou a contaminação podem levar a resultados imprecisos;
molecular e na genética que permitem a transferência, detecção e
a obtenção de amostras de alta qualidade é um desafio, especialmente
análise de ácidos nucleicos (DNA e RNA) e proteínas. Essas técnicas
em amostras clínicas. Além disso, é uma técnica altamente sensível
às condições experimentais: pequenas variações na temperatura, desempenham um papel crucial na pesquisa genética, diagnóstico de
concentração de sal e pH podem afetar os resultados, o que requer doenças, estudos de expressão gênica e muito mais.
cuidadosa otimização experimental para obter resultados confiáveis. O termo “blotting” se origina do verbo “to blot”, que significa transferir. O blotting
Ainda, a especificidade das sondas é crucial, mas o uso de sondas
molecular refere-se a um conjunto de técnicas laboratoriais que envolvem a
incorretas ou sondas que se ligam a sequências semelhantes pode levar
transferência de moléculas biológicas de um gel ou matriz de separação para
a resultados falsos-positivos ou falsos-negativos. A interpretação de
uma membrana; essa membrana é então usada para a detecção específica das
resultados de FISH pode ser complexa, especialmente em experimentos
moléculas de interesse. As principais técnicas de blotting molecular incluem
multicoloridos. A identificação precisa de sinais de fluorescência e a
Southern blotting, Northern blotting e Western blotting.
diferenciação de diferentes sequências podem ser desafiantes.

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O desenvolvimento das técnicas de blotting molecular ao longo do A amostra é carregada em um gel de agarose (Southern blotting) ou
tempo tem sido notável. A técnica original, chamada de Southern blotting, poliacrilamida (Northern blotting). Através da aplicação de um campo
foi desenvolvida por Edwin Southern e foi usada para a detecção de elétrico, as moléculas de DNA ou RNA são separadas por tamanho durante
DNA específico em géis de agarose. Posteriormente, o Northern blotting a eletroforese; isso resulta em bandas no gel, em que as moléculas
foi desenvolvido para detectar RNA, enquanto o Western blotting surgiu maiores ficam mais próximas da origem da aplicação e as menores
para analisar proteínas. A evolução tecnológica levou a melhorias se movem mais distante. Após a eletroforese, as moléculas de DNA ou
significativas nas técnicas de blotting, tornando-as mais sensíveis, RNA precisam ser transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou
rápidas e precisas. nylon, geralmente feito através de capilaridade ou eletrotransferência. A
membrana atua como um suporte sólido para as moléculas e permite a
Em todas essas técnicas, o princípio básico envolve a separação das
posterior hibridização com sondas específicas.
moléculas-alvo em uma matriz (gel) e sua subsequente transferência para
uma membrana sólida, como nitrocelulose ou nylon. A membrana atua As sondas são moléculas complementares à sequência de DNA (Southern
como um suporte para as moléculas transferidas e permite sua detecção blotting) ou RNA (Northern blotting) que se deseja detectar e são
com sondas específicas. As sondas são moléculas complementares que frequentemente marcadas com radioisótopos, enzimas ou substâncias
se ligam de maneira seletiva às moléculas-alvo, possibilitando sua fluorescentes para permitir sua detecção. A membrana é incubada com
identificação e quantificação. a sonda, permitindo que ela se ligue seletivamente à sequência-alvo
durante a hibridização, que é o processo pelo qual as sondas se ligam
As técnicas de Southern e Northern blotting são métodos fundamentais
seletivamente às sequências complementares nas membranas. Para
em biologia molecular que permitem a detecção, identificação e análise
garantir que a hibridização seja específica, as membranas são incubadas
de ácidos nucleicos específicos, sejam eles DNA (Southern blotting) ou
com as sondas em uma solução tampão a uma temperatura ideal; após a
RNA (Northern blotting). Ambos começam com a preparação da amostra
hibridização, a membrana passa por uma série de lavagens para remover
biológica; isso envolve a extração do DNA ou RNA a partir das células ou
quaisquer sondas que não tenham se ligado à sequência-alvo, crucial
tecidos de interesse. A qualidade da amostra é crucial para resultados
para reduzir o ruído de fundo e garantir a especificidade da técnica.
precisos. A integridade do DNA ou RNA é mantida através de métodos de
extração e purificação adequados.

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A detecção das sondas ligadas às sequências-alvo é realizada utilizando A análise de resultados e interpretação é uma fase crucial nas
autorradiografia (quando se usam radioisótopos), uma enzima que reage técnicas de Southern e Northern blotting, pois é nesse estágio que os
e produz um sinal visível, ou um scanner de fluorescência (no caso de pesquisadores traduzem as informações obtidas nas membranas em
sondas fluorescentes). A análise cuidadosa das imagens obtidas permite a dados significativos.
identificação das sequências de interesse e sua quantificação. Em ambas
as técnicas é essencial incluir controles experimentais, o que pode incluir A primeira etapa na análise de resultados é a identificação das bandas
amostras de controle que não receberam sondas, bem como amostras que correspondem às sequências de interesse. As bandas são as áreas
com sequências-alvo conhecidas para validação dos resultados. Cada escuras na membrana que indicam a presença da sequência de ácido
etapa do procedimento pode ser otimizada para obter resultados ideais; nucleico que a sonda se ligou durante a hibridização. Essa identificação
isso inclui a escolha adequada de sondas, a definição de condições de é feita comparando os padrões de bandas nas amostras com os controles
hibridização e lavagem, e o controle de variáveis experimentais. experimentais. Os controles positivos contêm a sequência de interesse,
enquanto os controles negativos não contêm essa sequência. Comparar
as amostras com os controles permite determinar quais bandas são
específicas da sequência de interesse.
Amostra
Visualização A quantificação das bandas é realizada para determinar a quantidade da
do RNA

Extração de RNA
sequência de interesse nas amostras. Isso é particularmente relevante
no Northern blotting, em que a intensidade das bandas está diretamente
Sondas
marcadas
relacionada à expressão gênica. Essa quantificação é geralmente
realizada usando densitometria, que envolve a medição da intensidade
Hibridização
de sonda das bandas em uma imagem; um software especializado pode auxiliar
Eletroforese em gel
na quantificação precisa.
Transferência
da membrana
Para análises quantitativas, é comum normalizar os dados. Isso envolve
Figura 2: Representação da técnica Northern blotting. Fonte: Adaptada de Dreamstime. a comparação das intensidades das bandas de sequência-alvo com uma

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referência interna, como uma banda correspondente a uma sequência de Ambas as técnicas têm aplicações no diagnóstico clínico, especialmente
controle, como uma sequência de RNA de referência em Northern blotting. em testes de doenças genéticas e câncer. Por exemplo, o Southern blotting
A normalização ajuda a eliminar variações na eficiência da transferência pode ser usado para detectar mutações genéticas associadas a doenças
e detecção, permitindo comparações precisas entre diferentes amostras. hereditárias, enquanto o Northern blotting pode ajudar a avaliar a
expressão de genes envolvidos em distúrbios. Além disso, são úteis para
monitorar os efeitos de terapias e tratamentos: por exemplo, o Northern
blotting pode ser usado para verificar a eficácia de medicamentos que
A interpretação dos resultados deve levar em consideração quaisquer
visam reduzir a expressão de genes relacionados a doenças.
características específicas do experimento, como o uso de diferentes tipos
de sondas ou marcadores. É importante manter registros detalhados e As técnicas de blotting são aplicadas em microbiologia e virologia para
documentação cuidadosa durante o processo de análise e interpretação estudar a genética de micro-organismos e vírus. Elas podem ser usadas
dos resultados, que são fundamentais para a geração de relatórios e para identificar sequências genéticas específicas em genomas virais
apresentação dos dados. Os resultados devem ser descritos em termos
e estudar a expressão de genes em bactérias, fungos e outros micro-
claros, e conclusões devem ser tiradas com base na análise.
organismos. Ainda, são usadas em estudos de genômica e proteômica,
fornecendo informações sobre a expressão e a regulação de genes e
proteínas em diferentes contextos biológicos.
O Northern blotting é uma ferramenta valiosa para a análise de expressão
gênica. Ele permite a quantificação da quantidade de um RNA específico Uma parte crucial da compreensão das técnicas de Southern e Northern
em diferentes condições experimentais, o que é útil para estudar a blotting é sua posição em relação a outras técnicas moleculares usadas
regulação gênica em resposta a estímulos ou em diferentes estágios de na pesquisa genética, biologia molecular e diagnóstico clínico. A PCR é
desenvolvimento. Por outro lado, o Southern blotting é frequentemente uma técnica amplamente utilizada para amplificar e detectar sequências
usado para estudar polimorfismos genéticos, que são variações na de DNA específicas: comparativamente, a PCR é mais sensível e permite
sequência de DNA entre indivíduos; essa técnica pode ser usada para a amplificação de sequências de DNA em quantidades muito pequenas.
identificar e analisar polimorfismos de tamanho de fragmento, restrição
e repetições em sequências de DNA.

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O Southern blotting, por outro lado, é útil quando se deseja analisar Em resumo, compreender os fundamentos das técnicas de Southern
sequências de DNA específicas já conhecidas e quantificar sua presença. e Northern blotting é crucial para a interpretação dos resultados e o
É menos sensível que a PCR, mas é eficaz para estudos de polimorfismos planejamento adequado de experimentos. Essas técnicas fornecem
genéticos e análise de estrutura genômica. informações valiosas sobre a presença, quantidade e tamanho de
sequências de DNA ou RNA específicas. A escolha de sondas apropriadas,
A RT-PCR é uma variante da PCR que permite a amplificação de RNA
a otimização das condições de hibridização e a análise precisa dos
e, consequentemente, a análise da expressão gênica. Comparada ao
resultados dependem de uma compreensão sólida desses princípios
Northern blotting, a RT-PCR é mais sensível, requer menos material de
fundamentais.
partida e é mais rápido; no entanto, o Northern blotting ainda é usado
quando se deseja validar a expressão de sequências de RNA específicas
ou analisar a presença de diferentes isoformas de RNA. Além disso, a
hibridização in situ é outra técnica que usa sondas de hibridização para
3. Sequenciamento de DNA
detectar sequências de DNA ou RNA em tecidos e células e permite a O sequenciamento de DNA é uma das técnicas mais revolucionárias da
localização das sequências em seus contextos anatômicos e celulares. biologia e da genética, permitindo a determinação da ordem exata das
O Southern e o Northern blotting, por outro lado, fornecem uma análise bases nucleotídicas que compõem o material genético dos organismos
mais quantitativa e podem ser mais sensíveis na detecção de sequências (adenina, timina, citosina e guanina). A partir da informação gerada
específicas em amostras. pelo sequenciamento, é possível identificar genes, regiões regulatórias,
mutações genéticas, marcadores genéticos e muito mais - esses dados
O Southern e o Northern blotting oferecem especificidade na detecção
são essenciais para uma ampla gama de aplicações, desde pesquisa
de sequências-alvo, validação de resultados, identificação de sequências
científica básica até diagnóstico médico e desenvolvimento de terapias.
específicas, estudos de expressão gênica e análise de tamanho de
fragmentos. Porém, essas técnicas podem ser menos sensíveis do que
alternativas modernas, requerem mais tempo de execução e, geralmente,
têm limitações em termos de detecção de baixas concentrações de
sequências-alvo.

Genética 11
 de Sanger”, que envolve a utilização de terminadores de cadeia
dideoxirribonucleotídicos, que, quando incorporados em uma sequência
em crescimento, causam a terminação da síntese do DNA em fragmentos
de diferentes tamanhos.

Durante as décadas de 1970 e 1980, o sequenciamento de Sanger

foi amplamente adotado em laboratórios de pesquisa, mas era um
processo manual e trabalhoso. Os sequenciadores de primeira geração
eram baseados em gel de poliacrilamida e utilizavam radiotraçadores
para detectar as bases de DNA. Posteriormente, foram introduzidos
os sequenciadores de DNA automatizados; eles substituíram o gel
de poliacrilamida por matrizes capilares e os radiotraçadores por
marcadores fluorescentes, o que tornou o sequenciamento mais rápido,
eficiente e menos dependente de técnicas manuais.
Figura 3: Sequência de DNA. Fonte: Dreamstime.
O sequenciamento de Sanger é baseado na síntese de cadeia de DNA
A história do sequenciamento de DNA começa nas décadas de 1950 e in vitro, usando desoxirribonucleotídeos (dNTPs) normais e dNTPs
1960, quando cientistas como Linus Pauling e Robert Corey propuseram marcados com fluorescência. Nele, uma reação de sequenciamento é
a estrutura helicoidal do DNA. A descoberta da estrutura de dupla-hélice realizada em quatro tubos diferentes, cada um contendo uma mistura de
por James Watson e Francis Crick, em 1953, lançou as bases para a DNA-alvo, DNA polimerase, fragmentos de DNA de cadeia terminadora
compreensão da molécula de DNA. e desoxirribonucleotídeos (dNTPs). Quando um nucleotídeo terminador
A técnica de sequenciamento de DNA desenvolvida por Frederick (dideoxirribonucleotídeo) é incorporado pela DNA polimerase durante
Sanger na década de 1970 foi um marco importante na história do a replicação, a cadeia de DNA não pode mais crescer, resultando na
sequenciamento. Esse método ficou conhecido como “sequenciamento geração de fragmentos de diferentes tamanhos.

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Após a reação de sequenciamento, os fragmentos de DNA são separados O sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma categoria de técnicas
por eletroforese capilar, com as moléculas menores percorrendo a coluna que superam as limitações do sequenciamento de Sanger, permitindo o
mais rapidamente. Um detector capta os sinais luminosos emitidos por sequenciamento rápido e eficiente de genomas inteiros. As tecnologias
marcadores fluorescentes ligados aos fragmentos de DNA. mais comuns incluem a Illumina, Ion Torrent, PacBio e Oxford Nanopore,
em que cada plataforma utiliza abordagens únicas para a amplificação e
Essa técnica é altamente precisa e confiável, adequada para sequenciar sequenciamento de DNA. O NGS envolve a amplificação do DNA-alvo em
regiões específicas de DNA; no entanto, é demorada e custosa, clusters ou esferas, a amplificação e detecção de bases sequenciadas e a
especialmente para sequenciamento de genomas inteiros. geração de dados de sequenciamento massivos.

Nessa técnica, o DNA-alvo é fragmentado em pedaços menores, muitas

Desoxirribose
vezes usando enzimas de restrição, ultrassonografia ou outros métodos.
Sequenciamento Adaptadores são ligados às extremidades dos fragmentos de DNA
para permitir a amplificação e a detecção. Os fragmentos de DNA com
de Sanger
adaptadores são amplificados em clusters ou esferas, dependendo da
Didesoxirribose plataforma de NGS. Após a preparação da biblioteca, a sequenciação
propriamente dita é realizada, gerando dados brutos que são convertidos
em sequências de DNA.
Terminação da reação em cadeia causada por ddNTP

Figura 4: Sequenciamento de Sanger. Fonte: Adaptada de Dreamstime.

Figura 5: Sequenciamento de próxima geração. Fonte: Dreamstime.

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O NGS é altamente escalável e pode sequenciar genomas inteiros Além dessas técnicas, o sequenciamento de terceira geração é uma
rapidamente, além de ser adequado para uma ampla gama de categoria de tecnologias de sequenciamento de DNA mais avançadas,
aplicações. Contudo, as leituras são mais curtas do que as obtidas com que se distinguem das gerações anteriores por suas capacidades
o sequenciamento de Sanger, e a qualidade das bases pode variar em aprimoradas em termos de leituras longas, rapidez, eficiência e custo.
pontos finais. Também requer recursos computacionais significativos Essas tecnologias oferecem uma visão mais detalhada e precisa dos
para análise de dados. genomas e têm várias características distintivas.
A preparação de amostras é uma fase crucial no processo de
Uma das características mais marcantes do sequenciamento de
sequenciamento de DNA. A qualidade das amostras e a eficiência
terceira geração é a capacidade de gerar leituras muito mais longas
do processo de preparação desempenham um papel fundamental
em comparação com as tecnologias de segunda geração, o que é
na obtenção de resultados precisos e confiáveis e a extração de DNA
extremamente útil para abordar regiões repetitivas do genoma,
é o ponto de partida nessa preparação. Existem diversos métodos de
extração, sendo a escolha do método adequado determinada pela fonte identificar variações estruturais e montar genomas complexos com
do DNA, que pode variar de células, tecidos, sangue a micro-organismos. maior precisão. Ainda, muitas tecnologias de terceira geração permitem
o sequenciamento em tempo real, o que significa que as bases de
DNA são identificadas à medida que são incorporadas na fita de DNA,
simplificando o processo e economizando tempo.
Alguns dos métodos comuns incluem a extração com fenol-clorofórmio,
precipitação salina e o uso de colunas de sílica. Cada método possui Em comparação com o sequenciamento de segunda geração, as
suas vantagens e desvantagens, e a seleção do método apropriado tecnologias de terceira geração frequentemente requerem menos
é fundamental para garantir a pureza e a integridade do DNA. Após a amplificação do DNA de interesse, minimizando potenciais erros de
extração do DNA, é essencial avaliar a qualidade e a pureza do material
sequenciamento introduzidos durante a amplificação. Também exige
obtido. A eletroforese em gel permite verificar o tamanho dos fragmentos
de DNA e sua integridade. Marcas claras e bem definidas indicam um
quantidades menores de DNA para a preparação da amostra, tornando-o
DNA de alta qualidade. útil para amostras com DNA limitado. Alguns exemplos de tecnologias

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de sequenciamento de terceira geração incluem o sequenciamento Essas tecnologias de terceira geração têm uma ampla gama de
de nanoporos, como o MinION da Oxford Nanopore Technologies, e a aplicações, incluindo pesquisa genômica, estudos de variação genética,
síntese sequencial de DNA em tempo real, como a tecnologia PacBio da montagem de genomas complexos, análise de epigenoma e muito
Pacific Biosciences. mais. Elas têm contribuído significativamente para a compreensão mais
aprofundada dos genomas e para avanços em medicina personalizada,
biologia evolutiva e outras áreas da biologia e da pesquisa científica.
Sequenciamento de terceira geração:
Sendo assim, o sequenciamento de DNA desempenha um papel central
Sequenciamento de Nanoporos
nas ciências da vida e na medicina, sendo uma ferramenta essencial para
a pesquisa e diagnóstico. Ele nos permite decifrar a linguagem genética
que codifica a vida, fornecendo informações sobre a hereditariedade,
diversidade genética e evolução; além disso, permite a identificação
de mutações associadas a doenças, auxiliando no diagnóstico precoce
e possibilitando tratamentos personalizados. Como uma ferramenta
versátil, essa técnica continua a revolucionar a compreensão da biologia
e a melhorar os cuidados de saúde, abrindo portas para inúmeras
aplicações e descobertas futuras.

AGTCCTGAGTGAA

Figura 6: Sequenciamento de terceira geração: sequenciamento de nanoporos. Fonte: Adaptada

de Dreamstime.

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 Essas técnicas, juntas, abriram as portas para inúmeras descobertas
e inovações. Elas permitiram o mapeamento completo de genomas,
a identificação de genes associados a doenças, a compreensão dos
mecanismos de regulação gênica e o desenvolvimento de terapias
personalizadas. Também desempenharam um papel fundamental na
evolução da medicina de precisão, permitindo diagnósticos mais precisos
e tratamentos direcionados.

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Agora que chegamos ao fim deste capítulo, você possui um FURUTANI, S. F. et al. Rapid DNA Sequencing Technology Based on the
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que desempenham um papel central na pesquisa em biologia molecular Disponível em: [Link]
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Genética 17