Roteiros

Toxicologia
 Regras básicas de segurança no laboratório

1. Durante a aula prática, mantenha sempre a atenção ao roteiro, tendo-o sempre

próximo a você. Pode ser efetuada uma marcação com caneta sobre cada item realizado,
de forma a não se perder durante a execução.
2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e mesmo antes das explicações do
professor.
3. Não trabalhe com sandálias, chinelos, sapatos abertos e com salto no laboratório.
4. Se tiver cabelos longos, deixe-os presos ao realizar as aulas práticas laboratoriais.
5. Não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios.
6. Utilizar o avental (jaleco) branco, com manga longa e abotoado.
7. Ao simular o posicionamento radiológico em dupla, é recomendado que utilize as
luvas de procedimentos.
8. O livro-texto contribuirá no aprendizado durante as aulas práticas laboratoriais.
 Disciplina: Toxicologia
AULA 1
Título da Aula: Toxicidade de
Instituto de ROTEIRO 1
Ciências da Saúde metais em soluções aquosas

A utilização da cebola como organismo-teste não é recente, vem sendo estudada e

utilizada desde 1938, quando Levan introduziu o uso da espécie Allium cepa (cebola comum)
como sistema de bioensaio para avaliar os efeitos citogenéticos da colchicina em células
vivas (Fiskesjö, 1985). Desde então, a cebola tornou-se um material de larga utilização em
testes de laboratório, devido ao rápido crescimento de suas raízes e à facilidade com que
são observados seus cromossomos em fases de divisão celular. O teste com a cebola tem
sido aplicado em diversas áreas de conhecimento para avaliar a toxicidade de compostos
químicos de interesse ecológico e sanitário. Por exemplo, Fiskesjö (1975) cultivou, em
série, bulbos de cebola em amostras coletadas ao longo do rio Bräan ao sul da Suécia. Os
resultados desse experimento demonstraram que o crescimento das raízes de cebola é
inibido pela presença de substâncias tóxicas quando se encontram dissolvidas na água.

Objetivo
Avaliar o crescimento de raízes de cebolas em soluções aquosas contendo concentrações
crescentes de íons metálicos.
Materiais por grupo
ƒ Solução de sulfato de cobre (400 mg/L) – 1 litro
ƒ Balança
ƒ Espátula
ƒ Proveta de 1 L
ƒ Béquer de 250 mL
ƒ Bastão de vidro
ƒ 16 copos plásticos pequenos descartáveis
ƒ 16 cebolas pequenas
ƒ 1 caixa de palitos de dentes
ƒ 2 pipetas graduadas de 10 e 25 mL
ƒ 2 provetas

Parte experimental
ƒ Pesar 0,4 g de sulfato de cobre e dissolver em 1 litro de água (400 mg/L).
ƒ Preparar as seguintes soluções para colocar nos copos de plástico:
1. Apenas água
2. 1,4 mL de sulfato de cobre
3. 3,0 mL de sulfato de cobre
4. 6,0 mL de sulfato de cobre
5. 12,0 mL de sulfato de cobre
6. 25 mL de sulfato de cobre
7. 50 mL de sulfato de cobre
Completar com água para um volume final de 200 mL.
8. 200 mL de sulfato de cobre (100 mg/L)
ƒ Numerar 16 copos de 1 a 16 (o experimento será feito em duplicata).
ƒ Encher os copos com as soluções até a borda.
ƒ Colocar em cada copo uma cebola, de modo que somente a região radicular fique
em contato com as soluções.
ƒ Utilizar palitos de dentes como suporte para os bulbos da cebola.
ƒ Após sete dias, retirar as cebolas das soluções e, com uma régua, medir o
comprimento médio das raízes.
 Disciplina: Toxicologia
AULA 1
Título da Aula: Toxicidade de
Instituto de ROTEIRO 2
Ciências da Saúde metais em soluções aquosas – parte II

Objetivo
Analisar os resultados do experimento.
 Disciplina: Toxicologia
AULA 2
Título da Aula: Introdução à
Instituto de ROTEIRO 1
Ciências da Saúde espectrofotometria e à Lei de Beer-Lambert

Objetivo
Aprender os princípios da técnica e a sua utilização.

Materiais por grupo

ƒ Espectrofotômetro
ƒ 2 cubetas
ƒ Solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L) – 200mL
ƒ Pipetas graduadas

Parte experimental

Parte I: Varredura em espectrofotômetro.

1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para = 415 nm.

2. Adicionar água destilada à cubeta de quartzo tomando cuidado para que o volume
adicionado permita a passagem da amostra do feixe de luz emitido no interior do aparelho.
3. Limpar a cubeta com papel-absorvente.
4. Zerar o aparelho.
5. Adicionar a solução de alaranjado de metila (4,0 mg/L).
 6. Anotar o valor de absorbância indicado no aparelho.
7. Ajustar novo comprimento de onda no aparelho e repetir os itens 2 a 6.
8. Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos em cada comprimento de
onda ajustado no aparelho.

(nm) Abs
415
445
460
490
520
535

9. Obter o pico de absorbância para análise de solução de alaranjado de metila por

espectrofotometria.

Parte II: Construção de curva de calibração para análise em espectrofotômetro.

1. Nomear seis tubos de ensaio, cinco deles como: 1, 2, 3, 4 e 5 e um como B.
2. Seguir a tabela a seguir para preencher os tubos de 1 a 5 e o tubo B. Calcular a
concentração das soluções.

Amostra AM (mL) H2O (mL) C (mg/L) Abs

B --- 5,0
1 1,0 4,0
2 2,0 3,0
3 3,0 2,0
4 4,0 1,0
5 5,0 ---
 3. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para o comprimento de onda determinado
na Parte I.
4. Adicionar a solução do tubo B à cubeta de quartzo.
5. Limpar a cubeta com papel-absorvente.
6. Zerar o aparelho.
7. Adicionar a solução do tubo 1 à cubeta de quartzo.
8. Anotar o valor de absorbância indicado no aparelho.
9. Repetir o procedimento com os demais tubos.
10. Completar a tabela com os valores de absorbância obtidos em cada comprimento de
onda ajustado no aparelho.
11. Montar a curva de calibração Absorbância x Concentração.

Parte III: Determinação da concentração de uma solução de alaranjado de metila.

1. Ajustar o comprimento de onda no aparelho para o comprimento de onda determinado
na Parte I.
2. Adicionar água destilada à cubeta.
3. Limpar a cubeta com papel-absorvente.
4. Zerar o aparelho.
5. Adicionar a solução de alaranjado de metila de concentração desconhecida na cubeta
de quartzo.
6. Anotar o valor de absorbância indicada no aparelho.
7. Utilizando a equação de reta (obtida na Parte II), determinar a concentração de
alaranjado de metila na amostra desconhecida.
 Disciplina: Toxicologia
AULA 2
Título da Aula: Determinação
Instituto de ROTEIRO 2
Ciências da Saúde de nitrito em alimentos

Objetivo
Determinar os teores de nitrito como conservante em amostra de salsicha para verificar
se estão dentro dos limites máximos permitidos segundo a legislação brasileira preconizados
pelo Ministério da Agricultura.

Procedimento
Padronização
1. Alíquotas de 1, 2, 4, 8, 16 mL da solução padrão de nitrito de sódio; adicionar 5 mL do
tampão em 100 mL de H2O.
2. Solução a ser utilizada: 10 mL de cada alíquota em 100 mL de H2O.
3. Adicionar 5 mL de cada solução (2) em 10 mL de reagente cromogênico e
5 mL de H2O + 5 mL tampão.
4. Deixar em banho de H2O a 30 ºC por 30 minutos.
5. Leitura espectrofotométrica em 474 nm.

Obs.: o branco se constituirá de 10 mL do reagente cromogênico em 10 mL de água +

5 mL tampão.
 Desproteinização
Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL. Adicionar 5 mL da
solução I (bórax) e cerca de 40 mL de água destilada, em temperatura acima de 70 ºC.
Aquecer em banho de água fervente por 15 minutos, agitando frequentemente. Deixar
esfriar à temperatura ambiente. Adicionar 2 mL da solução II (ferrocianeto de potássio) e 2
mL da solução III (acetato de zinco). Agitar vigorosamente após cada adição.
Transferir a amostra para um balão volumétrico de 100 mL. Deixar o balão em repouso
por 30 minutos à temperatura ambiente.
Completar o volume com água destilada. Agitar o conteúdo do balão vigorosamente
e filtrar em papel livre de nitritos. Determinar a concentração de nitrito presente nessa
solução.

Determinação de nitrito
Pipetar 10 mL da solução desproteinizada da amostra de alimento para um tubo de
ensaio. Adicionar 5 mL da solução tampão e 10 mL da solução de alfa-naftol.
Deixar em banho de água a 30 ºC, durante 30 minutos, esfriar à temperatura ambiente:
ler em 474 nm.
Calcular o valor de nitrito presente na amostra, usando a curva padrão previamente
estabelecida.
 Materiais Quantidades
Acetato de zinco di-hidratado - Zn(CH3COO)2 220 g
Ácido acético 50 mL
Ácido sulfanílico 0,25 g
Ácido acético glacial 30 mL
Água destilada 2L
Alfa-naftol 0,20 g
Amostra de salsicha
10 g
Ferrocianeto de potássio
106 g
tri-hidratado K4Fe(CN)6 . 3H2O
HCl 20 mL
NaNO2 0,25 g
NH4OH 50 mL
NH4OH a 10% 90 mL
Tetraborato de sódio
50 g
deca-hidratado (Na2B4O7. 10 H2O)
Equipamentos Quantidades
Bagueta de vidro 1
Banho de água fervente 1
Béqueres de 100 mL 3
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 1
Espectrofotômetro 1
Funil de vidro de 100 mL 1
Papel de filtro 2
Papel-universal PH 2 fitas
Pipeta (capacidade de 1 mL) 2
Pipeta (capacidade de 10 mL) 2
 Disciplina: Toxicologia AULA 3
Instituto de Título da Aula: Determinação de salicilemia ROTEIRO 1
Ciências da Saúde

Objetivo
Determinar as concentrações de salicilato em amostra de plasma ou soro para verificar
se estão dentro dos padrões da monitorização terapêutica e urgência.

Amostra
Soro, plasma ou urina, conforme finalidade da análise.

Reagentes e soluções
1. Soluções-padrão de salicilatos (500 mg de ácido salicílico/100 mL): dissolver 580 mg
de salicilato de sódio em 100 mL de água destilada, adicionar gotas de clorofórmio como
conservante e manter a solução sobre refrigeração (estável durante 6 meses).
2. Reativo cromogênico (Trinder): dissolver, com aquecimento, 40 g de HgCl em 850 mL
de água destilada com aquecimento. Resfriar, adicionar 120 mL de solução de HCl 1N, 40 g
de Fe(NO3)3.9H2O e completar o volume até 1 L, com água destilada. Essa solução é estável
por tempo indefinido.

Obs.: atenção com o mercúrio: aquecimento em capela, sob exaustão. Vapores

tóxicos!
 Técnica
1. Transferir para 3 tubos de centrífuga, respectivamente, 1 mL de soro, plasma ou urina
(amostra), 1 mL da solução padrão adicionada ao branco de soro ou plasma (voluntários
não expostos a salicilatos) em concentração correspondente a 20 mg% (controle) e 1 mL
de branco em soro, plasma ou urina (branco).
2. Adicionar 5 mL do reativo de Trinder sob agitação (Vórtex), agitar por mais alguns
segundos e centrifugar por 5 minutos (2000 rpm).
3. Transferir o sobrenadante (límpido) para outros 3 tubos.
4. Ler a absorbância (540 nm) do produto colorido formado na amostra e no controle,
contra o branco de soro ou plasma.
5. Determinar a concentração por meio de uma curva de calibração construída
previamente.
6. Curva de calibração: a concentração de salicilato presente na amostra é calculada
com o auxílio de uma curva de calibração construída a partir de alíquotas da solução padrão
adicionadas ao branco de soro ou plasma em concentrações correspondentes a 5, 10, 20,
30 e 40 mg de ácido salicílico/100 mL. As leituras espectrofotométricas são feitas contra o
branco de soro ou plasma. As absorbâncias são projetadas em ordenadas e a concentração
(mg%), em abcissas.

Parâmetros de validação
O limite de quantificação (LQ) desse método é de 5 mg%. No intervalo dinâmico
considerado (5-40 mg%), ele é linear e a precisão mostra coeficiente de variação (CVs) que
vai de 2,5 a 8,3%.
 Interpretação
Os níveis terapêuticos de salicilato estão acima de 100 mg/L de soro, os valores tóxicos
encontram-se acima de 200 mg/L e os letais, acima de 500 mg/L.
Nota: a presença de fenotiazínicos pode interferir nos resultados.

Materiais Quantidades
Salicilato de sódio 580 mg
Água destilada 1100 mL
HgCl2 (cloreto mercúrico) 40 g
Ácido clorídrico 10 mL
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico nona-hidratado 40 g
Soro 10 mL

Equipamentos Quantidades
Espectrofotômetro para a região visível (540 nm) 1
Agitador (Vórtex) 1
Centrífuga 1
Tubo de ensaio 2
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 1
Micropipeta (capacidade de 1000 µL) 1
Micropipeta (capacidade de 500 µL) 1

Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Compostos

mercuriais: incineração.

Laboratório de informática
O objetivo é que os alunos façam os gráficos referentes à aula de espectrofotometria.
 Referências
MORAES, R. F. L. Determinação de salicilemia em crianças portadoras de artrite
reumatoide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. São Paulo, Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da USP, 1986. (Dissertação de Mestrado).

MORAES, R. F. L.; SIQUEIRA, M. E. P. B. Toxicologia Analítica. Rio de Janeiro: Guanabara

Koogan, 2008.
 Disciplina: Toxicologia
AULA 3
Título da Aula: Identificação
Instituto de ROTEIRO 2
Ciências da Saúde de aflatoxina por CCD

Objetivo
Identificação por CCD com extração por solventes orgânicos de micotoxinas (aflatoxinas
B1, B2, G1 e G2) presentes em alimentos, sementes, grãos ou rações.

Amostra
Amendoim cru.

Reagentes e soluções
Metanol; solução de cloreto de potássio 4%; clorofórmio; solução de sulfato de cobre
10%; sistemas solventes; clorofórmio:acetona (9:1).

Técnica
1. Extração: pesar 50 g de amendoim em um Erlenmeyer de 500 mL. Deixar em béquer
ou Erlenmeyer por 3 dias, com um pouco de umidade. Adicionar 270 mL de metanol e 30
mL de solução de cloreto de potássio 4%. Agitar mecanicamente por 30 minutos. Filtrar em
papel de filtro (obs.: a quantidade mencionada é suficiente para toda a turma e não para
cada grupo).
 2. Purificação do extrato: em um béquer de 500 mL do extrato filtrado na fase anterior,
adicionar 150 mL da solução de sulfato de cobre 10%. Agitar a mistura com bastão de vidro
e filtrar através de papel de filtro.

3. Extração líquido-líquido: em um funil de separação de 500 mL, transferir 150 mL

do filtrado anterior. Adicionar 150 mL de água e extrair 3 vezes (por 2 minutos) com 20
mL de clorofórmio. Juntar os extratos clorofórmicos e evaporar à secura no rotavapor ou
em chapa de aquecimento na capela. Lavar a parede do frasco do rotavapor ou béquer (no
caso de evaporação na chapa de aquecimento) com clorofórmio e transferir o lavado para
o balão volumétrico de 5 mL. Conservar em geladeira, envolto em papel-alumínio.

4. CCD: ressuspender o extrato com etanol/éter (aproximadamente 0,5 mL) e aplicar em

cromatoplaca. Colocar a cromatoplaca em cuba de desenvolvimento contendo o sistema
solvente clorofórmio-acetona (9:1). Após o desenvolvimento das placas (10 cm), retirá-las
das cubas e deixá-las à temperatura ambiente para a completa evaporação do solvente.

Interpretação
Observar a presença da aflatoxina, quando exposta ao transluminador de UV.

Materiais Quantidades
Cloreto de potássio 2g
Clorofórmio 100 mL
Metanol 300 mL
Equipamentos Quantidades
Balão volumétrico de 25 mL 1
Bastão de vidro 2
Béquer de 500 mL 1
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 2
 Erlenmeyer de 500 mL 1
Espectrofotômetro para a região do UV 1
Funil de separação de 500 mL 1
Papel de filtro 2
Placas cromatográficas de
1
sílica gel (0,25 mm de espessura)
Rotavapor 1
Tubo de ensaio 2
Papel-alumínio

Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança.