Métodos

Espectroscópicos

Espectroscopia RMN
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 O que é a espetroscopia?

Resposta molecular a estimulo radioativo que é quantizado

(“engrenado”).
(Molécula = núcleo + eletrões).

Excitação

1. Eletrónica (espetro UV-Visível)

2. Vibracional (IV)
3. Rotação (microonda)
4. Orientação do spin Nuclear no campo magnético (RMN).

2
Espetro eletromagnético
High Nuclear magnetic resonance
Frequency () Low
High Energy (E) Low
Short Wavelength () Long
Frequency 1.2 x 1014 Hz 3 x 108 Hz

3 x 1019 Hz 3 x 1016 Hz 1.5 x 1015 Hz 2 x 1013 Hz 3 x 1011 Hz 1 x 109 Hz 6 x 107 Hz

4 x103cm-1

1.25 x104cm-1
Wave Number 2.5 x104cm-1 0.002 cm-1

1 x109cm-1 1 x107cm-1 5 x104cm-1 667cm-1 10 cm-1 3 cm-1 0.01 cm-1

Cosmic
Vacuum
& X-Ray Infrared Microwave Radio Frequency
UV
 Ray

0.01 nm 10 nm 1 mm 30 cm 1m 5m

Wavelength 200 nm 400 nm 800 nm 2.5  15 

Near Visible Vibrational Nuclear

Ultraviolet Infrared Magnetic
Blue Red
Resonance 4
RMN
6
7
8
 RMN

É uma técnica de pesquisa que explora as propriedades

magnéticas de certos núcleos atómicos para determinar
propriedades físicas ou químicas de átomos ou
moléculas nos quais eles estão contidos.

Baseia-se no fenómeno da ressonância magnética

nuclear e podem prover informações detalhadas sobre
a estrutura, dinâmica, estado de reação e ambiente
químico das moléculas.

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 RMN
É uma técnica para determinar o número, o tipo e a posição
relativa de um certo núcleo numa molécula.

Está relacionada com as propriedades magnéticas desse

mesmo núcleo.

Os mais importantes são: Protões (1H) and Carbono-13 (13C)

Outros 19F, 31P e 15N ,14N

Se colocarmos estes núcleos num campo magnético,

eles podem se alinhar com o ou contra o campo
magnético rodando os seus spins no sentido dos
ponteiros do relógio ou ao rodando ao contrário dos
ponteiros do relógio.

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 RMN
=I
+

Bo

Para núcleos que não posseum spin, como é o caso do carbono-12,

não há diferença de energia quando se alinham os spins, visto que
eles não são magnéticos. Por isso não se pode fazer RMN de carbono
12. 11
 RMN

Mais frequentemente, espetroscopia RMN ou NMR (nuclear molecular

resonance) é usada por químicos e bioquímicos para investigar as
propriedades de moléculas orgânicas, embora seja aplicável para qualquer
núcleo que possua spin.

Em mecânica quântica o termo spin associa-se, sem rigor, às possíveis

orientações que partículas subatómicas carregadas como protões e alguns
núcleos atómicos podem apresentar quando imersas em um campo
magnético.

Isto é válido de compostos pequenos analisados até grandes proteínas ou

ácidos nucleicos usando técnicas de análise em 3 ou 4 dimensões.

O impacto da espetroscopia NMR nas ciências naturais tem sido

substancial, e pode ser aplicado em uma larga variedade de amostras em
solução e estado sólido.

12
 Espetroscopia de Ressonância
Magnética Nuclear (RMN)

RMN é um fenómeno que ocorre quando os núcleos de certos átomos imergem

num campo magnético, e expostos a um segundo campo magnético oscilante.
Alguns núcleos sofrem a denominada ressonância, e outros não, consoante
possuem ou não spin (relacionado com o nº de neutrões).
14
15
16
 RMN
A ressonância magnética nuclear de abreviatura RMN é uma técnica analítica para o estudo
estrutural de compostos orgânicos e organometálicos, que se baseia na transição entre os
diversos níveis energéticos produzida pela absorção de energia de alta frequência
(radiofrequência) que tem lugar quando um núcleo atómico com spin (momento angular
intrínseco) não nulo é submetido a um campo magnético estacionário de intensidade
própria.

O fundamento físico deste fenómeno baseia-se no facto de que, num campo magnético
uniforme e intenso, os momentos magnéticos nucleares se orientam unicamente em
determinadas direções, correspondentes a valores energéticos específicos.
A ressonância produz-se quando um quantum de energia eletromagnética é igual à
diferença de energias entre duas orientações do momento magnético nuclear. A absorção
desta quantidade de energia faz com que o momento magnético nuclear passe da
orientação com energia mais baixa à que tem energia mais alta.
Esta técnica permite medir momentos magnéticos nucleares.
Dado que os valores de energia variam de forma significativa com o retorno do núcleo, é
possível obter-se informação sobre a estrutura do composto em estudo.
A ressonância magnética nuclear tem grande aplicação nas análises químicas de produtos
conhecida como espetroscopia RMN, em química orgânica e na medicina moderna.
17
Técnicas básicas de RMN
• A amostra RMN é preparada em um tubo de vidro de paredes finas - um tubo
de RMN.

• Na presença de um campo magnético, núcleos ativos à NMR (tais como 1H ou

13C) absorvem radiação eletromagnética a uma frequência característica do
isótopo. A frequência de ressonância, a energia de absorção e a intensidade
do sinal são proporcionais à força do campo magnético.

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O núcleo (protões) comporta-se como pequenos magnetes (orientação
aleatória).

Num campo magnético estes organizam-se a favor (α, menor energia)

ou contra (β, maior energia) o campo.

19
Após absorção de luz, o Spin roda, e entra em
Ressonância => Linha Espectral

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0 é proporcional ao H0

H0 é específico para cada elemento/isótopo

Para 1H: H0 = 21150 gauss, 0 = 90 MHz.

Se H0 = 70500 gauss, 0 = 300 MHz.

H (Terra): 0.7 gauss!

E (300 MHz) ~ 10-5 kcal mol-1.

RMN núcleo “activo”:

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RMN

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Os electrões na vizinhança do Núcleo afetam a 

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Considerando o protão H+ sem eletrões, sem blindagem,
pico mais distante para a esquerda.

Os eletrões causam blindagem: Pico move-se campo

alto (para a direita).

O grupo eletroatractor causa desblindagem (para a esquerda).

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27
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Desvio químico

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Aplicação do desvio

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32
 Desvio químico
R
NH
R
OH

Ph R H
Me
OH
(R) TMS = Me Si Me
HO CH3 Ph CH3 Me
R R
R O R R
O
Cl NR2 O
H H H OCH3 CH3 CH3 CH3
R CH3
TMS

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Downfield region  ppm Upfield region
of the spectrum of the spectrum

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 RMN
Desvio Químicos
• Os desvios químicos dos C-H aumentam com o aumento da
substituição..

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Hs quimicamente equivalentes: mesmo desvio. Usar
operações de simetria: rotações, planos de simetria.

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 RMN
Integrais

3H'S
O

O CH3 O
O
H H 3C O
O H
3H'S

2 H'S

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 Integração
Área sobre o pico = relativa de Hs associados.
Cálculo-computacional automático.
Ajuda na atribuição dos picos.

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 Desdobramento de spin-spin

O que acontece quando temos

protões vizinhos? Existe
desdobramento de sinais nós
temos mais linhas.

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 Desdobramento de spin-spin

O que acontece quando temos

protões vizinhos? Existe
desdobramento de sinais nós
temos mais linhas.

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 RMN
1,1,2-Trichloroethane
Acoplamento 1H - 1H

Possible spin
combinations of
adjacent protons

+1 0 -1 +1/2 -1/2 Net Spin

1 2 1 1 1 Signal Intensity

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 RMN
Acoplamento 1H - 1H
Note that the signal produced
by HA + HA' is twice the size
of that produced by HB

HA HB

HA' C C
HA + HA' HB
HA and H A' appear at t he same HB is split into three lines
chemical shift because they are because it feels the magnetic
in identical environments field of HA and HA'
They are also split into two lines
(called a doublet) because they
feel the magnetic f ield of HB.

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 Regra n+1

n hidrogénios adjacentes equivalentes (i.e. hidrogénios em

carbonos vizinhos) dão origem a (n+1) picos.

ex., dupleto (d), tripleto (t), quarteto (q), quinteto (quin), etc.

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A constante de acoplamento (J) é independente do campo: A mesma a 90,
300, etc. MHz
Gama: 1-18 Hz.
Para mais do que um vizinho: o H “vê” todas as combinações 2, 3 dos
vizinhos.

Assim, dois Hs vizinhos:

Três Hs vizinhos:

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 RMN
Se um protão tem n protões vizinihos que são equivalentes, o pico irá se
desdobrar e, n+1 picos.
no. of neighbors relative intensities pattern example
0 1 singlet (s)

H H
1 1 1 doublet (d)
C C
H H
2 1 2 1 triplet (t) C C H
H H
3 1 3 3 1 quartet (q) C C H
H H H H

4 1 4 6 4 1 pentet C C C H

H H H H

5 1 5 10 10 5 1 sextet H C C C H
H H H H

6 1 6 15 20 15 6 1 septet H C C C H
H H

that this pattern only holds for when the neighboring protons are
equivalent
 RESUMO
1. Protões equivalentes não mostram desdobramento
(splitting).
2. J é independente do H0.
3. Hs não adjacentes J ~ 0.
4. Regra (N+1). Razões do triângulo de Pascal.
5. O splitting é mútuo. Se há um pico de separação, terá que
haver (no mínimo) outra.

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Desdobramentos de grupos etilo
Desdobramento dos grupos de
isopropilo
 Constantes de acoplamento

• Distância entre dois picos de um multipleto

• Medido em Hz
• Não depende da força do campo externo.
• Multipletos com a mesma constante de
acoplamento podem advir de grupos adjacentes
que se desdobram um ao outro.
Valores de constantes de acoplamento
 Desdobramento do complexo
a c
H H
C C
Hb

• Sinais podem ser desdobrados por protões adjacentes diferentes,

com diferentes constantes de acoplamento.

• Exemplo: Ha do estireno o qual é desdobrado por o H adjacente

trans (J = 17 Hz) e pelo adjacente cis (J = 11 Hz).
Árvore de desdobramento
H
a
H
c
C C
Hb
Espectro do Estireno
 Não equivalente estereoquímica

• Normalmente, dois protões no mesmo carbono são

equivalentes e não causam desdobramento entre si.

• Se a substituição em cada carbono por protões do grupo -CH2

com um imaginário “Z” forma estereoisómeros, então os
protões são não equivalentes e podem causar desdobramento
um ao outro.
Alguns protões não equivalentes
a c c
H H H OHa
C C
dH Hb
Hb

CH3
H Cl
aH Hb
Cl
 Dependente do tempo
• Moléculas dão “cambalhotas” relativamente ao campo
magnético portanto o RMN é uma média do espectro de todas
as orientações.
• Protões axiais e equatoriais interconvertem-se no ciclohexano
muito rápidamente pelo que dão um único sinal.
• Transferência de protões no OH e NH pode ocorrer tão
rápidamente pelo que o protão não causa o desdobramento
dos protões adjacentes.
 Protões hidroxilo
• Amostras ultrapuras de etanol
mostram desdobramento.

• Etanol com pequena

quantidade de impurezas de
ácido ou base não mostra
desdobramento.
 Protão N-H

• Moderada razão de troca.

• Pico pode ser largo.

=>
Identificação do pico O-H ou N-H

• Desdobramento químico dependerá da concentração e solvente.

• Para verificar um pico particular se deve ao grupo O-H ou N-H,

adicione uma amostra com D2O.

• Deuterium vai trocar com os protões com o protão do O-H ou N-H.

• No segundo RMN o pico estará ausente, ou muito menos intenso.

 RMN
Espectros de 1H NMR dão-nos informação sobre a
estrutura dos compostos

1) O desvio químico informam-nos sobre o tipo de protão

que temos.

2) Integrais – dizem-nos quantos protões de cada tipo nós

temos na nossa amostra.

3) Acoplamento 1H - 1H coupling – dão-nos informação

sobre os protões vizinhos.

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 RMN
• Estudando os picos dos espectros de RMN, os químicos
podem determinar a estrutura de diversos compostos.
Esta técnica pode ser muito selecttiva, podendo
distinguir diversos átomos de uma molécula de uma
coleção de moléculas que apenas diferem do seu
ambiente químico.

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 Carbono-13

• 12C não tem spin magnético.

• 13C tem um spin magnético, mas é apenas 1% da amostra de carbono

.

• A razão giromagnética do 13C é ¼ do 1H.

• Sinais fracos perdem-se no ruído.

• Centenas de espectros são tirados, aparece a média.

Espectroscopia de 13C RMN

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74
75
 Desdobramento de Spin-Spin
• É negligenciável o desdobramento por parte
de um 13C ao 13C adjacente.
• 13C poderá acoplar magneticamente com os
protões adjacentes.
• Este complexo padrão de desdobramentoé
dificil de interpretar.
Desacoplamento do spin de protão
• Para simplificar o espectro, os protões estão continuamente a
ser irradiados com o “ruído”, pelo que seus spins
rápidamente “cambalhotam”.
• O núcleo de carbono vê uma média de todos os possíveis
estados de spin.
• Portanto, cada diferente tipo de carbono origina um único
sinal não desdobrado.
 Desacoplamento desligado (???)
• O núcleo de 13C são desdobrados sómente por protões ligados a eles.

• A regra N + 1 aplica-se: o carbono com número de protões N origina

um sinal com
N + 1 picos.
79
Deslocamento químico do hidrogénio e do carbono
Combinar spectra 13C e 1H
 Diferenças na técnica de 13C

• Frequência de ressonância é ¼, 15.1 MHz em vez de 60 MHz.

• Àreas dos picos não são proporcinais ao número de carbonos.

• Àtomos de carbono com mais hidrogénios absorvem mais

fortemente.
 Interpretação de RMN 13C
• O número de diferentes sinais indicam os diferentes tipos de
carbonos.

• O sua localização (deslocamento químico) indica o tipo de grupo

funcional.

• A area do pico indica o número de carbonos (quando integrado).

• O padrão do desdobramento indica o número de protões ligados ao

carbono.
Dois spectra de RMN 13C
RMN 13C - DEPT
DEPT -Distortionless enhancement by
polarization transfer

- Permite distinguir os diversos tipos de

carbono (primários (CH3), secundários (CH2),
terciários (CH) e quaternários

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RMN 13C - DEPT

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Aplicações

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 RMI
• Ressonância magnetica de imagem, não invasiva

• “Nuclear” é omitida porque pode levar à ideia de que é radioactiva

• Sómente protões de um plano podem estar em ressonância ao

mesmo tempo.

• Computador põe em conjunto “camadas” para obter 3D.

• Tumores são imediatamente detectados.

 RMN

• Funciona melhor em solução. RMN de sólidos não é

muito preciso.
– Não é preciso cristalização

• Apenas pode analisar proteínas que sejam tenham

<300aa.
– A maior parte das proteínas são muito maiores
–

• As proteínas tem que ser estáveis.

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 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR)

13CP-MAS NMR spectrum: a) TMS, b)

[C16Pyr][AmphB], c) [C3OMIM][AmphB], d)
[C2OHMIM][AmphB].

[C16Pyr][AmphB] 1H-NMR
spectrum in (CD3)2SO

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Aplicações

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 Aplicações:
proteómica
A espectroscopia mediante ressonância magnética nuclear de
proteínas, também chamada de RMN de proteínas, é um campo
da biologia estrutural no qual se utiliza espectroscopia RMN
para obter informação sobre a estrutura e dinâmica das
proteínas. O campo foi desenvolvido por Kurt Wüthrich entre
outros, que compartilhou o Prémio Nobel de química em 2002.
As técnicas de RMN utilizam-se de foma rotineira no âmbito
académico e na indústria de biotecnologia. A determinação da
estrutura das proteínas mediante espectroscopia RMN, no geral,
consiste em várias fases sucessivas, cada uma delas utilizando
um conjunto de técnicas altamente especializadas. A amostra é
preparada, atribuem-se as ressonâncias, geram-se as restrições
e calcula-se e valida-se a estrutura.

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Imagem por ressonância magnética (MRI)
- Tomografia por RMN
Vantagens
Ausência de radiações ionizantes.
Alta resolução.
Elevado contraste (densidade, T1 ou T2).
Utilização de outros núcleos (31P, 23Na).
Estudos dinâmicos (fluxo sanguíneo, batimento cardíaco).

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