RECUPERAÇÃO
DISCIPLINA – MICROBIOLOGIA
TÉCNICO EM QUÍMICA
João Pedro do Nascimento Valilla
MATÃO
2024
INTRODUÇÃO
A microbiologia é uma ciência de extrema importância para a humanidade. É por meio
dela que a manipulação microbiana é possível, abrangendo fungos, vírus, protozoários e
bactérias. Este último grupo de micro-organismos tem grande utilidade em diversos setores da
sociedade, como o alimentício e o farmacêutico. Para possibilitar o estudo desses organismos, é
essencial o aprendizado de diversos métodos, o uso de materiais específicos e a aplicação correta
de técnicas. Esse conjunto de materiais e métodos, quando utilizado de maneira adequada, é
responsável por classificar os micróbios e realizar a multiplicação artificial deles, além de inibir
diversos fatores que dificultam esses estudos, como a contaminação, por exemplo.
A partir disso, discute-se a utilidade dos meios de cultura. Eles são espaços que contêm
nutrientes que podem ser usados por micro-organismos para se reproduzir, portanto, são
essenciais e devem ser tratados como um método prático e eficaz para o cultivo, ou seja,
multiplicação de bactérias em laboratório. Ele pode ser classificado de acordo com alguns
critérios: sólido ou líquido, seletivo ou diferencial e mínimo ou complexo. Um meio de cultivo
sólido é feito em placas de Petri com o uso de ágar, que é um composto altamente nutritivo, que
permite que bactérias se reproduzam com facilidade. Um meio de cultivo líquido é feito em
tubos de ensaio, geralmente com o uso de caldos enriquecidos, também altamente nutritivos. Um
meio de cultivo seletivo é definido como um meio que inibe o crescimento de bactérias não
essenciais para determinado estado. Um meio de cultivo diferencial é, ao contrário do meio
seletivo, um meio que permite a proliferação de diferentes bactérias. Um meio de cultivo mínimo
é aquele que possui apenas nutrientes essenciais para o crescimento bacteriano, enquanto um
meio de cultivo complexo tem a composição variada e indefinida, incluindo outros tipos de
substâncias.
Se tratando da esterilidade dos componentes, o preparo de alguns materiais é o que
possibilita a inibição de micro-organismos que possam interferir em diversas análises. Entre eles
está o tampão de algodão, a embalagem dos materiais, tais como as placas de Petri que serão
usadas e o ágar, e a esterilização por altoclave. A fim de entendimento, a autoclave é um
equipamento que utiliza calor úmido e pressão para destruir as estruturas de possíveis bactérias
que podem interferir nos processos microbiológicos.
Técnicas como a inoculação bacteriana e o antibiograma são amplamente utilizadas para
a multiplicação e a qualificação de bactérias e compostos relacionados a elas. A inoculação
bacteriana é feita com o objetivo de recolher amostras de diferentes lugares para realização de
análises de qualidade, tal como o ar, por exemplo. Já o antibiograma é a utilização de
antibióticos em meios de cultura para a observação da resistência bacteriana, bem como a
eficiência desses medicamentos.
As técnicas de esgotamento e o enriquecimento em caldo BHI diferem muito dessas
técnicas anteriormente citadas. A primeira é feita para isolar micro-organismos de uma amostra
coletada e cultivada anteriormente. É uma técnica importante que possibilita a seleção de
bactérias de um gênero específico para realizar estudos. Já a segunda técnica é feita
multiplicação de organismos em baixas concentrações ou que possuem necessidades específicas.
Utiliza-se o caldo BHI, pois é altamente nutritivo e permite o acelerado crescimento bacteriano.
É uma técnica bem importante para a realização de diagnósticos, pois permite a multiplicação de
bactérias de pacientes hospitalares, além de facilitar o estudo científico. O enriquecimento em
água peptonada é muito semelhante ao enriquecimento em caldo BHI, sendo que essa é feita com
água peptonada.
A coloração de Gram é um método usado para a classificação de bactérias quanto a sua
estrutura. Bactérias podem ser identificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas. Usa-se
compostos como corantes e contra-corantes para tingir as bactérias Gram-negativas, enquanto
que as bactérias Gram-positivas permanecem com a cor original. O teste bioquímico, por outro
lado, mesmo sendo uma técnica que também classifica os micróbios, difere da coloração de
Gram, pois os parâmetros avaliados são outros, como a atividade metabólica. Pode ser usado
para detectar presença de enzimas ou a atividade fermentadora de bactérias, por exemplo.
Por fim, mas não menos importante, temos as técnicas de diluição seriada e o
plaqueamento. A diluição seriada é um método bastante prático e simples. Ela consiste em
diversas diluições de amostras, a fim de reduzir a concentração de bactérias, que posteriormente
serão inoculadas, o que é conhecido como plaqueamento, que consiste na passagem das amostras
para meios de cultura sólido (em placas de Petri contendo ágar).
MATERIAL E MÉTODOS
INOCULAÇÃO E ANTIBIOGRAMA
De acordo com as instruções do rótulo do Ágar Nutriente, foi calculada e utilizada a
quantidade de 5,75 g para 250 mL de água. O soluto e o solvente foram homogeneizados e
colocados em um micro-ondas aos poucos, até que a mistura adquire-se uma consistência
pastosa. Enquanto isso, para a confecção da boneca, foi amarrado um par de barbantes a um
pedaço de tecido semelhante a gaze, contendo em seu interior um pedaço de algodão grande o
suficiente para vedar com eficiência o erlenmeyer. Após a solução ser retirada do micro-ondas,
embalou-se ela e as placas de Petri para, posteriormente, serem levadas a autoclave, que
funcionou por volta de 20 minutos. Os materiais permaneceram armazenados na mesma por
menos de dois dias.
Se higienizou o fluxo laminar com álcool 70%, então foram colocadas as 5 placas de
Petri e o erlenmeyer contendo Ágar Nutriente no interior do aparelho. As placas foram abertas e
a luz UV foi ligada durante 20 segundos. Após isso, a luz UV foi desligada e se verteu
aproximadamente 20 mL da solução de Ágar em cada placa. Por fim, a luz UV foi acionada
novamente durante 2 minutos até que a solução de nutrientes endurecesse (Figura 1).
Figura 1: Placas contendo Ágar no fluxo laminar
Após todo o procedimento, se separou duas placas para amostragem de micro-
organismos presentes no ar. Uma das placas foi posta destampada em cima da bancada do
laboratório biológico do IFSP - Matão durante 5 minutos e a outra em cima de uma das mesas
presente na sala destinada aos estudos da mesma instituição. Nas outras duas placas, se coletou
com ajuda de um Swab amostras da pelagem de um cachorro e na segunda se coletou micro-
organismos da bucha de lavagem do laboratório biológico. Cada um dos Swab, antes de
colocados em contato com os locais de interesse, foram passados em uma solução salina atrás da
chama e então, depois de coletados os micro-organismos foram espalhados cuidadosamente no
Ágar (Figura 2) de suas respectivas placas, também atrás da chama do Bico de Bunsen. Esse
espalhamento foi feito de maneira que cobrisse todo o Ágar presente no meio de cultura. Ao
final, Casa uma das placas foi identificada com o local da coleta de amostra de bactérias do ar e
de superfície (Figura 3) e levadas à estufa BOD, a uma temperatura de 36° C por
aproximadamente 24 horas.
Figura 2: Passagem dos micro-organismos presentes no Swab para uma determinada placa
Figura 3: Placas identificadas com os locais de coleta das amostras de micro-organismos
Pegou-se então uma placa de Petri que possuía a bactéria do gênero Escherichia coli, foi
coletada a amostra com o auxílio de uma alça de platina e diluída em solução salina de
concentração 0,9%. Um swab foi mergulhado nesse líquido e aplicado em meio de cultura
estéril. Após a aplicação, foram adicionados os discos de antibióticos. Por fim, levou-se a placa
de Petri contendo as bactérias e antibióticos a uma estuda BOD por 24 horas a uma temperatura
de 36° C.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
INOCULAÇÃO E ANTIBIOGRAMA
Após o tempo na estufa, observou-se os seguintes resultados referentes às inoculações
das bactérias do ar e superfície, além das características das colônias, conforme demonstrado na
Tabela 1:
Amostragem Forma Elevação Margem Abundância Riqueza
Ar (Laboratório) Circular Plana Inteira Escassa Pobre
Ar (Sala de Estudos) Circular e Plana Inteira e Escassa Pobre
Flamentos Lobulada
a
Superfície Irregular Plana Inteira, Abundante Rica
(Cachorro) Ondulada e
Lobulada
Superfície (Bucha) Irregular e Plana Ondulada e Escassa Rica
Rizóide Lobulada
Tabela 1: Características visíveis dos microrganismos cultivados.
A amostragem do ar do laboratório, bem como a amostragem do ar da sala de estudos
resultou em poucas formações de colônias. isso pode ser resultado de inoculação feita de maneira
incorreta. Já a amostragem da superfície de cachorro demonstrou um resultado totalmente
diferente, já que o próprio animal em si percorre diferentes lugares no campus, estando
constantemente em locais sujos, além da falta de banho. Tudo isso contribuiu para formação de
colônias em abundância. Por fim, as colônias formadas a partir da superfície da bucha foram
escassas, mas bastante ricas no quesito aspectos. Talvez porque a bucha está em constante
contato com detergente, o que é um componente que mata bactérias a partir da desestruturação
de suas estruturas. Para fins de curiosidade, anotou-se na tabela os aspectos físicos das colônias,
tais como a elevação e a forma.
Após o tempo na estufa, obteve-se os seguintes resultados referentes ao antibiograma,
conforme demonstrado na Tabela 2:
Antibiótico Tamanho do Halo (mm) Resultado
AMP - -
CTX 23 Sensível
CIP 30 Sensível
CLO 40 Sensível
PEN 0 Resistente
SUT 0 Resistente
AMC 33 Sensível
TET 36 Sensível
Tabela 2: Tamanho dos halos formados ao redor de cada antibiótico e sua eficiência a
determinadas bactérias.
As bactérias mostraram-se sensíveis aos antibióticos: CTX, CIP, CLO, AMC e TET. Esse
resultado é confirmado ao notar-se a formação de halos ao redor dos antibióticos. Isso significa
que não houve crescimento bacteriano ao redor desses medicamentos. Paralelo a isso, os
antibióticos: PEN e SUT, não mostraram eficiência, já que não foi observado a formação de
halos, significando que houve crescimento bacteriano ao redor dos medicamentos.
MATERIAL E MÉTODOS
AVALIAÇÃO MICROBIANA EM ALIMENTOS
Inicialmente 25g de palmito foram vertidas em um erlenmeyer contendo 225 mL de água
peptonada, posteriormente sendo levado a estufa BOD por 3 dias. Após esse período, foi
realizada uma diluição seriada do conteúdo. Primeiramente pegou-se, com auxílio de uma
micropipeta de 1000µL, esse mesmo volume do alimento enriquecido em água peptonada e se
passou para tubos de ensaios enumerados em 10-², 10-³, 10-⁴ e 10-⁵ e, por fim, foi usado um
vórtex para homogeneizar.
Após as diluições, 4 placas de Petri contendo Ágar Nutriente foram inoculadas com 100
µL das diluições preparadas. O método de plaqueamento foi o mesmo: 100 µL da respectiva
diluição foi colocado na placa e o conteúdo foi espalhado com a alça de Drigalski.
Outras 4 placas seguindo o mesmo método foram feitas, porém essas com Ágar
Macconkey (meio seletivo e diferencial).
Com as diluições 10-³, 10-⁴ e 10-⁵, foram feitos testes para coliformes e bacillus cereus.
Para esses testes, 1000 µL das respectivas diluições foram colocados no teste, que foi fechado
com cautela. Para finalizar, as 8 placas e os 6 testes preparados foram levados a estufa BOD a
uma temperatura de 36° C por 24 horas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
AVALIAÇÃO MICROBIANA EM ALIMENTOS
Foi feita a avaliação dos testes para Bacillus cereus e Coliformes, e nenhum apresentou
presença desses organismos.
Também foi feita a análise dos resultados das placas preparadas com as diluições. A
contagem de UFC's na diluição 10-⁵ (Ágar Nutriente) foi de 76 e na diluição 10-³ (Ágar
Macconkey), foi de 207. Essa variação é resultado de uma diluição bem sucedida, já que
apresentou-se menos UFC’s no final, havendo uma menor concentração de bactérias.
