Cap.

1
Bioquímica
Analítica Análise
2022/23
e
Quantificação de
Biomoléculas

2022/23 Cap. 1 Bioquímica Analítica/Sofia Pauleta 1

Sumário

• Introdução à Bioquímica Analítica.

• Quais as questões fulcrais em Bioquímica Analítica.

• Análise Qualitativa versus Análise Quantitativa. Métodos

usados no estudo das biomoléculas. Estratégia.
• Precisão versus Exatidão. Sensibilidade versus Especificidade.
• Erros. Propagação de erros.

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Bioquímica Analítica
• Sub-área da Bioquímica que tem por objetivo:

ü Identificar o tipo de biomoléculas presentes numa amostra

ü Determinar a concentração e composição das biomoléculas num determinado

sistema biológico

• Bioquímica Analítica vs Bioquímica. Estudar/Conhecer

ü As estruturas química e tridimensional das moléculas biológicas
ü A interação entre as moléculas biológicas
ü A síntese e degradação das moléculas biológicas na célula
ü Os mecanismos de conservação e consumo de energia na célula
ü Os mecanismos usados pela célula na organização das moléculas
biológicas e coordenação da sua atividade
ü O armazenamento da informação genética; sua transmissão e
expressão

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Bioquímica Analítica
Questões Específicas em Bioquímica Analítica
1. Onde se encontra?
2. De onde é que foi isolado?
3. Qual a sua estrutura?
4. Como se move?
5. Com que outras macromoléculas interage?
- Questões sobre:
• Qualidade da amostra (pureza, nativa, in vivo diferente de in vitro)
• Estrutura (folded, homologia, flexibilidade)
• Função (regulação, conformação p/ ligação ao substrato)

Em teoria, a Bioquímica Analítica termina com estas questões, mas

geralmente estas questões são feitas para dar suporte às hipótese
sobre a FUNÇÃO BIOLÓGICA
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As Questões
• As células animais e vegetais contêm ~10 000 tipos de moléculas
• A distribuição dos elementos nos sistemas biológicos difere da mesma forma
em sistemas não biológicos

• Os elementos que são componentes estruturais das células e dos tecidos

• dose diária requerida = g
• Macrominerais (>100 mg) e Elementos vestigiais (<100 mg) , essenciais à vida, ex. Fe, Cu e Zn
• a dose diária necessária em mg ou μg

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A primeira questão em Bioquímica Analítica

• Que unidades constituem as moléculas biológicas?
• Açúcares (e purinas). Emil Fischer (1852-1919)
- Nobel Prize in Chemistry 1902 “in recognition of the
extraordinary services he has rendered by his work on
sugar and purine syntheses”. lock & key mechanism
- Espectroscópios de Bunsen e Kirchoff

• Ácidos gordos. Michel Chevreul (1786 -1889)

- Análise elementar usando técnicas de
solubilidade, cristalização, saponificação,
determinação dos pontos de fusão, destilação,
fracionamento com sal

• Ácidos nucleicos. Johannes Miescher (1844-1895)

- Descobriu o DNA (que designou de Nuclein), 1869
- Extração alcalina/precipitação do DNA, análise
elementar

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A primeira questão em Bioquímica Analítica
<<<
• Que unidades constituem as moléculas biológicas?
• Aminoácidos
- Asn (Voquelin & Robiquet de Asparagus, 1806)
- Gli + Leu (Henri Braconnot, 1820)
- Glu + Asp (Karl Ritthausen, 1866)
- Outros aminoácidos
• Ser (1865)
• Phe (1881)
• Cys (1884)
• Ala (1888)
• Arg (1895)
• His (1896)
…
• Thr (1935), William Cumming Rose

Chem. Rev. 1931, 9, 2, 169–318

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A primeira questão em Bioquímica Analítica

• As descobertas anteriores ↔ Análise Elementar
- Joseph Gay-Lussac (1778-1850) e Louis Thénard (1777-1857)
possibilitaram uma análise mais precisa e prática
• Comportamento dos gases, identificação de hidratos de carbono
com composição 2 H:1 O
([Link]

- Robert Bunsen (1811-1899) e Gustav Kirchhoff (1824-1887)

([Link]

Espectro de emissão do He
Espectroscópio de Bunsen-Kirchhoff

• Chama/Bunsen acoplada a um prisma ó espectrómetro ó levou à descoberta de

vários elementos, ex. Rubidium, Cesium

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Análise de Biomoléculas

• A quantificação de biomoléculas (ou grupos de biomoléculas)

numa amostra implica a aplicação de um conjunto de técnicas
permitindo conhecer a função de cada molécula

• Análise Qualitativa
- Identificação das espécies presentes numa amostra

• Análise Quantitativa
- Determinação numérica da quantidade de espécies
- É precedida pela análise qualitativa

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Análise Qualitativa vs Análise Quantitativa

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Análise Qualitativa vs Análise Quantitativa

• Análise elementar/ molecular

- Elementar: Carbono vs oxigénio
- Molecular: sacarose vs frutose

• Análise Quantitativa
- Geralmente expressa em concentração (molaridade, %, ppm, …)
- A sensibilidade do método é importante
limite mínimo para o qual é possível detetar um valor

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Análise Qualitativa vs Análise Quantitativa

Qualitativo Quantitativo
Método Elementar Molecular Elementar Molecular
Absorpção atómica - - + -
Emissão atómica + - + -
Electroforese capilar + + + +
ICP-MS + - + -
Espectroscopia de IV - + - +
Cromatografia líquida - + - +
Cromatografia gasosa - + - +
Espectrometria de massa + + + +
Espectroscopia de RMN - + - +
Espectroscopia de UV/visível + + + +
Espectroscopia fluorescência - + - +

• ICP-MS – inductively coupled plasma mass spectrometry

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Classificação dos Métodos de Análise Quantitativa

• Métodos gravimétricos – quantifica-se a massa

Ex. Adição de 1 ião que leva à precipitação, quantificar e identificar o composto
precipitado; determinação de Cl- em sol.: Ag + Cl- → AgCl (s)

• Métodos volumétricos – o volume é medido ou usado para

determinar a quantidade da amostra (via concentração)
Ex. Titulação (determinação da acidez do vinagre, do azeite)

• Métodos instrumentais – usa-se uma técnica instrumental para

quantificar a amostra
Ex. Métodos espectroscópicos, cromatográficos, espectrometria de massa

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Métodos Espectroscópicos
• Espectroscopia de absorção. Medida da quantidade de luz absorvida por um
composto em função do comprimento de onda da luz

• Espectroscopia de infravermelho. Observa as vibrações das ligações; indica os

grupos funcionais presentes

• Espectroscopia de ressonância paramagnética electrónica. Deteta espécies

que contêm electrões desemparelhados, ou seja, espécies paramagnéticas;
permite identificar e caracterizar estruturalmente centros metálicos em
metaloproteínas, presença de radicais livres

• Espectroscopia de ressonância magnética nuclear. Observa o envolvimento

química de alguns átomos (H, C, N, F); indica os grupos funcionais existentes;
permite determinar a estrutura de moléculas e proteínas pequenas (<20 kDa);
permite estudar a interação entre moléculas (e.g., proteínas ou proteínas-
ligandos)

• Espectrometria de massa. As moléculas são bombardeadas com electrões,

causando a sua fragmentação; permite determinar a massa molecular
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Ex. Polissacáridos

QUESTÕES
§ Qual a natureza e razão molar das unidades
monoméricas?
§ Qual a identidade das unidades constituintes?
§ Qual a sequência das unidades monoméricas?
§ Qual é a posição/tipo das ligações glicosídicas?

[Link]

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Ex. Lípidos

QUESTÕES MÉTODOS
• Tipo de lípido/constituintes? • HPLC/UV-visível (monómeros)
• Arranjo estrutural – micelas, lipossomas, • Fluorescência (membranas)
bicamada lipídica? • RMN (micelas/proteínas)
• Dinâmica e estado físico das membranas? • MS (monómeros)
• Interação com as outras macromoléculas
biológicas (proteínas, açúcares, …)?
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Ex. Aminoácidos

As Proteínas são definitivamente as biomoléculas

mais importantes e mais divertidas!

QUESTÕES
• Quais os aminoácidos que as constituem?
• Qual a sua sequência?
• Qual a sua estrutura?
• Qual a modificação pós-tradução?
• Qual a sua função biológica?
• Dinâmica molecular
• Interação / Parceiros fisiológicos?
• Como pode ser feita a sua Quantificação e
identificação da Localização Celular?

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Ex. Ácidos Nucleicos: DNA / RNA

Nucleotídeos
RNA

DNA

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Ex. Estudo de uma biomolécula por Espectroscopia de UV-visível

• Requisito: a biomolécula tem que absorver na

região UV-visível
- Aplicação da Lei de Lambert-Beer: Al = ε l. b . c

- Linearidade da Lei

- Reta de calibração com um padrão de

concentração conhecida

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Análise de uma amostra: ESTRATÉGIA

1. Identificação do problema – pergunta / hipótese

2. Definição / Escolha do método (Condiciona a preparação da amostra)
3. Preparação da Amostra
4. Medida experimental / Obtenção do resultado experimental
5. Validação do método (replicados, brancos / determinação do
erro experimental)
6. Registo dos resultados (publicação)

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Análise de uma amostra: ESTRATÉGIA

1. Identificação do problema – pergunta / hipótese

2. Definição / Escolha do método (Condiciona a preparação da amostra)
3. Preparação da Amostra
4. Medida experimental / Obtenção do resultado experimental
ó IMPORTANTE: ESCOLHA DO MÉTODO
1. Validação do método (replicados, brancos / determinação do
erro experimental)
2. Registo dos resultados (publicação)

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Identificação e Quantificação de Biomoléculas

A escolha do método depende principalmente do objetivo do estudo:

• Precisão (reprodutibilidade) versus Exatidão
• Depende das propriedades físico-química das biomoléculas
• Simplicidade e rapidez do método ó Estabilidade da biomolécula
• Custo (nº de amostras a analisar)

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Identificação e Quantificação de Biomoléculas

Massa molecular versus Peso molecular?

• Massa molecular é expressa em Daltons (Da), 1 Da = 1/12 massa atómica do 12C
• unidades de massa atómica
• Peso molecular: Razão entre massa molecular e 1/12 da massa do 12C
• adimensional

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Precisão versus Exatidão (revisão)

• Precisão, ou reprodutibilidade, é o grau de variação de
resultados de uma medição
- Tem como base o desvio-padrão de uma série de repetições da mesma
análise
- A precisão de um instrumento não pode ser alterada

• Exatidão refere-se ao grau de conformidade de um valor medido

ou calculado relativamente ao valor real ou a uma referência
- A exatidão de um instrumento pode alterar-se ao longo do tempo
(desgaste, descalibração, …)

• Um instrumento pode ser preciso mas não exato

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Precisão versus Exatidão (revisão)

Não Exacto
Não Preciso

Exacto (média)
Não preciso

Exacto
Preciso

Não Exacto
Preciso

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Precisão versus Exatidão (revisão)

Exato Não Exato Não Exato Exato (média)

Preciso Não Preciso Preciso Não preciso

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Sensibilidade versus Especificidade

• Sensibilidade de um método está relacionada com a quantidade

mais pequena que é detetada
- Interferências!
• Especificidade é a capacidade de um método detetar apenas
uma substância
- Métodos não específicos produzem falso positivos!

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Propagação de Erros
Casas decimas a apresentar!! Algarismos Significativos

Em que a, b, e c são medidas variáveis de uma experiência; e σa, σb, e σc são os desvios padrão dessas mesmas
variáveis.
Note que soma, subtração, e equações logarítmicas dão origem a um valor absoluto de desvio padrão, enquanto
que a multiplicação, divisão, equações exponenciais e anti-logarítmicas dão origem a um valor relativo de desvio
padrão (ao próprio valor determinado).

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