Disciplina Microbiologia - Cultivo de

microrganismos
Quantas espécies de procariotos existem?
200 mil ou mais
Quantos já são conhecidos – 5224 só !!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Quantas espécies de fungos existem?

1.500,000 (Hawksworth, 1992)

Quantos já são conhecidos – 75000 só !!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Exigências nutricionais e meios de cultura
Essencial:
água – porque m/os absorvem nutrientes dissolvidos em água
Meio de cultura – tem que fornecer as exigências químicas e
condições físicas

Ambientes para crescimento de m/os

1. Pode-se estudar o organismo em habitat natural (antártica,
oceanos, tratamento de esgoto etc)

2. Pode-se cultivar em meio de cultura no laboratório = crescimento

in vitro
– essencial para identificação, caracterização de propriedades
fisiológicas, bioquímicas, crescimento etc

3. Organismo não cultivável

- não ter sido cultivado em meio artificial
- tem exigências nutricionais complexas e indefinidas
- Ter que ser cultivado in vivo (células ou hospedeiro vivo)
 Necessidades nutritivas dos microrganismos

Meio de cultura ideal: condições que simulam / melhoram as condições

naturais

Elementos químicos essenciais: carbono, nitrogênio, hidrogênio,

oxigênio, enxofre e fósforo

Funções dos elementos Químicos essenciais

Carbono
Compostos orgânicos – contem carbono
Compostos inorgânicos – não tem carbono (1 exceção CO2)
Função celular:
Ø Forma o esqueleto dos nutrientes orgânicos - carboidratos, lipídeos e
proteínas (que fornecem energia para crescimento e formam a
estrutura da célula)
Ø M/Os Heterotróficos: usam compostos orgânicos como principal fonte
de carbono (fontes de compostos orgânicos: absorvido do meio,
ingerir outros organismos autotróficos, heterotróficos)
Ø M/Os autotróficos: usam CO2 como fonte de carbono (precisam
somente moléculas inorgânicas simples e íons do meio)
Nitrogênio
Ø Parte essencial dos aminoácidos (componente de peptídeos e proteínas)
Ø Algumas bactérias podem fixar nitrogênio atmosférico, outros usam
inorgânicos (nitratos (NO3), nitritos (NO2), ou sais de amônia) e outros
nitratos orgânicos (peptídeos, aminoácidos)

Hidrogênio e oxigênio
Ø Parte de muitos compostos orgânicos

Enxofre
Ø Presente nos Aminoácidos cisteína e metionina

Fósforo
Ø Para síntese de ácidos nucléicos a ATP (armazena e transfere energia)

Outros elementos essenciais (em quantidades menores)

Na+ - exemplo - essencial para função da enzima permease (transporta
açucar através da membrana celular em E. coli)
Fe2+ - exemplo - cofator de enzimas catalases

Elementos traço (essenciais – quantidades de mg/l)

Zn2+, Cu2+, Mn2+, Mo6+, Co2+ - cofatores de enzimas
Exemplo: Nitrogenase usa Mo6+ como cofator
Classificação Nutricional dos Microrganismos
Quimiotróficos
Ø Organismos que utilizam compostos químicos para obter energia

Fototróficos
Ø Organismos que utilizam energia radiante(Luz) para obter energia

Combinação com fonte de carbono (autotrofo / heterotrofo) - surgem 4 grupos:

Quimioautotróficos
Ø Utilizam substâncias químicas (inorgânicas) como fonte de energia
(exemplos: H2S, NH3) e CO2 como fonte de carbono (exemplo bactéria
nitrificantes)

Quimioheterotróficos
Ø Utilizam substâncias químicas (orgânicas) como fonte de energia e
compostos orgânicos como fonte de carbono (maioria de bactéria, fungos,
protozoários e animais) (saprófitas (vivem em material orgânico morto) e
parasitas (material orgânico vivo)

Fotoautotróficos
Ø Utilizam energia radiante para energia e CO2 como fonte de carbono (bactéria
de enxofre verde e púrpura, plantas, cianobactérias)

Fotoheterotróficos
Ø Utilizam energia radiante para energia e compostos orgânicos como fonte de
carbono
Classificação nutricional NEM SEMPRE É FIXA:

Exemplo: Rhodospirillum rubrum

AnO2 – fotoheterótrofo
O2 & escuro - quimioheterótrofo

Contem carotenóides para fotossíntese

Exigências nutricionais IMPORTANTE NA IDENTIFICAÇÃO DE M/Os

Testes laboratoriais - crescimento em meios, API ZYM – identificar m/o
em horas!!

These flexible systems identify around 2000 bacteria, yeast

and fungal species based on their respiration in the
presence of 95 carbon sources
Fatores Físicos necessários para
crescimento
• Temperatura
• PH
• Atmosfera gasosa
• Pressão osmótica

Temperatura
• Maioria de m/os – crescem nas temperaturas ideais
para seres humanos
• M/Os crescem em uma faixa grande de temperaturas:
• Exemplos: Bacillus subtilis 8 – 53 oC, Neisseria
gonorrhoeae 30 – 40 oC
• Temperatura ótima de crescimento: a temperatura na
qual o m/o cresce mais rápido
• Temperaturas cardinais: Temperaturas de crescimento
mínima, ótima e máxima (variam com estágio da vida,
meio de cultura)
• Temperatura Ótima:
• perto da temperatura máxima (não é a média entre
mínima e máxima!!)
• Reflete o aumento de velocidade de reações
enzimáticas – até o ponto que calor danifica as
enzimas).
Algumas bactérias crescem em temperaturas
extremas
4 grupos:
Psicrófilos – crescem em temperaturas baixas
Psicrotróficos – crescem em temperaturas baixas até
moderadas
Mesófilos – crescem em temperaturas moderadas
Termófilos – crescem em temperaturas altas
pH
• pH ótimo – média entre pH máximo e mínimo
• Bem definido para cada espécie
• M/O mantem pH ~7.5 dentro da célula (mesmo bem ácido ou
básico externamente)
• Expulsão ou absorção de íons de hidrogênio pela célula

Exemplos de ambientes extremos com m/os:

• Águas de escoamento de solos vulcânicos e minas – pH 1 – 3
• Águas de nascentes pH 10
• Solos com amônia pH 11
• Oceanos pH 8
• Águas polares pH 6 (com CO2 dissolvido)
Bactérias:
PH taxa para Maioria de bactérias:
Min 4, med 7, max 9
Exemplos de bactérias resistentes aos pH extremos:
Bacillus pH 11, Thiobacillus pH 0,5

Fungos e leveduras:
Variação de pH mais extensa que bactérias
PH ótimo 5 – 6

Protozoários:
PH ótimo 6.7 – 7.7

Algas:
PH ótimo 4 – 8.5

Meios de cultura e pH:

O crescimento de um m/o no meio de cultura pode
alterar o pH do meio – crescimento fica inibido
Solução: incorporar um tampão no meio
Atmosfera Gasosa
• No habitat natural - m/os necessitam concentrações diferentes de O2, CO2, N2,
CH4
• No laboratório - temos que fornecer estes gases em concentrações
apropriadas
• CO2 & O2: os dois gases principais que afetam o crescimento de m/os
• 4 grupos fisiológicos de m/os, em termos de resposta ao oxigênio:
1. M/Os aeróbios
2. M/Os facultativos
3. M/Os anaeróbios
4. M/Os microaerófilos
1. M/Os aeróbios
• Precisam O2 em concentrações normais (atmosfera de 21% O2)
• Adquirem mais energia dos nutrientes no meio do que anaeróbios
• Meios líquidos - precisam agitação para distribuir o O2 no meio
• Exemplos: Fungos filamentosos, Legionella, Mycobacterium

2. M/Os facultativas
• Crescem com O2 aerobicamente, e sem O2 anaerobicamente
• Na produção de energia utilizam O2, ou o processo metabólico de fermentação
• Exemplos: Enterobacteriaceae como E. coli, leveduras como Saccharomyces
3. M/Os anaeróbios
• O2 tóxico - causa morte da célula
• Não utilizam O2 na produção de energia
• Não crescem na presença de O2
• M/Os anaerobios tolerando baixas concns de O 2: C. perfringens, C. tetani
• M/Os não tolerante (anaeróbios estritos): Methanobacterium
• Causa de toxicidade de O2:
• Acumulação em reações químicos com O2 de:
-
• Radicais superóxido O2 (danificam células)
• Peróxido de Hidrogênio H2O2 (Dá origem aos radicais hidroxilas)
-2
• Radicais hidroxila OH (danificam células)

M/Os aerobios tem mecanismos de proteção:

-
• Enzima superóxido dismutase - elimina Radicais superóxidos O2
-2
• Enzimas Catalase & peroxidase - metabolizam o H2O2, e OH não acumula

4. M/Os Microaerófilos
• Utilizam O2 nas reações químicas na produção de energia
• Toleram concentrações de O2 mais baixo do que os aeróbios
(somente 1 - 15%)
• Exemplo: Campylobacter jejuni - diarréia
 Pressão Osmótica
A água influencia o pressão osmótica do
ambiente
Pressão osmótica – A força com a qual a
água se move através da membrana
citoplasmática
– de uma solução com baixa conc de
substâncias (solutos) – para solução
com alta conc
Solução isotônica fora e dentro da
célula: fluxo de água para dentro e fora da
célula em equílibrio – célula cresce normal
Solução hipertônica fora da célula:
célula perde água, crescimento inibido (ex:
alimentos salgados)
Solução hipotônica fora da célula: água
flui para dentro da célula – e a rompe

Pressão hidrostática: Pressão exercida nas células pelo peso da água na

superfície
Exemplo:
m/os no fundo do oceano – Barófilos - 2500m abaixo – pressão = 250bars (250 x
mais que atmosférico)
Não crescem no laboratório – porque vesículas de gás intracelulares se expandem
– célula rompe
Meios de cultura para crescimento de
microrganismos
Meio de cultura: qualquer substrato que mos utilizam para o
crescimento
• Usado para cultivar mos no laboratório e revelar a identidade
• Preparados usando meios desidratados, ou meios prontos
para uso
• Muitos meios comerciais disponíveis: dependem das
necessidades nutricionais dos mos, origem do material, e a
espécie que se imagina estar presente
• Meio estéril – livre de qualquer forma de vida. Esterilizado por
aquecimento até uma temperatura suficiente para destruir
todos os mos potencialmente contaminantes

Ágar:
Ø Agente solidificante
Ø Polissacarídeo complexo obtido a partir de algas
Ø Permanece sólido (porque poucos mos podem degradar o
ágar)
Ø Solidifica abaixo 40 oC
1. Meios quimicamente definidos:
Ø Composição química é exata e conhecida
Ø Precisam fontes de energia, carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, e fatores
orgânicos necessários que o mo não sintetiza
Ø Mos Fastidiosos - muito exigente em termos nutricionais - por exemplo
Neisseria e Lactobacillus
2. Meio complexo

Ø Para o cultivo de rotina no laboratório – usamos meios de

cultura complexos (preparados a partir de produtos
naturais (quimicamente indefinidos))
Ø Exemplos de produtos naturais adicionados: extrato de
levedura, de carne, de planta
Ø Menos controle sobre os concentrações exatas dos
químicos
Ø Para crescimento de mos heterotróficos / organotróficos
(requer uma fonte orgânica de carbono)
Ø Componente protéico (peptonas = pequenos cadeias de
aminoácidos) fornece a energia, carbono, nitrogênio e
enxofre que pode ser metabolizado pelas bactérias
Exigências nutricionais

•Necessidades nutricionais (compostos simples

até complexos)
•Condições físicas (temperatura, luminosidade,
oxigênio etc)
•Produção de enzimas

•Mais rápido do que morfologia

•Mais preciso do que morfologia
•Utilizado nos laboratórios hospitalares

Testes laboratorias - crescimento em meios, API ZYM – identificar m/o em

horas!!

These flexible systems identify around 2000 bacteria, yeast and

fungal species based on their respiration in the presence of 95
carbon sources
Meios para cultivo de Bactérias

Ideal: Imitar habitat natural

Exemplos:
• Sangue no meio para bactérias que utilizam nutrientes presentes no sangue
• Açucar no meio para bactérias que ocupam um nicho com glicose
• Fotoautotrofo - precisam luz no ambiente de crescimento, CO2, água e íons
inorgânicos
• Quimioautotrofo - Mesmas exigências nutricionais, sem luz

Meio quimicamente definido para quimioautotrofo:

Ingrediente Fonte de quantidade

(NH4)2SO4 nitrogênio, energia 0,5g
NaHCO3 Carbono (CO2) em solução 0,5g
Na2HPO4 Ions essenciais 13,5g
KH2PO4 Ions essenciais 0,7g
MgSO4.7H2O Ions essenciais 0,1g
FeCl3.6H2O Ions essenciais 0,014g
CaCl2.2H2O Ions essenciais 0,18g
Agua Solvente 1,000ml
Meio quimicamente definido para um bactéria quimioheterotrofo: (exemplo E.
coli - precisa somente 1 fonte de C orgânico (não fastidioso))

Ingrediente Fonte de quantidade

Glicose Energia, carbono 1g
NH4H2PO4 nitrogenio, ions essenciais 5g
K2HPO4 Ions essenciais 1g
NaCl Ions essenciais 5g
MgSO4.7H2O Ions essenciais 0,2g
Água Solvente 1,000ml

Meio complexo para bacteria quimioheterotrofo fastidioso - Caldo Nutriente

(Nutrient Broth):
(Definição "Fastidioso" - Bactéria que precisa muitos aminoácidos e vitaminas para
crescer)

Ingrediente Fonte de quantidade

Extrato de carne carboidratos, nitrogênio,vitaminas 3g
Peptona nitrogênio, vitaminas 5g
NaCl Ions, condição osmótica certa 8g
Água Solvente 1,000ml

(Adicionar 15g de ágar = Ágar Nutriente)

Bactérias mais fastidiosas -
Usa meios complexos contendo por exemplo Sangue ou soro animal
Bactérias não cultiváveis - super fastidiosas – pode-se cultivar em culturas de
células - eg Treponema pallidum - células de coelho

Meios para cultivo de Fungos

• Todos os fungos são heterotrofos

• Mais açúcar do que meios para bactérias
• Mais ácido (pH 3.8 - 5.6) do que os meios para bacterias (pH 6,5 - 7.5)
• Observação disso na natureza:
• Bactérias contaminam carne e leite
• Fungos contaminam frutas cítricas, geléias

Meio complexo geral para crescimento de fungos

Ingrediente Fonte de quantidade

Peptona Carbono, nitrogenio, elementos 10g
Glicose Carbono e energia (alta conc
para favorecer fungos) 40g
Água Solvente 1,000ml
PH Baixo (para favorecer fungos)
Meios para Anaeróbicos
Ø Oxigênio pode causar morte de bactérias anaeróbicas
Ø Usam MEIOS REDUTORES
Ø Contém reagentes como tioglicolato de sódio – se combina com oxigênio,
eliminando do ambiente
Ø Usam tubos com tampas seladoras
Ø Usam jarras para placas:
Ø com bicarbonato de sódio e boroidreto de sódio (na presença de água liberam
CO2 e H2)
Ø com o catalisador paladio (Hidrogênio + oxigênio H 2O)
Ø Quando se trabalha com muitos organismos anaeróbicos usa-se capela com gás
inerte
Meios de cultivo seletivo
Ø Comum na microbiologia clínica e saúde pública
Ø Favorecer o crescimento da bactéria de interesse
Ø Impedir o crescimento de outras bactérias
Exemplos:
Ø Meio sulfeto de bismuto para isolamento do bacterium
Salmonella typhi (causador de tifo), a partir de fezes
Ø Meio Sabouraud dextrose agar pH 5.6 favorece mais os
fungos do que bactéria

Meio Diferencial
Ø Usado para identificar mos de interesse, quando existem
outras mos na placa
Ø Por exemplo:
Ø ágar sangue para identificação de Streptococcus
pyogenes (através da hemólise das células sangüíneas)
(causador de infeções de garganta)
Ø ágar sal manitol para identificação de Staphylococcus
aureus (nas fossas nasais), contem alta concentração de
cloreto de sódio (S.aureus agüenta alta concentração de
sal)
Ø contém indicador de pH (S. aureus fermenta carboidrato
para ácido, formando um cor diferente do meio)
Ø Ágar MacConkey com sais biliares, cristal violeta, e
lactose – inibição de Gram positivos, e diferencial para os
que fermentam lactose.
•Hemolisinas - são enzimas capazes de destruir hemácias.
•Se a destruição é total, diz-se hemólise beta.
•Se a lise é parcial, diz-se que há hemólise alfa, observada pela
formação de um pigmento de cor entre verde e amarelo.
•Na hemólise gama não há lise, não aparecendo nenhum halo de
destruição nas hemácias.

http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Atlas-
Bld/Streptococcus%20alpha%20beta%20gamma%20fig14.JPG
Meio de enriquecimento
Ø Para isolamento de bactéria em baixas concentrações, na
presença de outras em altas concentrações
Ø Exemplos de amostras: fezes, solo
Ø Teoria: estimular o crescimento do organismo de interesse,
num meio seletivo, várias vezes, até que só este esteja
presente no final, em quantidades detectáveis
Ø Exemplo: meio líquido com fenol (letal para maioria das
bactérias)
Preservação de Culturas puras
Isolar mo para preservar por um tempo suficiente para
estudá-lo

Métodos
Curto prazo:
• 4 oC na geladeira
• Transferir regularmente para novo meio de cultura

Longo Prazo
• Nitrogênio líquido (–196 oC)
• Freezer (-80 ate –120 oC)
• Liofilização (congelamento a seco) (desidrata a
amostra enquanto está congelada)
Coleções de microrganismos
Importante quando:
• Queremos identificar um mo raro
• escolher um mo para ensino etc.
• mostrar que seu mo é um mutante de um outro
• Queremos comparar a diferença genética entre uma população
e outros (filogenia etc.)
• Ou simplesmente preservar a coleção de diversidade de mos

Duas coleções internacionais:

• ATCC – American type culture collection (>9500 especies
depositados)
• CABI Bioscience (IMI) (UK)
Crescimento de culturas bacterianas
• Crescimento bacteriano= ao aumento de número de indivíduos (não o
crescimento celular)
• Divisão por fissão binária
• Aumento exponencial 1, 2, 4, 8, 16, 32 etc ( = 2número de gerações) (porque
célula se divide em 2)
Tempo de geração:
• Tempo necessário para célula se dividir (= população
dobrar também)
Depende do:
• Organismo
• Condições ambientais
• Maioria das bactérias: 1- 3 horas
• Algumas bactérias 24 horas
• E. coli: 20 minutos

Cálculo do concentração final de células:

• Número inicial de células x 2número de gerações = número
de células
Eg: 5 células se dividem 9 vezes:
5 X 29 = 2560 células

Crescimento exponencial
• Representação logaritímica – possível mostrar
graficamente
• Representação aritmética – escala fica muito grande
Curva de crescimento bacteriano
• Obtenção: contagem da população em intervalos de tempo após inóculo
• 4 fases:
1. Lag
2. Log
3. Estacionária
4. Declíneo ou morte celular
1. Fase Lag / latente
• Bactérias não se reproduzem imediatamente depois
de inocular um novo meio
• O que está acontecendo? : síntese de DNA,
expressão gênica e produção de enzimas
necessárias
• Duração: 1 hora até dias

2. Fase Log / crescimento exponencial

• Divisão celular
• Aumento logaritímico
• Tempo de geração – atinge um valor constante
• Período de maior atividade metabólica da célula
• Melhor estágio para fins industriais – mais eficiente
• M/Os sensíveis as mudanças ambientais
3. Fase estacionária
• Depois de crescimento exponencial – acumulação
de células
• Velocidade de crescimento diminui
• Número de morte celular = número de células novas
= população estável
• Atividade metabólica decresce
• Causas:
• Término de nutrientes
• Acúmulo de produtos de degradação
• Mudanças no pH

4. Fase de Declínio / morte celular

• Número de células mortas excede o de células
novas
• Continua até que a população desapareça
totalmente
Quantificação de Crescimento Microbiano

1. Contagem em Placa
• Método mais comum
• Resultado - demora 24 horas para colônias aparecerem na placa

3 princípios:
1. Cada colônia surge do crescimento de uma bactéria
2. Inóculo original e bem homogêneo
3. Não existe agregação de células
• Ideal: crescimento de número limitado na placa (25 - 250 colônias)
• Não ideal: muitas colônias e saturação da placa – impossível contar
• Para garantir um número de colônias na faixa desejada:
• Diluição seriada do inóculo, e depois
• a). verter ou
• b). Espalhamento em placa
Pour Plate
• Diluição do inóculo para placa de petri
• Adicionar meio sólido derretido (50 C)
• Deixar solidificar
• Incubar na temperatura ideal
• Problemas:
• não serve para m/os sensíveis ao
calor
• não serve para m/os que se
identifica usando morfologia da
colônia na superfície do meio (ficam
dentro)

Espalhamento em placa
• Alternativo ao “pour plate”
• Inóculo adicionado ao superfície do
meio sólido
• Espalhado com alça de trigalski
• Incubação e contagem
Filtração
• Usado com líquidos contaminados com poucas bactérias
• Exemplos: Água potável, lagos – E. coli (poluição fecal)
• Passagem de 100ml de líquido numa membrana de filtro com
poros pequenos (prende bactérias)
• Filtro (com bactérias) incubado na superfície de um meio líquido
em placa de petri
• Contagem direta
Membrane Filtration
Contagem direta ao microscópio

• Lâmina especialmente adaptada – Petroff Hausser

• Determinado o número de células em um área conhecida (quadrado grande)
• Multiplicado por 1.250.000 = número células por ml
Turbidimetria
• Bactérias se multiplicam – meio líquido fica túrbido (com alta densidade de
células)
• Tubidez medida com espectrofotômetro
• Feixe de luz transmitido através da suspensão para célula fotoelétrica
• Mais crescimento bacteriano = menos luz atinge a célula fotoelétrica,
medida como absorbância ou densidade óptica (OD) – indicador de
concentração de células bacterianas na solução
Técnicas de cultura pura
Naturalmente – mos existem em culturas mistas (muitas espécies
diferentes ocupando o mesmo ambiente)

Para caracterizar e identificar – mo deve estar em cultura pura (todas as

células na população idênticas (originaram de uma mesma célula
parental))
Técnica asséptica (cultura pura)
Procedimento para transferência de microrganismos:

1. Esterilizar a alça
Ø Flambar a alça num ângulo no bico de bunsen até ficar
laranja
Ø Sempre segurar a alça (para evitar uma contaminação)
Ø Deixa algumas segundos para resfriar (para não matar o
inóculo!!)

2. Transferência do inóculo
Remoção de uma cultura líquida
Ø Segurar o tubo numa mão, e alça na outra
Ø Remoção da tampa com dedo da mão segurando a
alça
Ø Nunca colocar a tampa na bancada – vai ficar
contaminada
Ø Flambar a abertura do tubo (causa uma corrente
forçando o ar fora do tubo)
Ø Inserir a alça para tirar um pouco do inóculo
Ø Flambar a abertura do tubo
Ø Repor a tampa
Remoção de uma cultura de uma placa
Ø Flambar a alça num ângulo no bico de bunsen até ficar laranja
Ø Abrir a tampa da placa de petri
Ø Coloca alça no ágar fora da cultura (para resfriar)
Ø Tirar um pouco do inóculo

Transferência do inóculo para meio estéril

Para um meio líquido
Ø Tirar tampa com o dedo
Ø Flambar a abertura do tubo
Ø Colocar o inóculo no tubo
Ø Repor a tampa
Ø Re-esterilizar a alça, flambando no bico de bunsen

Para um meio sólido

Ø Abrir a tampa da placa suficiente para inserir a alça
Ø Riscar a alça no superfície da placa (para espalhar o
inóculo)
Ø Tirar a alça e fechar a tampa
Ø Re-esterilizar a alça, flambando no bico de bunsen
Liquid Solid
Acabou!