WETERN-BLOTTING
Western blot é uma técnica padrão ouro para confirmação do HIV, é o que dá uma maior
confiabilidade sobre a infecção, sobre esses vírus, mas também pode ser utilizado para
outras patologias, para confirmação e quantificação de proteínas já que é uma é uma
técnica que trabalha com a detecção de proteínas. No entanto, western blot é um teste
extremamente custoso e também muito longo. Por isso que o ELISA (que era o padrão
ouro antes do western blot para HIV) seja mais utilizado. Mas o Western blot serve para
dar uma maior certeza sobre a infecção do HIV.
O Western blot é uma técnica evoluída, ou seja, precisou que tivesse em outras técnicas
até chegar a ele usando o mesmo princípio. Essas técnicas, temos primeiro o Southen
blot. Southen refere ao nome do inventor, do desenvolvedor da técnica. Southen blot era
uma técnica usada para detectar DNA. Já o Northern blot é uma técnica para detecção de
RNA e depois teve o desenvolvimento do Western blot que utiliza o mesmo princípio. O
Blot que tem em todos eles, significa borrão. O Western blot tem como principio a
utilização de anticorpos, por isso é chamado de imunoblot, também pode ser sinônimo de
proteinblot. Essa técnica é dividida em cerca de cinco etapas: extração, fracionamento,
transferência de proteínas, bloqueio e detecção dessas mesmas proteínas pelos
anticorpos.
A primeira etapa, chamada de extração que nada menos é do que a tomada da amostra,
como vou obter a amostra pela utilização da técnica. Essa amostra pode ser obtida por
cultura de células para posterior fracionamento, quebra do componente. Pode ser
utilizado também outros tecidos biológicos, como as bactérias e os vírus. Essa obtenção é
feita de duas formas: extração mecânica, como a centrifugação ou a utilização de
ferramentas do laboratório ou uma sonificação que é uma quebra através de ondas
sonoras. Podemos utilizar também detergentes para facilitar a quebra da amostra. Logo
após a obtenção da amostra, vamos aquecê-la para que essa proteína não seja ativada,
que haja desnaturação das proteínas. Então, essa primeira etapa, vamos preocupar em
como obter a amostra.
A próxima fase é chamada de fracionamento. No fracionamento tem o empilhamento e
corrida das proteínas. Então, vamos pegar a amostra e vamos adicioná-la ao gel. Nos
procedimentos de western blot e de outros também, temos um padrão. O primeiro eu já
sei como vai se organizar. As proteínas que estão nesse primeiro já sabemos como elas
vão correr no gel, como elas vão de cima para baixo. Se quero identificar proteínas
específicas, já tenho que saber como é que elas se organizam no gel nessa fase de
fracionamento. O gel mais utilizado é o SDS-PAGE. O PAGE vem de polyacrylamide gel
electrophoresis, ou seja, gel de poliacrilamida para eletroforese. A poliacrilamida é como
se fosse uma peneira separando os fragmentos maiores dos menores, ou seja, tem a
contribuição que as proteínas maiores ficam mais localizadas no inicio e as menores
corram mais. Essa é a função da poliacrilamida e o SDS significa sodium dodecyl sulfate,
ou seja, dodecil sulfato de sódio. Esse é um detergente que é chamado de aniônico. Os
detergentes aniônicos liberam íons negativos. Eles vão liberar esses íons negativos e vão
fazer com que as nossas proteínas ganhem carga elétrica negativa. Como os opostos se
atraem, então, se a proteína está negativa ela será atraída para o positivo. Positivo e
negativo estamos nos referindo para a voltagem. Isso porque o gel será exposto a uma
voltagem. Vamos aplicar uma voltagem nesse gel. Quando essa voltagem acontecer, as
nossas proteínas vão migrar do polo negativo para o polo positivo. As proteínas maiores
vão ficar mais localizadas no início, enquanto as menores vão correr muito mais rápido e
estarão localizadas no final. As proteínas maiores ter maior dificuldade para poder passar
por esse emaranhado que é o gel e as proteínas menores terão maior facilidade. Essa
corrida ocorre porque quando a voltagem foi exposta no gel, o SDS faz com que as
proteínas tenham cargas interfísica negativa e sejam atraídas para o polo positivo. Esse é
o fracionamento.
Na etapa de transferência para membrana, teremos o contato da membrana com o gel
para que as proteínas que estão aqui passem para a outra membrana. As membranas
mais utilizadas nos dias de hoje são as de nitrocelulose e de PVDF. Essa última é a mais
utilizada. O método primário para que haja essa transferência tem por capilaridade.
Devido a tensão superficial que é colocado no conjunto (que tem o gel, a membrana,
papel filtro e a solução tampão) as proteínas que estão no gel acabam por subir para a
membrana, só que esse processo já ficou um pouco ultrapassado porque hoje em dia já
tem outro método muito mais rápido, muito mais eficiente, chamado de transferência
eletroforética. A diferença entre os dois é porque tem os mesmos componentes são
embebecidos antes com a solução tampão. Aí vai para o equipamento e esse
equipamento vai sofrer uma voltagem. Quando essa voltagem é aplicada, observe que o
gel que está mais próximo do polo negativo e a membrana está mais próxima do polo
positivo que é o ânodo. Então, quando essa voltagem é aplicada, as proteínas do gel do
polo negativo vão migrar para o polo positivo, mesmo conceito da corrida. Esse é mais
rápido e mais eficiente, só que ambos vão ter o mesmo objetivo, vão fazer o borrão, ou
seja, vão transferir as proteínas. A mesma coisa que está no gel tem que sair na
membrana e aí teremos como se fosse realmente um borrão, como por exemplo, vamos
fazer o processo da identificação digital. Coloca o dedo em uma almofada que está com
tinta e depois coloca em uma outra superfície. Lá também será feito um borrão. Entenda
dessa forma. Foi passado algo que estava em uma superfície para outra e para que
saibamos se essa transferência ocorreu, porque nesse processo de Western-blot esse
borrão não é visível até essa etapa. Então, para saber se houve realmente a transferência
do gel para a membrana, vamos utilizar um corante chamado de Ponceau S. Esse
Ponceau S vai corar as proteínas e vamos saber que realmente transferiu. Se não, terá
que voltar o processo todo novamente. Então, utiliza o corante para saber se realmente
houve a transferência.
Na fase de bloqueio tem a ação das proteínas bloqueadoras. Qual o papel dessas
proteínas bloqueadoras? Elas vão se ligar aos locais onde não estão presentes as
proteínas nos espaços. Isso para que os anticorpos na fase de detecção não se liguem
nesses espaços. Isso vai servir para que tenhamos a redução de resultados falso positivo,
porque isso pode acontecer. Então, é importante a utilização dessas proteínas
bloqueadoras para que isso não aconteça. Essas proteínas bloqueadoras são albumina
bovina ou ainda leite desnatado (leite em pó) que são utilizadas para bloquear anticorpos.
Na fase de detecção parece muito com o ELISA. Expõe o soro do paciente com a
membrana. O primeiro anticorpo é o anticorpo primário. Se o paciente tiver esse anticorpo
anti p24, anti outras glicoproteínas do vírus do HIV, terá a ligação porque ele é específico.
E essa incubação é o que faz o western-blot ser tão demorado, porque ela é chamada de
incubação overnight que é aquela incubação que tem de um dia para o outro: 16 hs, 18
hs, 12 hs. Mas isso é necessário para que realmente haja a ligação específica do
anticorpo com as proteínas específicas. Na próxima fase tem uma lavagem para retirar o
anticorpo que não é específico ou que não se ligou e depois disso a adição de anticorpo
secundário. No caso do Western-blot, o anticorpo secundário é um anticorpo marcado só
que pode ter algumas variações dessas marcações. As duas mais utilizadas são a
quimiluminescência e a fluorescência para conseguir identificar as proteínas específicas.
Na quimioluminescência tem um anticorpo marcado com uma enzima (normalmente a
peroxidase ou a fosfatase). Se tiver a ligação do anticorpo primário com a proteína, o
anticorpo secundário vai identificar o anticorpo primário. Vai se ligar, então, vai fazer mais
uma lavagem retirando quem não se ligou e vai adicionar o substrato dessa enzima para
que se tenha a identificação. No caso da quimioluminescência, utilizamos um filme. Se
tiver um anticorpo primário, o anticorpo secundário se liga, a ação do substrato e aí terá
essa marcação.
Na fluorescência, o princípio é basicamente o mesmo. A diferença é que o anticorpo
secundário é marcado com fluoróforo (partícula que faz com que uma outra partícula a
que ele está agindo fique fluorescente). Se tiver um anticorpo primário, ele vai se ligar.
Terá a lavagem do que não se ligou. Terá a ação de laser que vai excitar o fluoróforo. Ele
vai emitir a fluorescência e a fluorescência do anticorpo será detectado por um
fotossensor e ficará de forma diferente. Então, terá o laser, feixe de luz com uma onda
específica para aquele fluoróforo e ele será detectado pelo sensor ficando de outra forma.
Após a detecção, utiliza o padrão para a interpretação.
Na linha 1 tem o padrão e A, B e C são alguns indivíduos que foram testados. Sendo que
o individuo C apresenta positividade, porque a banda onde tem o p24 (proteína do HIV),
ela apareceu no individuo C. Então, comparamos o padrão e percebemos que a proteína
p24 está presente no individuo C. Dá o diagnóstico de positivo para o mesmo. Os demais
indivíduos não apresentaram essa mesma proteína. Então, deram negativo. Então,
realmente se compara as proteínas que já sabemos quais são com as que encontramos
com a detecção utilizada.
Western-Blot (vídeo 2)
Nesse vídeo você aprenderá como realizar um Western-Blot.
Western-Blot pode ser utilizado para identificar proteínas específicas em uma amostra e
fornecer informações sobre o tamanho da proteína e abundância relativa na amostra.
Primeiro, encher uma bandeja com tampão de blotting, você usará este tampão para
equilibrar o seu gel antes de iniciar o Western-blot. Em seguida, remova o gel do gel
cassete usando a chave de abertura. Alinhe as setas na alavanca de abertura com as
quatro setas no cassete para abrir a cassete. Depois de cortar a parte inferior e superior
do gel com uma borda reta, ele colabora o gel na bandeja com tampão de absorção por
15 minutos em uma plataforma de balanço. Caminhos de fibra pré-embebidos e tampão
de blotting para que eles sejam completamente encharcados.
Para fazer um sanduiche mata borrão, obtenha um recipiente suficiente para caber o gel
suporte e adicione tampão de absorção suficiente até que o recipiente esteja cheio.
Aproximadamente um centímetro de profundidade, coloque o cassete de suporte de gel
no recipiente com o lado preto para baixo e imerso no buffer e o lado branco para cima e
para fora do buffer. Coloque uma almofada de fibra plana no plástico preto. Em seguida,
deixe um pedaço de papel absorvente e coloque-o em cima do bloco, tomando cuidado
para evitar quaisquer bolhas entre a almofada e o papel e certifique-se de que o buffer
cobre o papel. Pegue o gel e coloque-o com cuidado no papel absorvente novamente
tomando cuidado para evitar bolhas entre o gel e o papel absorvente.
Em seguida, você aplicará um pedaço de membrana de nitrocelulose para remover a
folha protetora da membrana e molhar a membrana com tampão de blotting. Coloque
cuidadosamente a membrana quadrada no gel. Evite mover a membrana uma vez
colocada no gel, pois as proteínas começarão a borrar imediatamente. Usando um rolo,
remova qualquer bolha de ar entre o gel e a membrana. Coloque uma segunda folha de
papel absorvente úmido em cima da membrana de nitrocelulose. Coloque uma segunda
almofada de fibra molhada em cima do papel absorvente. Dobre o lado de plástico
transparente do suporte de gel sobre o sanduiche e prenda-o. O lado de plástico preto
deslizando sobre o clipe branco. Este ajuste apertado vai apertar o sanduíche junto. Insira
o suporte de gel no módulo interno e certifique-se de que o lado preto do suporte de gel
está próximo ao lado preto do módulo.
Coloque o módulo interno na câmara de eletroforese e adicione uma unidade de
resfriamento e encha a câmara com tampão de blotting até o nível do clipe branco no
suporte de gel. Coloque a tampa na câmara de eletroforese e conecte os condutores
elétricos a fonte de alimentação certificando-se que as conexões estão corretas de
vermelho com vermelho e preto com preto. Desligue a fonte de alimentação e execute o
blot em 20 volts. Se um cronômetro estiver disponível, configure-o para duas horas e
meia.
Quando a execução for concluída, desligue a fonte de alimentação e desmonte a câmara
de eletroforese e remova o módulo interno. Abra o módulo e coloque-o em um recipiente
cheio de tampão de blotting com o lado preto para baixo. Começando com a primeira
almofada de fibra, remova cada camada até chegar à membrana de nitrocelulose.
Conforme você remove a membrana, observe que as proteínas foram transferidas do gel
para a membrana. Observe que os padrões de pré-coloração caleidoscópio foram
transferidos e podem ser vistos em ambos os lados da membrana. Você também pode
ver que não há mais proteínas no gel. Imergir a membrana em 25 mililitros de solução de
bloqueio e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente em uma plataforma de
balanço.
Jogue fora da solução de bloqueio e adicione dez mililitros de anticorpo primário. Incubar
por 10 a 20 minutos em uma plataforma de balanço. A plataforma deve ser definida em
uma configuração mais rápida para garantir a cobertura constante da membrana. Despeje
o anticorpo primário. Enxague a membrana rapidamente em 50 mililitros de tampão de
lavagem e depois descartar o tampão de lavagem. Adicione mais 50 mililitros de tampão
de lavagem à membrana e deixe-a lavar por três minutos na plataforma de balanço em
uma configuração de velocidade média. Descartar o tampão de lavagem, adicionar 10
mililitros de anticorpo secundário e incubar a membrana por 5 a 15 minutos na plataforma
de balanço em alta velocidade. Coloque fora o anticorpo secundário, enxague a
membrana rapidamente em 50 mililitros de tampão de lavagem e descarte o tampão de
lavagem. Adicione mais 50 mililitros de tampão de lavagem e lave a membrana por três
minutos na plataforma de balanço em uma configuração de velocidade média. Descartar o
tampão de lavagem. Adicionar 10 mililitros de substrato. Incubar a membrana com o
substrato por 10 a 30 minutos com qualquer manual tremendo ou em uma plataforma
oscilante, observe o desenvolvimento da cor. Uma vez que as cores se desenvolveram,
enxague a membrana duas vezes com água destilada e secar com toalha de papel por
três a sessenta minutos e depois capa em filme plástico para armazenamento.
