UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ALESSANDRA PANTOJA LISBOA

AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE ANTOCIANINAS E

PARTICIONAMENTO UTILIZANDO SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
COMPOSTO DE Etanol+(NH4)2SO4+ÁGUA PRESENTES NA CASCA DA
ACEROLA (Malpighia emarginata D.C.)

BELÉM-PARÁ

2018

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 ALESSANDRA PANTOJA LISBOA

AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE ANTOCIANINAS E

PARTICIONAMENTO UTILIZANDO SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
COMPOSTO DE Etanol+(NH4)2SO4+ÁGUA PRESENTES NA CASCA DA
ACEROLA (Malpighia emarginata D.C.)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação

em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade
Federal do Pará, Instituto de Tecnologia, como requisito
para obtenção do título de Mestre em Ciência e
Tecnologia de Alimentos.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Geormenny Rocha dos Santos

BELÉM - PA
2018

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ALESSANDRA PANTOJA LISBOA

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 ALESSANDRA PANTOJA LISBOA

AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE ANTOCIANINAS E

PARTICIONAMENTO UTILIZANDO SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS
COMPOSTO DE Etanol+(NH4)2SO4+ÁGUA PRESENTES NA CASCA DA
ACEROLA (Malpighia emarginata D.C.)

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________
Profª. Dra. Geormenny Rocha Dos Santos
(PPGCTA/ITEC/UFPA - Orientadora)

_______________________________________
Prof. Dr. Raul Nunes de Carvalho Junior
(PPGCTA/ITEC/UFPA) – Membro interno

_______________________________________
Prof. Dra. Alessandra Lopes Santos
(PPGCTA/ITEC/UFPA) – Membro interno (Suplente)

_______________________________________
Profa. Dra. Marta Helena Tavares Pinheiro
(PPGQ/ICEN/UFPA) - Membro externo

_______________________________________
Prof. Dr. Jesus Nazareno Silva de Souza
(PPGCTA/ITEC/UFPA) – Membro externo

4
“Não te mandei eu? Esforça-te e tem bom ânimo. Não temas, nem te espantes, porque o
Senhor teu Deus é contigo por onde quer que andares.” Josué 1,9.

Á minha mãe que é o meu suporte para tudo na vida

e meu grande tesouro.

Dedico.

5
 AGRADECIMENTO

Primeiramente a Deus, pois sem Ele nada seria, sempre me sustentando,

acalentando meus choros e me fortalecendo. A Nossa Senhora que é minha mãe do Céu
e sempre me protege por onde eu caminhar. E aos meus santos de devoção, São José e
São João Paulo II, muito obrigada pela intercessão.

A minha mãe, provedora dos meus estudos, minha eterna gratidão pois sem ela eu
não chegaria a qualquer lugar.

Aos meus amigos, por serem como irmãos para mim, sempre me aconselhando e
incentivando os meus sonhos e à minha família que sempre torcem por mim.

Agradeço aos meus amigos mestrandos e doutorandos, por todo apoio, carinho,
preocupação e amizade. A toda equipe do Laboratório Labex, Laos, Bioquímica, Lamefi,
Labiotec, Laquanan, Laboratório de espectrometria, LabCOR, que apoiaram e
incentivaram este trabalho.

À Elaine, Paulinho, Rômulo, Talita, Augusto, Bielly, Margareth, Silvio, Larissia,

Jardi, Tássio, Renatinha, Ricardo, Alexandre, Lúcia e Abraão que ajudaram tanto com a
amizade mas também com incentivos e mão de obra. A Hadryane pela sempre tão solícita
ajuda na secretária da pós. Ao Sr Mário pela ajuda nas análises físico-químicas e a todos
que não pouparam esforços para ajudar, muito obrigado mesmo!

A Prof. Dra. Geormenny, pela orientação durante todo o desenvolvimento deste

trabalho. Seus ensinamentos e orientação foram de grande importância e relevância para
a conclusão do mesmo.

Á Prof. Dra Nádia e aos Prof (es). Dr (es). Raul, Renan e Éder obrigada pela
disposição em sempre tirar as minhas dúvidas, Deus lhes pague! Aos Prof (es). Dr (es)
Jesus e Marta por aceitarem participar da minha banca, contribuindo para o crescimento
do meu trabalho.

Ao corpo docente do PPGCTA da UFPA que contribuiu para conhecimento que

adquiri, apoio e ajudou para a minha formação. Agradeço imensamente a todos que me
ajudaram de forma direta ou indireta, Deus lhes pague.

6
RESUMO

Antocianinas têm se destacado como corante natural na indústria alimentícia por serem
poderosos antioxidantes in vivo, responsáveis pela coloração de azul à vermelho de flores,
frutas e folhas. Além disso, o consumo regular deste corante está associado a possíveis
benefícios à saúde humana despertando interesse na indústria de alimentos. As técnicas
utilizadas para obtenção deste corante implicam na co-extração de substâncias
indesejadas que podem comprometer a sua qualidade, por isso, é essencial uma etapa de
purificação destes compostos antes da sua aplicação. A acerola (Malpighia emarginata
D.C) é uma fruta com potencial de obtenção de compostos fenólicos dentre eles as
antocianinas. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos do tempo, temperatura e
diluição da solução extratora etanol/água do processo de extração por agitação magnética.
Foi estudado a partição das antocianinas em sistemas aquosos bifásicos (SABs)
Etanol+(NH4)2SO4+água a 25ºC e 35ºC, verificado a capacidade antioxidante do extrato
particionado, identificado a presença de antocianinas (Cianidina-3-ramnosídeo,
Pelargonidina-3-ramnosídeo e Pelargonidina) na casca da acerola por meio da
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas. Ambas as
fases superiores de ambos os sistemas apresentaram um maior índice de saturação de cor
em relação à fases inferiores. No entanto o SAB etanol+(NH4)2SO4+água a 25ºC, mostrou
melhor eficiência de extração de 56% e obteve maiores concentrações de antocianinas
totais de 73,08 ±0,55 (mg/100g) e o sistema a 35ºC apresento maior AAT de
6122,45±0,07 (µM Trolox/g de amostra).

Palavras-chaves: antioxidantes, antocianinas, sistemas aquosos bifásicos-SAB, acerola

(Malpighia emarginata D.C.) , partição

7
ABSTRACT

Anthocyanins have emerged as a natural food in the food industry by powerful

antioxidants in vivo, responsible for the coloration of blue to flowers, fruits and leaves.
In addition, regular consumption of this dye is associated with food orders waiting for
interest in the food industry. The techniques used for the removal of this type of
processing are a co-extraction of undesirable substances which may compromise the
quality, therefore a purification step of the compounds prior to their application is
essential. An acerola (Malpighia emarginata D.C) is a fruit with potential to obtain
phenolic compounds such as anthocyanins. The objective of this work was to evaluate the
effects of temperature, dilution and extraction solution of ethanol / water extraction
process by magnetic stirring. The studied is one of the aqueous biphasic systems (SABs)
Ethanol + (NH4)2SO4 + H2O at 25ºC and 35ºC, presents an antioxidant capacity of the
particulate extract, identifies the presence of anthocyanins (Cyanidin-3-ramnoside,
Pelargonidin-3 ramnoside and Pelargonidin) in the acerola bark by means of the high
voltage liquid chromatography to the mass spectrometer. Both upper controllers of all
systems with higher class saturation index in relation to the later classes were SAB
ethanol + (NH4)2SO4 + H2O at 25ºC, better extraction efficiency of 56% and higher
anthocyanin results of 73.08 ± 0.55 (mg / 100g) and the system at 35 ° C showed higher
total antioxidant activity (AAT) of 6122.45 ± 0.07 (μM Trolox / g sample).

8
 LISTA FIGURA

Figura 1- Estrutura química básica das antocianinas....................................................... 21

Figura 2- Mudanças estruturais em meio aquoso em função do pH................................ 23

Figura 3- Representação esquemática de um diagrama de fase retangular, em coordenadas

cartesianas....................................................................................................................... 27

Figura 4- Diagrama de fase para sistemas aquosos bifásicos, expresso em coordenadas

triangulares...................................................................................................................... 28

Figura 5- Caracterização da matéria prima...................................................................... 41

Figura 6- Produção do extrato......................................................................................... 42

Figura 7- Particionamento............................................................................................... 43

Figura 8- Extrato das antocianinas particionadas no SAB............................................... 52

Figura 9- Cromatograma de íons totais para as antocianinas presentes na amostra da casca

da acerola liofilizada .......................................................................................................57

Figura 10- Espectros de íons totais de antocianinas presentes na amostra da casca da

acerola liofilizada.............................................................................................................58

11 Sistema etanol+Li2SO4+H2O...................................................................................... 62

1
9
 TABELAS

Tabela 1- Nomes e grupos substituintes de antocianidinas mais frequentes na natureza 21

Tabela 2- SAB contendo etanol e sais inorgânicos.......................................................... 31

Tabela 3- SAB contendo PEG e sais inorgânicos............................................................ 32

Tabela 4-Planejamento experimental.............................................................................. 48

Tabela 5- Frações mássicas das linhas de amarrações do Sistema Etanol+Sulfato de

Amônio+Água a 25°C.................................................................................................... 49

Tabela 6- Frações mássicas das linhas de amarrações do Sistema Etanol + Sulfato de

Amônio + Água a 35°C................................................................................................... 50

Tabela 7- Caracterizações físico- químicas da casca da acerola...................................... 56

Tabela 8- Antocianinas totais expressas em equivalente da antocianina principal

cianidina3-glucosídeo para as extrações por agitação magnética.................................... 60

Tabela 9- Antocianinas totais expressas em equivalente da antocianina principal

cianidina-3-glucosídeo para as extrações por agitação magnética sem evaporação........ 61

Tabela 10- Frações mássicas e densidade das linhas de amarrações do Sistema Etanol +
Sulfato de Amônio + Água a 25° e 35ºC.......................................................................... 63

Tabela 11- Resultados de ácido ascórbico, ABTS e antocianinas totais.......................... 64

Tabela 12- Análises realizadas nas LA dos sistemas de 25ºC e 35ºC.............................. 67

Tabela 13- Resultados da análise de cor.......................................................................... 69

10
 LISTA DE ABREVIAÇÕES

FQ – Fisico química

UR – Umidade Relativa

SAB – Sistemas aquosos bifásicos

LB – Linha binodal

PEG – Polietilenoglicol

ELL – Equilíbrio líquido-líquido

LA – Linha de amarração

CLA – Comprimento da linha de amarração

ILA – Inclinação da linha de amarração

w – Fração mássica

AAT – Atividade Antioxidante total

AT – Antocianinas totais

AA – Ácido áscórico

at – Açúcares totais

FS – Fase superior

FI – Fase inferior

1
11
 SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 14

2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 17

2.1 Objetivo geral: ...................................................................................................... 17

2.2 Objetivos específicos: ........................................................................................... 17

3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 18

3.1 Acerola .................................................................................................................. 18

3.2 Antocianinas ......................................................................................................... 18

3.2.1 Estabilidades das antocianinas ....................................................................... 20

3.2.2 Estrutura química ........................................................................................... 20

3.2.3 Influenciadores da cor das antocianinas (pH e Temperatura) ........................ 21

3.2.4.Degradação das antocianinas ......................................................................... 24

3.2.5 Extração de biomoléculas............................................................................... 24

3.3 Sistema aquoso bifásico (SAB) ............................................................................ 25

3.3.1 Diagrama de fase ............................................................................................ 26

3.3.2 Sistema álcool/ sal .......................................................................................... 29

3.3.3 Sistema polietilenoglicóis (PEGs)/ sal ........................................................... 31

3.4 Atividade Antioxidante ......................................................................................... 32

3.5 Ácido ascórbico – Vitamina C .............................................................................. 34

3.6 Cor ........................................................................................................................ 35

3.7 A cromatografia líquida (LC) ............................................................................... 36

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 40

4.1 Matéria prima ........................................................................................................ 40

4.2 Métodos ................................................................................................................ 40

4.2.1 Caracterização físico – química ..................................................................... 44

4.2.2 Extração .......................................................................................................... 46

1 12
 4.2.3 Dados de equilíbrio dos sistemas etanol+Li2SO4+H2O e etanol+(NH4)2SO4+
H2O (Sistema em branco) ........................................................................................ 49

4.2.4 Partição das antocianinas do extrato no SAB - etanol+(NH4)2SO4+H2O ...... 52

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 56

5.1 Caracterização fisico–química e Antocianinas totais ........................................... 56

5.1.1 Cromatografia líquida (LC-MS) .................................................................... 57

5.2. Extração de antocianinas ..................................................................................... 59

5.3 Sistema etanol+Li2SO4+H2O ................................................................................ 62

5.3.1 Sistema etanol+(NH4)2SO4+H2O ................................................................... 63

5.3.2 Partição das LA do sistema Etanol/(NH4)2SO4/água ..................................... 63

6 CONCLUSÃO............................................................................................................ 71

7 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 72

113
1 INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, aumentou o interesse em explorar os benefícios para a saúde

humana ocasionados pelas capacidades de eliminação de radicais livres e antioxidantes
das antocianinas naturalmente disponíveis em frutas e vegetais.

A fruticultura é um dos setores de maior destaque do agronegócio brasileiro, por

meio de uma grande variedade de culturas produzidas em todo o país e em diversos
climas, que conquista resultados expressivos e gera oportunidades para os pequenos
negócios brasileiros. O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas no mundo, ficando
atrás apenas de China e Índia, o que mostra a relevância do setor para a economia
brasileira (SEBRAE, 2015).

A aparência de um produto é um fator importante na hora de se tomar a decisão

para sua compra, mas estudos revelam que não basta apenas uma boa imagem, os
consumidores estão cada vez mais conscientes sobre saúde e bem estar. Além disso, há
uma busca crescente, por parte dos consumidores, por uma alimentação mais saudável, o
que impulsiona a inovação para uso de ingredientes naturais que atendam às exigências
do mercado. Corantes naturais são pigmentos extraídos de fontes naturais e têm a
finalidade de conferir, intensificar ou padronizar a coloração de produtos alimentícios. Os
principais corantes naturais utilizados no Brasil são: urucum, cúrcuma, luteína, clorofila,
páprica, caroteno natural, antocianinas, beterraba, carvão vegetal, entre outros (FOOD
INGREDIENTS BRASIL Nº 18, 2011).

A Acerola (Malpighia emarginata DC.), originária das Antilhas, foi introduzida

no Brasil há 50 anos, hoje é o principal produtor, consumidor e exportador mundial, a
acerola é uma fruta tropical bastante utilizada no desenvolvimento de novos produtos.
Possibilitando, dessa forma, absorver grande parte da colheita, favorecendo o consumo
de frutas durante o ano todo e a redução do desperdício de alimentos (CAETANO et al.,
2012). Devido ao elevado teor de ácido ascórbico, a acerola possui boa aceitação no
mercado; assim como suas características nutricionais, agregadas ao sabor e a textura,
que agrada ao paladar do consumidor. Possui destaque por conter carotenóides e
fotoquímicos, como as antocianinas.

Os benefícios das antocianinas na saúde humana estão relacionados ao seu efeito

antioxidante, tornando-se importante na prevenção de doenças crônicas não

14
transmissíveis e prevenção de diversos tipos de neoplasias. A literatura evidencia que o
consumo de alimentos fontes de antocianinas tem relação protetoras contra o estresse
oxidativo, fato este importante na redução de danos ao DNA e outras estruturas células
que poderiam desencadear processos inflamatórios e doenças como o câncer, porém tal
mecanismo no câncer ainda não está totalmente esclarecido (SANTOS et al., 2014).

As substâncias antioxidantes são formadas por vitaminas, minerais, pigmentos

naturais e outros compostos vegetais (antioxidantes não enzimáticos) e, ainda, por
enzimas (antioxidantes enzimáticos) que combatem o efeito nocivo dos radicais livres.
Tal como o nome indica, os antioxidantes impedem a oxidação de outras substâncias
químicas (YAHIA, 2010).

As antocianinas são responsáveis pela cor vermelha da acerola. A determinação

da composição antociânica nos alimentos é uma questão importante para fins de
identificar suas estruturas químicas. Os perfis das antocianinas presentes em frutas e
vegetais podem ser usados como impressões digitais através dos quais a autenticidade de
matérias-primas, produtos e extratos podem ser avaliadas. Uma série de metodologias
estão disponíveis para a análise de antocianinas, dentre elas está a cromatografia líquida
de alta eficiência (HPLC) acoplada ao espectrômetro de massas (MS). Neste tipo de
cromatografia os componentes são separados pelo enchimento da coluna que envolve
várias interações físicas ou químicas entre as moléculas e as partículas de enchimento.
Estes componentes são detectados à saída da coluna por um detector.

A extração convencional normalmente é realizada empregando solventes

orgânicos e geralmente é combinada com agitação/e ou aquecimento. O solvente utilizado
na extração pode influenciar significativamente no nível de componentes recuperados,
água, metanol, etanol, acetona, soluções aquosas destes solventes e acetato de etila são
comumente usados como solventes de extração. (GONZÁLEZ- MONTELONGO et al.,
2010).

As operações de extração líquido-líquido que usam sistemas de duas fases aquosas

como meio extrator surgem como um método alternativo para a extração e purificação de
biomoléculas, nesse sentido os sistemas aquosos bifásicos (SAB) são formados por
espécies químicas que, quando misturadas em determinadas faixas de composição e
temperatura, dividem-se em duas fases com composições diferentes, em equilíbrio
termodinâmico, cujas fases são constituídas majoritariamente por água. Os solutos se

15
distribuem entre as duas fases, dependendo da sua afinidade relativa por cada uma das
fases individuais (ALBERTSSON, 1986).

Os sistemas usando polímeros/sal são os mais utilizados, no entanto o seu uso é

mais caro, com isso alternativas vem sendo estudadas como os SAB compostos por álcool
de cadeia curta/ sal. O uso do álcool permite um custo menor e uma fácil recuperação do
solvente por evaporação (YAU et al., 2015).

Espera-se que durante a formação do SAB a fase superior tenha maior

concentração da molécula alvo, enquanto que a fase inferior seja enriquecida com
componentes indesejáveis (contaminantes). Particularmente, no SAB formado por
polímeros termossensível ou álcool, a fase topo pode ainda sofrer transformações de
modo a recuperar unicamente o produto desejado via elevação de temperatura ou
evaporação do solvente (WU, Y et al., 2014; YAU et al., 2015).

A escolha do método de extração de antocianinas depende da proposta de

aplicação, é importante que seja um método simples, rápido, de baixo custo e que utilize
solventes extratores de baixa toxicidade. Em geral, SAB é usado como um passo de
separação para obter as moléculas a partir de uma solução aquosa previamente preparada.

16
2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral:

• Avaliar a capacidade de extração de antocianinas da casca de acerola utilizando a

extração por agitação magnética estudando a partição das antocianinas no sistema aquoso
bifásico (SAB) PEG+(NH4)2SO4+H2O; Etanol+(NH4)2SO4+ H2O e Etanol+Li2SO4+ H2O
a 25ºC e 35ºC.

2.2 Objetivos específicos:

• Avaliar os efeitos do tempo, temperatura e diluição da solução extratora etanol/água

sobre a extração de antocianinas da casca de acerola utilizando processo de extração, por
agitação magnética.

• Determinar o coeficiente de partição das antocianinas da casca de acerola nos sistemas

aquosos bifásicos (SAB) PEG+(NH4)2SO4+ H2O; Etanol+(NH4)2SO4+ H2O e Etanol+ Li
2SO4+ H2O a 25ºC e 35ºC.

• Verificar a atividade antioxidante do material particionado no sistema

Etanol+(NH4)2SO4+ H2O a 25ºC e 35ºC.

17
3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Acerola

A acerola (Malpighia emarginata D.C.), é um fruto de grande valor nutricional

por apresentar altas concentrações de ácido ascórbico (AA), agregando um alto potencial
nutricional para o consumo do fruto fresco ou industrializado (MENDONÇA;
MEDEIROS, 2011; SEGTOWICK et al., 2013). O fruto nasce na aceroleira que é um
arbusto de até 3 metros de altura, seu tronco se ramifica desde a base, e sua copa é bastante
densa com pequenas folhas verde-escura e brilhantes. Suas flores de cor rósea
esbranquiçada, são disposta em cachos, têm floração durante o ano todo, e após três a
quatro semanas se dá a frutificação. A formação do fruto se processa rapidamente entre
22 e 25 dias (NEVES, 2007).

Os frutos são drupas tricarpeladas, com epicarpo fino, mesocarpo carnoso e

suculento, podem ser constituídos de três caroços triangulares, alongados, a superfície do
fruto pode ser lisa ou apresentar, entre os carpelos, sulcos rasos ou profundos, dependendo
de sua forma de cultura podem apresentar formatos diferenciados, através do clima, solo,
irrigação e tempos de colheita (RITZINGER e RINTZINGER, 2011).

O estágio de desenvolvimento (abertura da flor até o amadurecimento) da acerola

compreendeu um período de 25 dias. A acerola no estágio maduro destaca-se por
apresentar teores significativos destes compostos bioativos, dentre eles a antocianina e o
ácido ascórbico que fazem desta fruta uma fonte promissora de compostos antioxidantes.
(MARANHÃO, 2010).

A acerola apresenta grande potencial econômico, podendo ser utilizadas em

diversos segmentos como nas indústrias farmacêutica, de cosmético, mas principalmente
na alimentícia (LIMA et al., 2013).

3.2 Antocianinas

As antocianinas pertencem ao grupo dos flavonoides que compõem a maior classe

de compostos fenólicos e compreendem um grande número de substâncias coloridas e

18
estão amplamente distribuídas na natureza. Este subgrupo dos flavonóides se caracteriza
por ser o principal componente dos pigmentos vermelho, azul e roxo (RAMOS
ESCUDERO; GONZALEZ-MIRET; GARCIA-ASUERO, 2012) nas pétalas de flores,
nas frutas, nos grãos e vegetais em geral.

Suas características e benefícios na saúde humana por meio dos alimentos já foram
descritas por pesquisadores (LEYDENS, 2011; PEREIRA, 2012; FERREIRA, 2013;
BRITO, 2016).

As antocianinas são os membros mais reconhecidos e visíveis dentre os

fitoquímicos bioflavonóides devido sua propriedade de coibir a atuação de radicais livres
e por atuarem como antioxidante, os pigmentos de antocianinas são os mais divulgados
como alternativa para o tratamento de certas doenças. A antocianina isolada e misturas
de bioflavonóides ricos em antocianinas pode promover proteção contra a clivagem do
DNA, atividade estrogênica, inibição de enzimas, entre outras (LILA, 2004, GONG; LI;
YANG, 2014).

É bem sabido que as antocianinas são solúveis em solventes polares e comumente

extraídas por misturas aquosas de solventes orgânicos tais como etanol, metanol ou
acetona (KANO et al.,2005).

Geralmente, a medição de antocianinas é feita por análise espectrofotométrica.

Esta técnica não reflete a cor quando mede a absorbância de um extrato num particular
comprimento de onda. Por outro lado, a cor visível, que é um indicativo da concentração
do pigmento, pode ser medida instantaneamente usando colorímetros Hunter para
controle de qualidade (KARA e ERÇELEBI, 2013).

Vendramini e Trugo (2004) determinaram a composição qualitativa dos

compostos fenólicos em acerola proveniente do Rio de Janeiro-Brasil, através de CLAE
UV/Vis, sendo que os compostos separados foram divididos em dois grupos: 1)
compostos fenólicos antociânicos identificados como malvidina-3,5-diglicosilada,
cianidina-3-monoglicosilada e pelargonidina; 2) compostos fenólicos não antociânicos
identificados como ácidos fenólicos (ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido cumárico e
ácido ferúlico) e como flavonóides (quercetina e kaempferol).

19
3.2.1 Estabilidades das antocianinas

Todos os produtos apresentam um tempo de vida útil que é caracterizado pela sua
estabilidade nutricional, sensorial, química, física e microbiológica. Entende-se por
estabilidade de um produto o período no qual ele pode ser consumido de forma que as
suas características nutricionais e microbiológicas estejam conservadas (YUYAMA et al.,
2008). Geralmente as vitaminas, ácidos, carboidratos, proteínas, pigmentos entre outros
constituintes, são sensíveis a fatores externos e internos como a luz, temperatura,
umidade, tempo de processamento, pH, degradando facilmente devido a reações
enzimáticas de óxido-redução (FREITAS et al., 2006; YUYAMA et al., 2008).

A estabilidade das antocianinas é maior sob condições ácidas, mas pode ocorrer
degradação por vários mecanismos, iniciando com perda da cor, seguida do surgimento
de coloração amarelada e formação de produtos insolúveis. A estabilidade da cor de
antocianinas é dependente da estrutura e da concentração dos pigmentos, além de fatores
como o pH, temperatura e a presença de oxigênio (LOPES et al., 2007).

3.2.2 Estrutura química

O principal emprego biológico atribuído às antocianinas é a atividade antioxidante

(SUN et al., 2002; MEYERS et al., 2003), essa atividade se deve a sua estrutura química.
As antocianinas são as principais responsáveis por inúmeras tonalidades de cores
encontradas em flores, frutas e folhas, e responsáveis pela maioria das colorações azuis,
violeta e vermelho.

Em produtos naturais, a maioria das substâncias responsáveis pela coloração

pertence à classe dos flavonoides. Os flavonoides possuem estrutura marcada pela
presença de um esqueleto com 15 átomos de carbono na forma C6C3C6, e são divididos
em classes dependendo do estado de oxidação do anel central de pirano (MARÇO et al.,
2008).

Suas moléculas possuem estruturas elaboradas, e são baseadas em um esqueleto

policíclico de quinze carbonos, onde os diferentes grupos ligados, “R”, caracterizam cada
composto de antocianinas (BRILHANTE et al., 2012) como mostra a figura 1.

20
 Figura 1- Estrutura química básica das antocianinas

Fonte: Arquivo pessoal

Das 23 antocianidinas, apenas 6 são as mais comuns nas plantas: Cianidina Delfinidina,
Pelargonidina, Peonidina, Petunidina, Malvidina., dentre outras mostradas na tabela 1.

Tabela 1- Nomes e grupos substituintes de antocianidinas mais frequentes na natureza.

Aglicona R1 R2 R3 R4 Massa Molecular (daltons)

Cianidina OH H OH H 287
Tricetidinina OH OH H H 287
Aurantidina H H OH OH 287
Delfinidina OH OH OH H 303
6-Hidroxicianidina OH H OH OH 303
Malvidina OCH3 OCH3 OH H 331
Pelargonidina H H OH H 271
Luteolidina OH H H H 271
Peonidina OCH3 H OH H 301
Petunidina OCH3 OH OH H 317

3.2.3 Influenciadores da cor das antocianinas (pH e Temperatura)

A importância das cores na percepção pelos sentidos é marcante, sendo um dos critérios
utilizados na identificação, aceitação ou rejeição de produtos alimentícios (SILVA et al.,
2006). A coloração das antocianinas depende do seu pH, variando de vermelho em meio
21
ácido a azul em meio básico, sendo elas mais estáveis em meio ácido (ANDERSEN;
JORDHEIM, 2006; TSAO, 2010). A variação se deve também à instabilidade das
antocianinas frente a fatores que podem ocorrer durante o processo de despolpamento e
congelamento da polpa, tais como incorporação de oxigênio, incidência de luz e
temperatura, conforme citado por Ribeiro e Seravalli (2004).

i. Potencial hidrogeniônico (pH)

O pH é o fator que mais influência na coloração das antocianinas, visto que, em função
de sua acidez ou alcalinidade, estas podem apresentar diferentes estruturas. (LEE et al.,
2005; ANDERSEN; JORDHEIM, 2006). Em valores de pH baixo (pH ~2,0), as
antocianinas se apresentam na forma de cátion flavílium, exibindo cor vermelha. Quando
acontece o equilíbrio ácido-base ocorre uma reação de hidratação do cátion ou a
protonação desse íon. A primeira reação gera um produto de coloração incolor, uma
pseudobase, chamada carbinol (B) que em meio neutro (pH ~ 6,0) se transforma em
chalcona (C), que também é um produto incolor. Já a segunda reação produz uma base
quinoidal (A), de coloração azul, que se apresenta em co-equilibrio com o cátion flavílium
(AH+). (COUTO; RAMOS; CAVALHEIRO, 1998; CANUTO, 2011).

Estruturas moleculares encontradas em solução aquosa com diferentes valores de pH.

Cátion flavilium (AH+), A) base quinoidal; B) carbinol ou pseudobase e C) chalcona
(adaptado de LEVI et al., 2004) podem ser observadas na figura 2.

22
 Figura 2- Mudanças estruturais em meio aquoso em função do pH

Fonte: LEVI et al., (2004)

Bordignon et al., (2009) relatam que, conforme a variação do pH, ocorre mudança
dos máximos de absorção no espectro, fato que interfere diretamente no doseamento
destes metabólitos na matéria-prima analisada.

ii. Temperatura

O uso de extratos de antocianinas como corantes naturais é limitado em

decorrência da grande instabilidade desses compostos a fatores abióticos, dentre os quais
se destacam a luz e a temperatura (LIMA et al., 2003; LIMA et al., 2005). Kirca e
Cemeroglu (2003), demonstraram que a degradação térmica de antocianinas segue uma
relação linear entre concentração de antocianinas e tempo de estoque em determinada
temperatura, seguindo assim, uma reação de primeira ordem. O mecanismo exato da
degradação desses pigmentos em solução aquosa não é bem elucidado, mas acredita-se
que elevadas temperaturas promovam a formação de chalconas (incolor), como o
primeiro passo de degradação (PATRAS et al., 2010).

23
3.2.4.Degradação das antocianinas

A acerola muda de tonalidade com a maturação, passando do verde ao amarelo,

laranja, vermelho ou roxo (PORCU e RODRIGUEZ-AMAYA, 2003) devido, sobretudo,
à degradação da clorofila e à síntese de antocianinas e carotenoides. A cor vermelha da
acerola, no estádio maduro, decorre da presença de antocianinas (LIMA et al., 2002b).
Em acerola, evidencia-se uma grande variação no teor de antocianinas influenciando
consequentemente na cor dos frutos (LIMA et al., 2002a). Quanto maior o teor de
antocianinas, melhor a aceitação do produto por parte do consumidor (MOURA et al.,
2002).

Contudo, a combinação entre antocianinas e ácido ascórbico pode ser mutuamente

destrutiva em presença de oxigênio, o que limita a fortificação de alimentos contendo
antocianinas (TALCOTT et al., 2003).

West M. et al., (2013) estudaram a cor e as estabilidades químicas de seis

antocianinas, incluindo o cianidina-3-glicosídeo, altamente purificado e presente em
extratos semi purificados (também contendo outras antocianinas) de bagaço de uva, milho
roxo e arroz preto, foram determinados em combinação com ácido ascórbico em soluções
em diferentes concentrações. Valores de pH (3,0 e 4,0) e temperaturas (6 a 40 ° C) e pós
liofilizados em diferentes umidades relativas (43 98% UR). As alterações químicas e de
cor foram analisadas usando medições CIELAB e HPLC, respectivamente. Em líquidos,
a estabilidade foi inversamente relacionada ao aumento do pH e temperatura; para pós, a
estabilidade foi inversamente relacionada à umidade relativa. A degradação mútua de
antocianinas e ácido ascórbico em solução foi confirmada, baseado na estrutura da
antocianina, incluindo diferentes núcleos de flavilium (três tipos) e tipo de acilação (dois
alifáticos, um ácido cinâmico) ou pureza final do extrato.

3.2.5 Extração de biomoléculas

A extração é uma fase muito importante no isolamento, identificação e utilização

de compostos funcionais a partir de materiais vegetais (LAPORNIK et al., 2005). Várias
técnicas de extração convencional foram relatadas para a extração de fenóis a partir de

24
cascas de citros como a extração de solvente (ANAGNOSTOPOULOU et al., 2006;
JEONG et al., 2004; LI et al., 2006a; MANTHEY e GROHMANN, 1996; XU, YE,
CHEN E LIU, 2007; ZIA-UR-REHMAN, 2006).

Barros et al., (2011) apresentaram os resultados da extração convencional de

Asparagus acutifolius, à temperatura ambiente, com metanol: água (80:20%, v/v), e
descreveram um perfil fenólico constituído por três flavonoides e um ácido fenólico,
sendo a rutina (3-Orutinósido de quercetina) o composto fenólico mais abundante.

A extração de compostos bioativos de fontes vegetais utilizando solventes

eutéticos foi obtida por Almeida F, (2016), a partir de extrações realizadas por agitação
magnética e por maceração, que obteve extratos fenólicos preparados a partir de amostras
de espargos liofilizados.

3.3 Sistema aquoso bifásico (SAB)

Os sistemas aquosos bifásicos (SAB) são sistemas usados em processos de

extração líquido-líquido que tem sido utilizada para desenvolver bioprocessos para a
recuperação primária e purificação parcial de uma variedade de produtos biológicos,
como proteínas, material genético, bionanopartículas e fitoquímicos, bem como células e
organelas celulares. (ALBERTSSON et al., 1990; ANDREWS et al., 2010; MAZZOLA
et al., 2008).

Existem muitas áreas de oportunidade de pesquisa dentro da operação SAB

contínua, como o particionamento de bioafinidade (RUIZ-RUIZ et al., 2012), o
fracionamento de proteínas, o uso de SAB alternativos (Sistemas baseados Álcool/sal,
PEG/sal, PEG/Dextrana, e líquidos iónicos/sal) para recuperar diferentes biomoléculas,
os modelos operacionais para otimização de processos, recirculação de fase, operação em
grande escala, etc. (MAYOLO-DELOISA et al., 2010).

Os primeiros estudos envolvendo SAB datam do final da década de 1950 e início

da década de 1960, quando Albertsson PA, (1961) demonstrou a aplicação desta técnica
para o processamento a jusante de partículas e macromoléculas. Desde então, foram
realizadas pesquisas extensas sobre o uso de estratégias baseadas em SAB para
recuperação e purificação de biomoléculas. Esses estudos podem ser divididos em três

25
áreas principais: (1) caracterização do comportamento particional dos produtos
biológicos, (2) desenvolvimento de sistemas líquido-líquido novos ou modificados para
aumentar a seletividade de separação e (3) desenvolvimento de estratégias e abordagens
para a aplicação da tecnologia SAB em larga escala. Além disso, os SAB demonstraram
ter aplicações analíticas para a caracterização físico-química (particularmente
propriedades relacionadas à superfície, como hidrofobicidade e carga eletroquímica) de
compostos, bionanopartículas e células.

Em um sistema aquoso bifásico, quando as espécies químicas (polieletrólitos,

polímeros, líquidos iônicos, entre outras) são misturadas em determinadas composições
e temperatura dividem-se em duas fases de composições diferentes, que se encontram em
equilíbrio termodinâmico. Ou seja quando as duas fases do SAB estão em equilíbrio,
nenhuma propriedade termodinâmica varia em uma dimensão temporal, ou, ainda, não
existe troca resultante de matéria e energia entre as fases.

3.3.1 Diagrama de fase

3.3.1.1 Curva binodal

Os SAB podem ser obtidos pela combinação de dois polímeros hidrossolúveis,

que apresentam estruturas quimicamente diferentes, ou pela mistura de um polímero e um
sal (orgânico ou inorgânico) e, mais recentemente, pela mistura de líquidos iônicos e sais
inorgânicos. Entretanto, para aplicar os sistemas aquosos bifásicos ao estudo de partição
de biomoléculas é importante que se conheça previamente seus diagramas de fases. Esses
diagramas representam graficamente a composição na qual se formam duas fases líquidas
em equilíbrio termodinâmico. Pode ser dividido basicamente em duas regiões que em
coordenadas cartesianas (figura 3) na região situada acima da linha binodal, ocorre a
formação de duas fases; e abaixo dessa linha, o sistema se mantém homogêneo.

Quaisquer pontos que pertençam à região bifásica e estejam na mesma linha de

amarração (LA) terão as mesmas propriedades termodinâmicas intensivas, porém sendo
distintas as variáveis termodinâmicas extensivas (massa, volume etc.). O mesmo

26
raciocínio aplica-se para as fases inferiores formadas por composições globais localizadas
sobre a mesma linha de amarração (ZASLAVSKY, 1995; DA SILVA E LOH, 2006).

Nestes diagramas encontramos inúmeras informações, todas relacionadas à

minimização da energia livre do sistema. Por exemplo, podemos obter, em quais
composições globais o sistema é monofásico ou bifásico (figura 3 e 4), sendo estas duas
regiões demarcadas por uma linha denominada curva binodal.

Figura 3- Representação esquemática do diagrama de fase retangular, em coordenadas

cartesianas

Fonte: Lago, (2017); Gama, (2018)

3.3.1.2 Dados de equilíbrio/ Tie lines

Também são representadas as linhas de amarração (“tie lines”), que são retas que
ligam pontos no diagrama que representam a composição das duas fases em equilíbrio.
Qualquer conjunto de pontos que pertençam à região bifásica e que estejam sobre a
mesma linha de amarração fornecerá fases superiores que possuirão propriedades
termodinâmicas intensivas iguais (densidade, volume molar, entalpia molar, etc.),
entretanto, sendo distintas as suas variáveis termodinâmicas extensivas (massa, volume,
etc). Aplica-se o mesmo raciocínio para as fases inferiores formadas a partir de
composições globais localizadas sobre uma mesma linha de amarração. (DA SILVA E
LOH, 2006).

27
 No diagrama de fases (figura 4) a abscissa nos informa a concentração do eletrólito
(sal) e a ordenada a concentração do polímero presente no sistema. Esta representação
também nos mostra em quais composições globais o sistema se encontra homogêneo ou
heterogêneo, sendo essas duas regiões separadas pela linha binodal (LB). A posição da
binodal varia de acordo com o tipo de espécies químicas, natureza química do eletrólito,
temperatura e pH do meio (SVENSSON et al., 1997).

Figura 4- Diagrama de fase para sistemas aquosos bifásicos, expresso em coordenadas

triangulares

Região
monofásica

Linha de amarração

Região bifásica
Curva binodal

Fonte: Lago, (2017); Gama, (2018)

Existem distintos métodos para a obtenção da curva binodal, entretanto o mais

utilizado envolve titulação turbidimétrica e quantificação das composições das fases.

3.3.1.3 Qualidade dos dados de equilíbrio

As correlações de OTHMER-TOBIAS e HAND (CARTINI E RAIGANI, 1978),

equação 01 e 02, respectivamente, serão utilizadas para testar a validade dos dados
experimentais dos sistemas estudados, de modo a medir a confiabilidade dos dados
obtidos experimentalmente. A linearidade destas correlações indica o grau de
confiabilidade dos dados,

28
 1 − W1s 1 − W2I
ln ( ) = A + Bln ( ) (1)
W1S W2I

W3s W3I
ln ( S ) = A + Bln ( I ) (2)
W1 W3

Sendo que w1 corresponderá à fração mássica de PEG/etanol, w2 a fração mássica

de sal, e w3 a fração mássica de água; e os sobrescritos S e I representarão os pontos na
fase superior e a fase inferior, respectivamente. Com a construção das linhas de
amarrações os componentes se distribuem entre as duas fases de formas diferentes até
atingir o equilíbrio termodinâmico, O coeficiente de partição (k) serve para avaliar como
os componentes se distribuem entre as fases e são calculados como a razão descrita pela
equação 03:

Ci(fase superior)
K= (3)
Ci(fase inferior)

onde: Ci (fase superior) e Ci (fase inferior) são as concentrações no equilíbrio do

componente i nas fases superior e inferior, respectivamente (i= água, PEG/etanol, sal ou
antocianinas). Os valores dos coeficientes de partição elevados nos sistemas estudados
indicarão o elevado potencial de extração do material i em sistemas de duas fases aquosas.

O comprimento das linhas de amarração (CLA) e inclinação das linhas de

amarração (ILA) foram calculados de acordo com as Equações 4 e 5, respectivamente.

CLA = √[(CPs − CPi )2 + (CSs − CSi )2 ] (4)

(CPs −CPi )
ILA = (CSs −CSi )
(5)

3.3.2 Sistema álcool/ sal

29
 Nos últimos anos, os sistemas aquosos bifásicos com base num sistema de álcool
e sal têm sido utilizados para a recuperação de produtos sensíveis ao calor a partir de
extratos puros (CHEN et al., 2007). Este tipo de SAB tem vantagens se usado para separar
compostos bioativos.

Sistemas de Álcool /sais inorgânicos são usados como um novo sistema para
purificar compostos naturais, este sistema tem muitas vantagens como baixo custo, baixa
tensão interfacial, quando analisado por HPLC tem boa resolução, bem como alto
rendimento devido à sua estrutura, já que estes são adequados para compostos hidrofílicos
(RITO-PALOMARES, 2004).

Álcoois de cadeia curta como o etanol pode formar um sistema estável e ajustável
com sais inorgânicos (por exemplo, fosfato e sulfato) (JIANG et al., 2009; GÜNDÜZ,
2000).

Wu et al., (2011) mostraram que a extração, identificação e atividade antioxidante

do extrato de antocianinas da amora foram relatados em seu estudo por sistemas aquosos
bifásicos: relação solvente-sólido 45:1 (mL/g), etanol a 25% (w/w), concentração de
sulfato de amônio a 22% (w/w) e pH 3,3; O rendimento de antocianina e o coeficiente de
partição nas condições ótimas foram de 90,02% e 19,62, respectivamente. E o resultado
da análise HPLC-ESI-MS revelou oito tipos de compostos, e as principais antocianinas
foram cianidina-3-O-glicosídeo e cianidina-3-O-rutinosídeo, delfindina-3-rutinosídeo,
delfindina-3-(6-malonil)-glicosídeo e peonodina-3-xilosil-ramnosídeo. O SAB não
afetou a composição da mistura de antocianina, e o extrato mostrou uma atividade
antioxidante relativamente elevada em comparação com a extração convencional,
concluindo que o SAB era o método desejado que purificou as antocianinas em uma única
etapa, o método também reduziu o tempo de processamento e reduziu o custo. O SAB é
muito promissor na purificação de outros pigmentos antocianinas naturais.

Outros trabalhos utilizando álcool e sais inorgânicos podem ser observados na

tabela 2.

30
Tabela 2- SAB contendo etanol e sais inorgânicos.

Sal Álcool Amostra T(ºC) Referência

(NH4)2SO4 Etanol Caldo de fermentação 20 Li, Z. et al (2010)

NaH2PO4/(NH4)2SO4 Etanol Suco de uva 25 Wu, Y. et al (2014)

(NH4)2SO4 Etanol Batata roxa 20-60 Liu, X. et al (2013)

(NH4)2SO4 Etanol Amora 25-50 Wu X. et al (2011)

(NH4)2SO4 Etanol Mirtilo 30 Almeida, H (2016)

3.3.3 Sistema polietilenoglicóis (PEGs)/ sal

Os PEGs são moléculas relativamente estáveis, biodegradáveis, não tóxicas e são

muito utilizados na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. São também
conhecidos pelos nomes comerciais de poliglicol E®, carbowax E® e pluracol E®,
dependendo da empresa que os fabricam. Os polietilenoglicóis são fornecidos na forma
de soluções incolores estáveis ou pastas, se possuírem massas moleculares menores que
1000. Os PEGs de massas moleculares acima de 1000 são encontrados na forma de pó ou
de flocos brancos e podem ser estocados a temperatura ambiente, sendo que a 4°C a
oxidação dessas soluções é retardada. A oxidação do PEG é detectada pela diminuição
do pH, devido à liberação de grupos ácidos que altera a coloração da solução para marrom
(RABELO, 1999).

Os sistemas formados dois polímeros (PEG, dextrano e polipropileno glicol) ou

um polímero e um sal (fosfato, sulfato e citrato) são combinados em concentrações 28
críticas que formam duas fases cujo componente principal é a água. Os primeiros estudos
envolvendo SAB datam do final da década de 50 e início dos anos 60, quando Albertsson,
(1986) demonstrou o grande potencial dos sistemas polímero-polímero para a
recuperação primária de macromoléculas biológicas. Dado que a força iónica nos
sistemas de polímero-polímero é extremamente baixa, eles são usados preferencialmente
para a separação, recuperação e purificação de solutos extremamente sensíveis a
ambientes iónicos, bem como células viáveis e organelas susceptíveis ao choque
osmótico. Além dos sistemas de polímero-polímero tradicionais, existem SABs que

31
exploram o uso de copolímeros de óxido de etileno e óxido de propileno que se revelaram
eficientes para o desenvolvimento de processos de fracionamento. Os SABs de
polímerosal são usados para uma grande variedade de biomoléculas, principalmente
proteínas e partículas, sendo a sua única inconveniência a força iónica relativamente alta
na fase rica em sal.

A aplicação de particionamento em duas fases para cultura de células de morango

produtoras de antocianina relatadas por Edahiro et al., (2005) demonstrou o efeito das
mudanças nas propriedades da superfície celular na partição em SABs.

Meychik et al., (2001) mostraram que alterações superficiais foram causadas por
alterações no metabolismo secundário intracelular em células acumuladas de antocianina.
Foram utilizados 7% p/p de dextrano T500 e 4,4% p/p de sistema PEG 6000 para
experiências de particionamento celular. Além disso, a adição de sulfato de lítio ou
tampão de fosfato de potássio (pH 6.4) deslocou o comportamento de partição das células
do fundo para a fase superior. As células cultivadas com carga negativa mudaram a
partição de acordo com sua superfície celular, adicionando sulfato de lítio ao sistema.
Este sal é conhecido por partição diferencialmente para as fases superior e inferior,
causando uma diminuição no potencial elétrico do sistema, equilibrando as interações
eletroquímicas e hidrofílicas entre a superfície celular e a solução de fase.

Outros trabalhos utilizando PEG e sais inorgânicos podem ser visto na tabela 3.

Tabela 3: SAB contendo PEG e sais inorgânicos.

Sal M PEG [g / mol] Temperatura (ºC) Referência

(NH4)2SO4 1000-6000 10-45 Salabat. A. (2001)

NaH2PO4 995-5886 25-45 Zafarani-Moattar et al (2001)

(NH4)H2PO4 5886 25-45 Zafarani-Moattar et al (2002)

K3PO4 1000-3400 05-45 Huddleston et al (2003)

3.4 Atividade Antioxidante

32
 O conceito de capacidade antioxidante originou-se pela química e foi
posteriormente adaptado à biologia, medicina, epidemiologia e nutrição (CAO E PRIOR,
1998; FLOEGEL et al. 2010; PELLEGRINI et al., 2003). Ele descreve a capacidade das
moléculas redox em alimentos e sistemas biológicos para eliminar os radicais livres. Este
conceito fornece uma imagem mais ampla dos antioxidantes presentes em uma amostra
biológica, pois considera os efeitos aditivos e sinérgicos de todos os antioxidantes em vez
do efeito de compostos isolados e, portanto, pode ser útil para estudar os potenciais
benefícios para a saúde dos antioxidantes em substâncias oxidativas doenças mediadas
pelo estresse (BRIGHENTI et al., 2005; PUCHAU et al., 2009).

Os métodos antioxidantes também podem auxiliar na escolha das espécies de

planta para estudos químicos e farmacológicos, comprovando ou não a presença de
substâncias com capacidade antioxidantes em alimentos e bebidas, podendo agregar valor
comercial aos alimentos (ALVES et al., 2010).

A capacidade antioxidante pode ser expressa por meio de vários parâmetros,

incluindo a remoção de um radical peroxil (ORAC - oxygen radical absorbance capacity,
TRAP - total reactive antioxidant potential), a capacidade de redução de metal (FRAP -
ferric reducing antioxidant power, CUPRAC - cupric ion reducing antioxidant capacity),
a capacidade de remoção de radical orgânico (ABTS - 2,20-azino-bis (ácido 3-
ethylbenzthiazoline-6-sulfônico), DPPH - peroxidação do 2,2-difenil-1-picrylhydrazil) e
a quantificação de produtos formados durante a peroxidação de lipídeos (TBARS, a 30
oxidação do LDL, co-oxidação do β-caroteno). Os métodos FRAP, ABTS, DPPH e
ORAC são mais utilizados para determinar a capacidade antioxidante in vitro.

O método FRAP baseia-se na habilidade antioxidante de um composto, em

transformar o ferro na forma complexada com a 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) Fe3+ -
TPTZ em Fe2+TPTZ (ferroso-tripiridiltriazina), na presença de um antioxidante e em
condições ácidas. O complexo Fe2+ -TPTZ possui coloração azul podendo ser verificada
na absorbância 593 nm, esta coloração é proporcional a concentração de Fe na amostra.
As limitações do método estão relacionadas ao fato de que o redutor que é hábil para
reduzir Fe3+ a Fe2+ às vezes pode não ser um antioxidante e muitos antioxidantes podem
não ter a habilidade específica para reduzir Fe3+ a Fe2+, a exemplo a glutationa
(VASCONCELOS et al. 2008).

33
 No método ABTS, quando o perfulfato de potássio é adicionado ao ácido 2,2-
azino-bis (3-etilbenzotiazolina)-6-sulfônico (ABTS), faz com que este seja convertido ao
seu cátion (ABTS•+). Este radical de cor azul esverdeado absorve a luz a 734 nm e é
reativo para a maioria dos antioxidantes tanto de natureza hidrofílica quanto hidrofóbica,
sendo esta uma de suas vantagens quando comparada a outros métodos. Neste ensaio
antioxidante, o cátion radical ABTS azul esverdeado é convertido em sua forma neutra,
tornando-se incolor, devido a sua captura pela substância antioxidante avaliada. A reação
pode ser monitorada espectrofotometricamente (MARTYSIAK-ZUROWSKA e
WERONIKA-WENTA, 2012). Uma vantagem deste método é seu uso ser permitido tanto
em soluções orgânicas quanto aquosas (PRADO, 2009).

O método DPPH se baseia na capacidade antioxidante de uma determinada

substância em sequestrar o radical DPPH, transformando a sua forma reduzida chamada
hidrazina. Quando uma determinada substância age como redutora, doando átomos de
hidrogênio ao radical DPPH, a hidrazina é obtida e como consequência ocorre uma
mudança na coloração de violeta a amarelo pálido. Este decaimento da coloração pode
ser observado pelas leituras nas absorbâncias 515 a 528 nm (ALVES et al., 2010).

O método ORAC possui uma vantagem muito importante com relação aos outros
métodos de determinação da capacidade antioxidante que usam a absorbância, que é o
uso da fluorescência como medida do dano oxidativo, pois assim ocorre menor
interferência dos compostos coloridos presentes nas amostras. Isso é fator importante a
se considerar quando se analisam alimentos que possuem cor (especialmente frutos e 31
hortaliças), suplementos de produtos naturais e vinho tinto. Outra vantagem é o uso de
radicais peroxila ou hidroxila como pró-oxidantes, conferindo maior significado
biológico em relação aos métodos que usam oxidantes não necessariamente, próoxidantes
fisiológicos (LIMA, 2008).

Os métodos para avaliação da atividade antioxidante propostos na literatura são

diversos, porém alguns são mais apropriados que outros, dependendo da natureza dos
compostos presentes na constituição de cada fruta.

3.5 Ácido ascórbico – Vitamina C

34
 A acerola (Malpighia emarginata) é uma fruta que tem se destacado por ser uma
grande fonte de vitamina C. Também é conhecida como cereja-das-antilhas, por originar-
se nesta região (Norte da América do Sul e América Central). Além da vitamina C, a
acerola contém polifenóis, outro nutriente funcional benéfico para a saúde humana. Como
promissora fonte de vitamina C e compostos fenólicos, a acerola tem um grande potencial
na indústria alimentícia, podendo ser utilizada como suplementos nutricionais ou aditivos
para aumentar o valor nutricional de outros produtos (MACIEL et al. (2010); OLIVEIRA
et al. 2012).

A vitamina C confere um papel essencial como antioxidante e participa de

inúmeras reações no organismo humano, sendo responsável, por exemplo, pela produção
do colágeno, aumento e resistência às infecções, auxílio na absorção de ferro e zinco e na
eliminação de metais, além de prevenir o escorbuto. (MAIA, 2007).

A vitamina C tem múltiplas funções no organismo. É necessária para a produção

e manutenção do colágeno; é responsável pela cicatrização de feridas, fraturas, contusões
e sangramentos gengivais; e reduz a suscetibilidade à infecção, desempenha papel na
formação de dentes e ossos, aumenta a absorção de ferro e previne o escorbuto. Desse
modo, a vitamina C é importante no desenvolvimento e manutenção do organismo
humano. Alguns frutos tropicais tais como acerola e camu-camu fornecem alto teor de
vitamina C a baixo custo (ALBERTINO et al., 2009).

3.6 Cor

A avaliação sensorial da cor é critério subjetivo de baixa precisão, quando se

objetiva quantificar alterações progressivas e de pequena monta em materiais sujeitos a
mudanças de cor. Sistemas de controle baseados em medidas objetivas e valores
numéricos são, geralmente, utilizados, quando se deseja prevenir erros devido a
diferenças na percepção visual desse parâmetro. Nesses sistemas, as alterações dos
pigmentos podem ser detectadas pela medida da cor, que pode ser usada como um meio
indireto de análise para estimar compostos coloridos de alimentos e, muitas vezes, é mais
simples e rápida do que a análise química (FRANCIS, 1982).

35
 Com o objetivo de normalizar a medição da cor, em 1931 a CIE (Commission
Internationale de l’Eclairage) adotou os seguintes métodos para medição e especificação
de cor: uso de fontes de luz-padrão definidas pela CIE, condições exatas para observação
ou medição da cor, uso de unidades matemáticas apropriadas para expressar a cor e
definição do observador-padrão (JIMÉNEZ; GUTIÉRREZ, 2001).

Em 1976, a CIE recomendou o uso da escala de cor CIE L*a*b*, ou CIELAB. O

máximo valor de L* (luminosidade) é 100, e representa uma perfeita reflexão difusa,
enquanto que o valor mínimo é zero e constitui o preto. Os eixos a* e b* não apresentam
limites numéricos específicos. A coordenada a* varia do vermelho (+a*) ao verde (-a*),
e a coordenada b* do amarelo (+b*) ao azul (-b*). Os valores delta (∆L*, ∆a* e ∆b*) indicam
o quanto a amostra diferiu do padrão para L*, a* e b*, e são frequentemente utilizados no
controle de qualidade e ajustes de formulação, além de serem utilizados para o cálculo da
diferença total de cor (∆E*) (HUNTERLAB, 1996).

L* varia de 0 a 100, em que o valor 0 indica o preto (ou cor escura) e o 100, o
branco (cor clara), a* varia de 0 a 100, em que o valor 0 indica o verde e o 100, o
vermelho. Existe uma relação para as cores verde e vermelha. Quando o valor é 0 ou
próximo a 0 para o verde, há maior índice de saturação na amostra e os valores próximos
a 100 há menor índice de saturação. Para a cor vermelha já é ao contrário o resultado. b*
varia de 0 a 100, em que o valor 0 indica o azul e o 100, o amarelo. Quando o valor é 0
ou próximo de 0 para o azul, há maior índice de saturação e os valores próximos a 100
indicam um menor índice de saturação. Já para o amarelo, é ao contrário o resultado do
índice de saturação (CANUTO et al., 2010).

3.7 A cromatografia líquida (LC)

A cromatografia líquida (LC) que é uma das formas de cromatografia, é uma

técnica analítica de separação, que envolve a injeção de um pequeno volume de amostra
líquida num tubo cheio de partículas porosas, fase estacionária, onde os componentes
individuais da amostra são transportados ao longo do tubo de enchimento, a coluna, por
um líquido movido pela força da gravidade, fase móvel. A separação ocorre porque, no
âmbito de um conjunto ótimo de condições, cada componente de uma mistura irá interagir
física e quimicamente com as duas fases de modo diferente em relação aos outros

36
componentes da mistura. A cromatografia líquida é o nome genérico utilizado para
descrever qualquer procedimento de cromatografia em que a fase móvel é um líquido.
Com o avanço da cromatografia em coluna, desenvolveu-se a utilização de suportes com
partículas menores responsáveis por uma melhor eficiência e como tal tornou-se
necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, daí o
desenvolvimento da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). A cromatográfica
líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC-MS) representa uma metodologia
rápida e de fácil acesso com alta sensibilidade e baixa demanda de amostra.

A espectrometria de massas (do inglês “mass spectrometry” - MS) é uma técnica

que se baseia na ionização de moléculas e átomos, realizando de forma eficiente a
separação dos íons com base nas diferentes razões massa/carga (m/z), sendo m a massa
em u [massa atômica unificada, chamada também de Dalton (Da)] e z a carga formal.
Segundo Silverstein et al., (2007) Essa técnica não analisa átomos ou moléculas no estado
fundamental, apenas espécies ionizadas. Dessa forma, para a análise dos íons necessitase
a formação dos mesmos a partir de fontes de ionização, que devido aos avanços
tecnológicos tem evoluído constantemente buscando ampliar o campo de aplicação.
(HAM, 2008). A espectrometria de massas é uma técnica analítica com ampla aplicação
vista a sua alta sensibilidade e velocidade de análise. (SILVERSTEIN et al., 2007; DINIZ,
2011).

O LC acoplado à detecção MS permite análises mais precisas e pode revelar dados

que podem ser úteis na identificação de produtos de oxidação ou formas de equilíbrio dos
pigmentos que não apresentam absorbância a 520 nm. Além disso, a aplicação da
espectrometria de massa em tandem on-line (MS/MS) simplifica muito o procedimento,
tipicamente permitindo o estabelecimento da estrutura do pigmento através da
determinação da massa molecular e subsequente isolamento seletivo e fragmentação
direcionada dos íons de interesse.

Dentre os componentes que compõem o espectrômetro de massas, a fonte de

ionização e o analisador são partes com grande importância. Pois cada fonte de ionização
possui características de ionização e com isso, tipos específicos de compostos são
analisados. As diferentes formas de ionização juntamente com analisadores de massas são
o que determinam a aplicabilidade da MS. (GHISLAIN et al., 2012).

37
 Vera de Rosso et al., (2008) estudaram as antocianinas de acerola e açaí, duas
frutas tropicais conhecidas por seus compostos bioativos. Duas variedades de acerola in
natura e uma marca de polpa congelada de açaí foram analisadas por cromatografia
líquida de alto desempenho conectada a detectores de matriz de fotodiodo e
espectrometria de massa (HPLC-PDA-MS / MS). A polpa de açaí apresentou 282- 303
mg/100g de antocianina total, com predominância de cianidina-3-glucósido e cianidina-
3-rutinósido, em proporções médias de 13% e 87%, respectivamente. A composição das
duas variedades de acerola (Waldy Cati 30 e Olivier) foi semelhante, sendo a cianidina-
3-ramnosídeo (76-78%) a principal antocianina, seguida de pelargonidina-3-ramnosídeo
(12-15%). A variedade acerola (Waldy) mostrou um teor total de antocianinas de 6,5-7,6
mg/100 g, enquanto que 7,9-8,4. Foram encontradas mg/100g na variedade (Olivier).

Li et al., (2012) analisaram doze vegetais altamente pigmentados (vermelhos ou

roxos) de (cenouras, repolho, couve-flor, batatas, cebolas, espargos e berinjelas). Foram
investigados pelo conteúdo total de antocianinas e composições das antocianinas e
antocianidinas individuais pela UPLC e LC-DAD-ESI-MS, e suas atividades
antioxidantes por DPPH, FRAP (poder de antioxidante de redução férrica) e ORAC
(capacidade de absorção de radiação de oxigênio). Enquanto um total de 26 antocianinas
foram identificadas, as principais agliconas só se encontravam limitadas a 4
antocianidinas (cianidina, petunidina, pelargonidina e delfinidina). Os resultados deste
estudo são comparáveis e fornecem um método rápido e eficaz para a identificação e
quantificação de todas as principais antocianidinas e seus glicosídeos (antocianinas) e
como elas podem contribuir para a atividade antioxidante, portanto, informações
importantes no desenvolvimento de nutracêuticos ricos em antocianina e alimentos
funcionais.

Acevedo et al., (2012) estudaram a composição e concentração de antocianinas de

peles de uva. Foram analisadas para avaliar a variação fenotípica entre quatro variedades
de uvas pertencentes a 4 espécies diferentes: Vitis vinifera, Vitis amurensis, Vitis cinerea
e Vitis Xi champinii. A cromatografia líquida de alto desempenho acoplada à
espectrometria de massa (LC-MS) e a espectroscopia de RMN (LC-RMN) foram
utilizadas para separar e identificar a estrutura das antocianinas presentes nestas espécies.
A combinação de LC-MS e LC-NMR resultou na identificação de 33 antocianinas. Em
particular, identificaram-se novos isómeros cis de derivados de p-cumarico (petunidina,
peonidina e malvidina-3-(6-p-cumaril)-5-diglucosídeo). Em V. cinerea e V. vinifera, as

38
antocianinas foram derivados de monoglucosídeos, enquanto que em V. amurensis e V. X
champinii, identificaram-se ambos os derivados de mono e diglucosídeo. Os derivados de
Malvidina, delfiinidina e petunidina foram, respectivamente, os componentes mais
abundantes em V. cinerea e V. vinifera, V. amurensis e V. Xi champinii.

O pigmento do extrato de frutas é um tipo de corante natural para o processamento

de alimentos e possui potenciais valores médicos e comerciais. Este estudo centra-se na
análise e caracterização de antocianinas do pigmento de amoreira. As frutas de amoreira
frescas foram extraídas com o solvente de 95% de álcool / 0,1% de HC l (1: 1, relação) à
temperatura ambiente durante 4 h no escuro. Após o isolamento usando a coluna C-18, o
pigmento foi identificado com Espectroscopia UV-Visível, HPLC-PAD, LC-MS e 1
RMN-H1. Os resultados mostraram que as abundantes antocianinas no pigmento de
amoreiro são cianidina 3-O-rutinosido (60%) e cianidina 3 O-glucósido (38%). As
antocianinas menores (totalmente 2%) são pelargonidina 3-O-glucósido e pelargonidina
3-O-rutinosido (QIN et al., 2007).

39
4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Matéria prima

Os frutos de acerola (cerca de 10 Kg) foram adquiridos em feira da região

metropolitana de Belém. Em cada lote, os frutos foram selecionados livres de injúrias
mecânicas, no estágio maduro subjetivamente pela cor da casca (vermelho escuro), de
forma aleatória, e separadas para as caracterizações. Os frutos foram descascados,
separando-se manualmente a casca da polpa e sementes de acordo com a quantidade a ser
utilizada no dia da análise, os demais frutos foram conservados em embalagens de
plástico polietileno sob refrigeração para posterior análise. Em todas as análises foram
usadas apenas as cascas do fruto da acerola para a caracterização do material e extração.

4.2 Métodos

Este trabalho foi dividido em 3 etapas. A 1º etapa consistiu na caracterização da

casca do fruto da acerola, a 2º etapa consistiu em determinar as condições ótimas de
extração utilizando extração por agitação magnética acoplada ao banho termostático e a
3º etapa consistiu nos ensaios de particionamento conforme as figuras 5, 6 e 7
respectivamente.

40
Figura 5- Caracterização da matéria prima

41
Figura 6-

Planejamento experimental

42
Figura 7- Particionamento

43
4.2.1 Caracterização físico – química

4.2.1.1 Umidade

A umidade foi determinada segundo a metodologia da AOAC (2011), método nº

920.107.

4.2.1.2 Resíduo mineral fixo (cinzas)

As cinzas foram determinadas segundo o método nº 940.26 da AOAC (1997).

4.2.1.3 Proteínas totais

O teor de proteínas foi determinadas de acordo com o método nº 920.152 da

AOAC (1997).

4.2.1.4 Lipídios Totais

O teor de lipídios totais foi obtido por extração em Soxhlet de acordo com o
método nº 968.20 da AOAC (1997).

4.2.1.5 Sólidos solúveis (°Brix)

O teor de sólidos solúveis, expresso em ºbrix foi obtido pela leitura direta dos
graus Brix da amostra em refratômetro de bancada (QUIMIS, modelo Q7678) de acordo
com o método nº 932.12 da AOAC (1997).

44
 4.2.1.6 Acidez total titulável por volumetria potenciométrica

Este método é realizado em soluções escuras ou fortemente coloridas. Segundo

método nº 942.15B da AOAC (1997).

4.2.1.7 pH

O pH foi determinado através de leitura direta em potenciômetro, devidamente

calibrado com as soluções tampões pH 7,0 e 4,0 a 20°C segundo método nº 981.12 da
AOAC (1997).

4.2.1.8 Antocianinas totais (AT)

A quantificação de antocianinas totais foi realizada de acordo com o método

espectrofotométrico do pH diferencial, que utiliza solução de pH 1,0 e 4,5, conforme
descrito por (FULEKI e FRANCIS, 1968). A concentração final de antocianina foi
expressa em mg/100g de cianidina-3-glicosídeo. Com posterior leitura em
Espectrofotômetro UV-VIS (Pharmatec biotech-ultrospec 2000) em comprimentos de
onda de 510 e 700 nm, (branco: solução de pH).

C (mg/L) = [(Abs510nm-Abs700nm)pH1,0-(Abs510nm-Abs700nm)pH4,5].MM.FD.1000 (6)

(ε × l)

Onde C é igual a concentração de antocianinas presentes na amostra e a diferença

dos valores de absorbância em pH 1,0 e 4,5 é diretamente proporcional à concentração de
antocianinas.

MM = 449,2 g mol -1

FD= fator diluição

45
 ε = coeficiente de extinção molar: 26900 M -1 cm -1 ,

A concentração de antocianina expressa na fórmula 6 em (mg/L) é convertida para

concentração final de antocianina e foi expressa em mg/100g de cianidina-3-glucósido.

4.2.1.9 Cromatografia líquida (LC-MS)

As amostras da casca da acerola passaram pelo processo de liofilização. O

equipamento utilizado foi um liofilizador de bancada (Liotop, L-101), Após o
congelamento das cascas da acerola, foram pesadas 100g e dispostas em cada uma das 3
bandejas de inox no interior da câmara de secagem do liofilizador, em operação por um
período de 24 h, para a leitura no espectrômetro de massas.

A análise foi conduzida no Laboratório de espectrometria locado no PPGQ/UFPA.

As análises via LC-MS foram realizadas em um espectrômetro de massas XEVO

G2-SToF (Waters®) com fonte de eletrospray (ESI).

Uma alíquota de 1 mg da amostra foi solubilizada em 1 mL de H2O:ACN 2:8

(v:v), em seguida a solução obtida foi filtrada em filtro de seringa qualitativo. Para a
separação cromatográfica, utilizou-se uma composição binária de água (A)/acetonitrila
(B) como fase móvel acidificada (0,1% de ácido fórmico) e uma coluna de fase reversa
octadecil (50 mm x 2,1 mm x 1,7 µm) Acquity BECH-Waters. A análise consistiu na
eluição de 5µL da amostra em modo gradiente linear na faixa de composição de fase
móvel 5-95% de durante 10 minutos sob uma temperatura de 40° C, em fluxo de 0,3
mL/min.

A ionização da amostra foi realizada em modo positivo (ES+) em ampla faixa de

m/z (50-1200 Da) com registro de 0,1 segundo. A temperatura da fonte foi estabelecida
em 150° C, o fluxo de gás no cone de 20 L/h e o gás de dessolvatação foi estabelecido
em 550 L/h à temperatura de 250 °C. As voltagens do capilar e do cone foram fixadas,
respectivamente, em 2 kV e 40 V.

A aquisição dos dados por LC-MS da casca da acerola liofilizada de Malpighia

emarginata foram realizadas utilizando-se a interface do software Masslynx versão 4.1.

4.2.2 Extração

46
 ‘Os extratos de antocianinas da casca da acerola foram obtido pelo processo de
extração por agitação magnética. As condições de operação foram estudadas conforme
planeamento experimental. Foi utilizada a quantidade de 4g da casca da acerola para 16g
da solução alcoólica, pesados em balança analítica (QUIMIS, Q-500L210C).

Após a obtenção dos extratos as amostras foram transferidas para um balão de

fundo redondo coberto com papel alumínio acoplado ao rotaevaporador, (Heidolph,
Laborota 4000) ligado ao banho termostático com controle de temperatura de 35ºC até a
total evaporação do etanol do extrato, que foi conferido por balanço de massa.

4.2.2.1 Planejamento experimental

Os parâmetros do processo foram estudados através de um delineamento

composto central rotacional (DCCR) 23 , incluindo 6 pontos axiais (PA) e 5 repetições do
ponto central (PC), totalizando 19 ensaios, onde a constituição deste planejamento foram
realizados após análise prática das variáveis independentes diluição etanol/água 79%
(v/v), 50% (v/v), 21% (v/v), puro (v/v), tempo (4,8’, 15’, 30’, 45’, 55,2’) e temperatura
(15ºC - 42 °C). As variáveis dependentes foram as concentrações de antocianinas. O valor
de α foi calculado em função do número de variáveis independentes (n=3) através da
equação 07.
1
∝= (2n )4 (7)

Os resultados foram analisados através da Metodologia de Superfície de Resposta

com auxílio do software Statistica, versão 13.1. Na tabela 4 está descrito o planejamento
experimental e a variável de resposta são as análises de antocianinas totais.

47
Tabela 4- planejamento experimental

Ensaios Tempo (min) Temperatura(ºC) DILUIÇÃO ( Etanol/H20 )

1 2 15 21
2 5 15 21
3 2 35 21
4 5 35 21
5 2 15 79
6 5 15 79
7 2 35 79
8 5 35 79
9 0,98 25 50
10 6,02 25 50
11 3,5 8,2 50
12 3,5 41,8 50
13 3,5 25 98,72
14 3,5 25 H2O
15 3,5 25 50
16 3,5 25 50
17 3,5 25 50
18 3,5 25 50
19 3,5 25 50

4.2.2.2 Extração por agitação magnética

As amostras com 4g da casca da acerola foi macerada em gral e pistilo, e pesado

na célula encamisada com 16g da solução alcoólica de acordo com o planejamento
previamente estudado, foi mantido sob agitação magnética a 199 rpm, ligadas ao banho
termostático nos tempos de 4,8’, 15’, 30’, 45’ e 55,2’ minutos com diluições de 99,72%
(v/v), 79% (v/v), 50% (v/v), 21% (v/v) (Etanol/ H20). Após essas condições a amostra foi
filtrada a vácuo utilizando papel filtro, funil de porcelana e kitassato. O extrato foi
armazenado em frasco âmbar para posterior procedimento de particionamento no SAB,
análises de AT, AA (Vitamina C), pH , AAT, ºBrix, Açúcares totais e Cor.

48
4.2.3 Dados de equilíbrio dos sistemas etanol+Li2SO4+H2O e etanol+(NH4)2SO4+ H2O
(Sistema em branco)

Como a proposta desse trabalho consiste em estudar a partição das antocianinas

em sistemas etanol+Li2SO4+ H2O e etanol+(NH4)2SO4+ H2O, foram realizados um estudo
prévio de tais sistemas, que consistiam nos sistemas em branco foram coletados dados de
equilíbrio para o sistema etanol+Li2SO4+ H2O nas temperaturas 25ºC e 35ºC haja visto
que não existiam na literatura. E para o sistema etanol+(NH4)2SO4+água, foram
reproduzidos as 3 linhas de amarrações dos sistemas a 25ºC e 35ºC com os maiores
coeficiente de distribuição da literatura (Lago, 2017; Gama, 2018) para validar a
metodologia utilizados neste trabalho.

A composição dos componentes de cada LA do Sistema Etanol + Sulfato de

Amônio + Água a 25°C e 35ºC estão representadas nas Tabelas 5 e 6, respectivamente,
nas quais os dados estão expressos em frações mássicas.

Tabela 5- Frações mássicas das linhas de amarrações do Sistema Etanol + Sulfato de

Amônio + Água a 25°C

Fase Superior Fase Inferior e

LA wSAL wETOH wH2O wSAL wETOH wH2O

1 0,0404 0,4780 0,4816 0,3498 0,0711 0,5792

2 0,0300 0,5164 0,4536 0,3719 0,0629 0,5652

3 0,0448 0,4639 0,4913 0,3357 0,0768 0,5876

A Tabela 6 apresenta a composição dos componentes de cada LA do Sistema Etanol +

Sulfato de Amônio + Água a 35°C, na qual os dados estão expressos em frações mássicas.

49
Tabela 6- Frações mássicas das linhas de amarrações do Sistema Etanol + Sulfato de
Amônio + Água a 35°C

Fase Superior Fase Inferior r

LA wSAL wETOH wH2O wSAL wETOH wH2O

1 0,0404 0,4780 0,4816 0,3498 0,0711 0,5792

2 0,0300 0,5164 0,4536 0,3719 0,0629 0,5652

3 0,0448 0,4639 0,4913 0,3357 0,0768 0,5876

4.2.3.1 Curva Binodal (Curva de Solubilidade)

Primeiramente foram preparadas as soluções aquosas estoque de sal, no ponto de

saturação. A curva binodal do sistema sulfato de amônio (NH4)2SO4, etanol e água foram
preparados por um método de gotejamento até a turvação tal como descrito por (LI et al.,
2009) realizado em banho termostático em temperatura constante e pré-determinada pelo
planejamento experimental, adicionou-se uma solução aquosa de sulfato de amônio
(NH4)2SO4 gota a gota com auxílio de seringas ao etanol na célula encamisada. O
gotejamento ocorreu até o turvamento da mistura, então foi anotada a massa da solução
salina que causou a turbidez.

O ponto seguinte de coleta foi obtido ao ser adicionado água destilada gota a gota
até o desaparecimento da turvação, anotou-se a massa utilizada da mesma. E o posterior
gotejamento com solução salina foi repetido até que se adquiram pontos necessários para
a construção da fase superior da curva de solubilidade (curva binodal). O mesmo
procedimento foi repetido para construção da parte inferior da curva de solubilidade, que
apresenta uma maior concentração de sal, onde foi gotejada etanol na solução salina.

As frações mássicas de etanol, Li2SO4 e água (w1, w2 e w3 respectivamente) foram

obtidas e a curva de solubilidade foi plotada para várias concentrações de álcool e sulfato
de Lítio (Li2SO4). A seguir os dados da curva de solubilidade foram correlacionados
matematicamente, obtendo-se 2 equações, referentes à fase superior (equação 08) e
inferior (equação 09).
50
 w1S = ⨍(WS) (8)
2

w1I = ⨍(WI2 )
(9)

4.2.3.2 Dados de equilíbrio

A determinação dos dados de equilíbrio constituiu em, após delimitar a região de

miscibilidade parcial, os componentes (w1, w2 e w3) foram pesados e preparados a solução
(composição global) com concentrações dentro da região de duas fases. As soluções
foram preparadas em tubos de ensaios, homogeneizadas com o uso de agitador vórtex
(Vortex, QL-901) e em seguida transferidas para células encamisadas acopladas ao banho
termostático de modo que toda solução estivesse submersa para garantir que a
temperatura do sistema se mantivesse constante. E em seguida mantidos em repouso
durante horas nas temperaturas estabelecidas, para que acorra a separação das fases. Após
alcançar o equilíbrio termodinâmico, amostras de ambas as fases foram coletadas e os
componentes do sistema foram quantificados utilizando a metodologia do método
indireto que consiste na quantificação dos componentes em cada fase mediante o uso da
curva de solubilidade (equações 08-09) equação de calibração (equação 11) e a equação
da soma das frações mássicas (equação 10).

wPEG + wSAL + wÁGUA = 1 (10)

A qualidade dos dados de equilíbrio foram avaliados com o uso das equações de
Othmer–Tobias e Hand (equações 01 e 02 respectivamente). E o coeficiente de partição
do PEG foram calculado conforme equação 03.

4.3.2.3 Curva de Calibração

Para quantificar as composições das fases em equilíbrio foram construídas curvas

de calibração a partir de soluções preparadas em concentrações (ponto de mistura) sobre
a curva binodal e realizada as respectivas medidas de condutividade. Os dados obtidos

51
foram correlacionados matematicamente de modo que se obtenha um coeficiente de
correlação (R2 ) próximo a unidade conforme equação 05.

wi = ⨍(CONDUT) (11)
Sendo i = concentração de etanol ou sal.

4.2.4 Partição das antocianinas do extrato no SAB - etanol+(NH4)2SO4+H2O

O experimento de partição de antocianinas constitui em adicionar o extrato, com

a melhor resposta quanto a quantidade de antocianinas obtida no item 4.2.2, a solução na
célula cuja concentração corresponde a linha de amarração com maior coeficiente de
distribuição do item 4.2.3.

A mistura foi agitada num agitador tipo vórtex até as duas fases estarem
completamente homogeneizadas, em seguida ficou em repouso por um tempo de 3
minutos. Após esse tempo analisou-se as concentrações de extrato de antocianinas da
casca da acerola nas fases superior e inferior (figura 8), bem como foi determinado a
atividade antioxidante, pH, ºBRIX, análise de cor e vitamina C de cada fase. Os resíduos
acumulados na interface das duas fases foram descartados em recipiente apropriados.

Figura 8- Extrato da partição das antocianinas no SAB

Fonte: Arquivo pessoal

4.2.4.1 Determinação de antocianinas totais (AT)

52
 A quantificação de antocianinas totais foi realizada de acordo com o método
espectrofotométrico do pH diferencial, descrito no item 4.2.1.8.

4.2.4.2 Atividade antioxidante in vitro

-Método ABTS A capacidade antioxidante do extrato particionado foi

determinada pelo ensaio do cátion radical ABTS•+, segundo metodologia da Rufino et al.
(2007b). Com adaptações/modificações feitas para o preparo do radical ABTS•+, onde
utilizou-se a metodologia descrita por Re et al., (1999). Inicialmente, foi formado o
radical ABTS•+, a partir da reação de 14 mM de ABTS com 4,9 mM de persulfato de
potássio (1:1 v/v), os quais foram incubados a temperatura ambiente e na ausência de luz,
por 16 horas. Transcorrido esse tempo, a solução foi diluída em etanol até a obtenção de
uma solução com absorbância de 0,700 ± 0,02. Em seguida, diluiu-se 1ml desta mistura
em etanol até obter uma absorbância de 0,70 nm ± 0,05 nm a 734 nm. Um volume de 2ml
da solução radical ABTS•+ foi adicionado a 20µl de amostra. A leitura absorbância da
mistura foi realizada após 6 minutos. O branco utilizado para zerar o espectrofotômetro
foi o etanol. Para padronização dos resultados, o trolox foi utilizado como padrão e os
resultados de atividade antioxidante foram expressos em equivalente de Trolox (μM
Trolox equivalente por g de polpa). Para realizar as análises, foram adicionados em tubos
de ensaio a solução contendo o radical ABTS•+ e o extrato diluído em etanol. A
absorbância foi monitorada em espectrofotômetro UV-visível (Pharmatec biotech-
ultrospec 2000) a 750 nm, após 15 minutos de reação.

-Método DPPH A capacidade antioxidante pelo método DPPH (2,2-Difenil-1-

picril-hidrazil) foi determinada de acordo com a determinação da atividade antioxidante
total em frutas pela captura do radical DPPH (baseadas em adaptações/modificações
feitas nos laboratórios da Embrapa Agroindústria Tropical. (RUFINO et al., 2007).

4.2.4.3 Ácido ascórbico- vitamina C

Para a determinação do teor de vitamina C utilizou-se o método padrão

Titulométrico AOAC (1984), método de Tillmans modificado por Benassie Antunes

53
(1988), que utilizaram solução de ácido oxálico como solvente, em substituição ao ácido
metafosfórico. As amostras foram retiradas do congelador e deixadas em temperatura
ambiente para posterior análises do extrato e do material particionado, de acordo com os
procedimentos descritos nos subitens 4.2.2 e 4.2.4. O resultado foi expresso em mg de
ácido ascórbico por 100 g da amostra do extrato particionado da casca da acerola.

4.2.4.4 Cor

A análise foi conduzida no Laboratório de Corantes (LabCor), locado na

FEQ/UFPA em câmera escura com controle de luminosidade. A avaliação colorimétrica
foi realizada utilizando colorímetro Color Reader CR– 10 (Konica Minolta), operando no
sistema CIELAB. Os valores de L* (luminosidade), a* (componente verde-vermelho) e
b* (componente amarelo-azul) foram obtidos diretamente do calorímetro e utilizados para
cálculo da tonalidade e saturação (croma).

(C*=(a2+b2)0,5) (21)

Para determinar a diferença total de cor entre as três coordenadas é utilizada a

equação 22:

ΔE* = [ΔL*2 +Δa*2 +Δb*2 ]0,5 (22)

Onde:

ΔL* = diferença em mais claro e escuro (+ = mais claro, - = mais escuro)

Δa* = diferença em vermelho e verde (+ = mais vermelho, - = mais verde)

Δb* = diferença em amarelo e azul (+ = mais amarelo, - = mais azul)

ΔE* = diferença total de cor

4.2.4.5 Açúcares totais – fenol / sulfúrico (at)

O teor total de açúcar das amostras do extrato foi determinado pelo método de
Dubois usando fenol e ácido sulfúrico (Dubois, M et al., 1956). Diluiu-se uma amostra

54
do extrato particionado de ambas as fases superior e inferior a 1/100 com água destilada
e adicionou-se 0,2 mL de solução de fenol a 5% a 0,2 mL da amostra diluída, seguindo-
se a adição de 1 mL de ácido sulfúrico. Em seguida a solução foi homogeneizada e
deixada à temperatura ambiente pôr 30 minutos. A absorbância da solução foi registada
a 490 nm. A calibração foi realizada com glicose como padrão.

4.2.4.6 Tratamento estatístico

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três repetições Os

resultados foram submetidos a análise de variância e teste de Tukey a 5% de
probabilidade, utilizando o software Statistica, versão 13.1, para Windows.

55
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Caracterização fisico–química e Antocianinas totais

As características físico-químicas e concentração de antocianinas totais da casca

da acerola utilizada neste trabalho estão apresentadas na tabela 07.

Tabela 7- Caracterização físico- químicas da acerola.

Análise Este trabalho*-

Casca acerola

Cinzas 0,0806±0,03

Lipídios % 0,0043±0,002

Proteínas % 0,74±0,65

pH 3,45±0,04

Acidez titulável (meqNaOH/100g) 16,97±0,24

Umidade (%) 92,56%±0,1

Antocianinas (mg.100 g) 41,25±0,1

*valores expressos em base úmida

*valores médios (média ± desvio-padrão) de triplicatas

A característica da cor vermelha da casca da acerola é um dos mais importantes

indicadores de maturação da acerola e qualidade comestível, isso se deve as
concentrações de antocianinas presente no fruto (Tabela 7). Pode ser observado que os
valores de antocianinas totais obtidos nesse trabalho foram 41,25 mg.100g-1. Quanto
maior o teor de antocianinas, melhor a aceitação do produto por parte do consumidor.
Aquino et al (2011) encontraram valores próximos ao encontrados nesse trabalho, para
pH, umidade e antocianinas totais para acerola in natura. Soares et al., (2017) também
obtiveram resultados semelhantes dos parâmetros avaliados de pH e proteínas para a
polpa de acerola.

56
5.1.1 Cromatografia líquida (LC-MS)

O cromatograma e o espectro de íons totais da casca da acerola liofilizada. obtidos

nas análises de espectrometria de massas são apresentados nas figuras 9 e 10 .

Figura 9- Cromatograma de íons totais para as antocianinas presentes na amostra da casca

da acerola liofilizada.

57
Figura 10- Espectros de íons totais das antocianinas presentes na amostra da casca da
acerola liofilizada.

Nas figuras 9 e 10 pode ser observado que a identificação das substancias

presentes na amostra foi realizada pela ordem de eluição e pelos tempos de retenção
levada em consideração a massa de alta resolução de 104. Os cromatogramas obtidos
demonstraram que o perfil antociânico da amostra da casca de acerola liofilizada
apresentaram de três a cinco picos comuns entre as massas encontradas na literatura. Após
a ionização da amostra foram observadas cinco agliconas identificadas como cianidina,
peonidina, petunidina, delfinidina e pelargonidina. As amostras não passaram pelo
processo de fragmentação para uma possível afirmação das antocianinas presentes nas

58
amostras analisadas, no entanto ao comparar os cromatogramas das antocianinas e das
antocianidinas e, avaliando os tempos de retenção, é possível supor que há presença de
antocianinas com diferentes graus de glicosilação, e que as agliconas identificadas,
cianidina, delfinidina e pelargonidina, encontravam-se com diferentes proporções nos
espectros de ionização e com massas de melhor resolução, de 104 .

Alguns autores como Brito et al., (2007) encontraram 2 tipos de antocianinas:

cianidina-3-ramnosídeo e pelargonidina-3-ramnosídeo e Vera de Rosso et al., (2008)
encontraram as mesmas antocianinas na acerola mais 2 antocianinas: Cianidina,
Cianidina- 3-ramnosídeo, Pelargonidina-3-ramnosídeo e Pelargonidina.

5.2. Extração de antocianinas

Na tabela 8 são apresentados os resultados do planejamento experimental das

extrações por agitação magnética seguida de evaporação.

59
Tabela 8- Antocianinas totais expressas em equivalente da antocianina principal
cianidina-3-glucosídeo para as extrações por agitação magnética seguida de
rotaevaporador.

Ensaio Diluição Concentração de antocianina em mg / 100g

EtOH/H2O
1 21% 21,85 ± 3,40
2 21% 16,36 ± 1,29
3 21% 16,55 ± 3,93
4 21% 16,96 ± 1,34
5 79% 16,19 ± 0,36
6 79% 11,9 ± 2,12
7 79% 11,38 ± 1,80
8 79% 13,32 ± 4,04
9 50% 12,30 ± 6,39
10 50% 8,01 ± 0,34
11 50% 14,23 ± 0,48
12 50% 16,68 ± 1,68
13 98,72% -
14 50% 14,12 ± 0,40
15 50% 11,01 ± 6,70
16 50% -
17 50% -
18 50% -
19 50% -
*valores expressos em base úmida *valores médios (média ± desvio-padrão) de triplicatas

Na tabela 8, observamos que embora os experimentos apresentassem a mesma

condição de diluição, tempo e temperatura de extração, o tempo gasto para concentrar
cada amostra no rotaevaporador diferiram entre si causando possivelmente degradação
das antocianinas. O uso do rotaevaporador foi aplicado para retirar as frações de etanol
do extrato, com o intuito de aplicar no SAB PEG/(NH4)2SO4, esses resultados mostraram
que a utilização do calor (35ºC) no processo de evaporação do etanol ocasionaram perdas
significativas das concentrações de antocianinas do extrato, com isso houve uma mudança

60
de sistema para o SAB etanol/(NH4)2SO4 pois com essa nova proposta não houve a
necessidade de retirar o etanol do extrato obtido.

Na tabela 9, são apresentadas as respostas do planejamento experimental para a

extração por agitação magnética sem o uso do rotaevaporador.

Tabela 9- Antocianinas totais expressas em equivalente da antocianina principal

cianidina-3-glucosídeo para as extrações por agitação magnética sem evaporação.

Ensaios Tempo Temperatura Diluição Concentração de

(min) (ºC) (EtOH/H20) antocianina em mg/100g
1 15 15 21 22,43±0,19
2 45 15 21 28,25±0,26
3 15 35 21 26,32±0,51
4 45 35 21 45,26±0,22
5 15 15 79 34,83±0,15
6 45 15 79 27,39±0,24
7 15 35 79 33,54±0,39
8 45 35 79 48,04±0,47
9 4,8 25 50 52,32±0,38
10 55,2 25 50 49,61±0,27
11 30 8,2 50 48,32±0,45
12 30 41,2 50 53,26±0,57
13 30 25 98,72 57,17±0,50
14 31,37±0,04
30 25 0
15 30 25 50 33,10±0,55
16 48,57±0,31
30 25 50
17 46,19±0,15
30 25 50
18 48,73±0,15
30 25 50
19 46,33±0,04
30 25 50
*valores expressos em base úmida **valores médios (média ± desvio-padrão) de triplicatas

Na tabela 9 pode ser constatado um aumento significativo no teor de antocianinas

do planejamento experimental das amostras dos extratos obtidos a partir do processo de

61
extração por agitação magnética acoplada ao banho termostático com controle de
temperatura, quando comparado com os resultados apresentados na tabela 8, a qual se fez
uso de evaporação para retirada das frações de etanol do extrato.

Em relação as diluições utilizadas no planejamento, as concentrações de

antocianinas ficaram entre 22,43 e 57,17 mg/100g–1 , e os extratos com maiores frações
de etanol, as diluições de 50 e 98,72% apresentaram os maiores teores de antocianinas.
Também na tabela 9 pode ser verificado que o ensaio 13, resultou na obtenção de maior
teor de antocianinas extraídos 57,17 mg/100g. Desta forma, esse foi o extrato utilizado
nas etapas posteriores desse trabalho.

5.3 Sistema etanol+Li2SO4+H2O

Na figura 11, são apresentados dados de solubilidade do sistema etanol+Li2SO4 +

H2O 25ºC.

Figura 11- Sistema sistema etanol+Li2SO4 + H2O

1,00 Curva binodal

Concentração do álcool

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20
Concentração do sal

Fonte: Arquivo pessoal

Também na figura 11 pode ser observado que para este sistema não foi
caracterizado uma região de duas fases. Foi observado que a transição de fases (ponto de
turvação) era instável, ou seja, o turvamento desaparecia após alguns minutos de repouso,

62
ou a mistura voltava ficar homogênea ou ocorria precipitação do sal. Tal comportamento
pode ter sido ocasionado pela natureza do sal utilizado em relação ao álcool.

Sendo assim, não havendo a região de miscibilidade parcial, não foi possível obter
os dados de equilíbrio e calcular o comprimento da linha de amarração (CLA) nem a sua
inclinação (ILA), que são parâmetros termodinâmicos utilizados para medir as
propriedades intensivas entre as fases.

5.3.1 Sistema etanol+(NH4)2SO4+H2O

Os dados de equilíbrio liquido- líquido do sistema etanol/sulfato de amônia a 25ºC

e 35ºC reproduzidos da literatura são apresentados na tabela 10, respectivamente, com os
dados reproduzidos neste trabalhos.

Tabela 10- Frações mássicas e densidade das linhas de amarrações do Sistema etanol +
Sulfato de amônio + água a 25ºC e 35°C

Massa específica (g/cm3)*** Este trabalho

25ºC

LA 1 FS FI FS FI

0,919±0,002 1,183±0,000 0,9203±0,001 1,1956±0,008

35ºC

LA 2 FS FI FS FI

0,918±0,000 1,164±0,000 0,9281±0,007 1,1692±0,003

*valores médios (média ± desvio-padrão) de triplicatas **FS: fase superior; FI: fase inferior*** Literatura

5.3.2 Partição das LA do sistema Etanol/(NH4)2SO4/água

Os dados de ácido ascórbico (AA), ABTS, antocianinas totais (AT), ºBrix, pH,
açúcares totais, obtidos após particionamento do extrato no SAB são apresentados na
tabela 11, 12 e 13.

63
Tabela 11- Resultados de ácido ascórbico, ABTS e antocianinas totais

Análises AA ABTS AT
mg/100g µM Trolox/g mg/100g

25ºC

LA 1 FS 2381,00±0,0a 2136,76±0,04b 73,08 ±0,55a

FI 1445,61±0,0b 1263,43±0,04c 9,53±0,00c

Extrato particionado
(FS/FI) 35ºC

LA 2 FS 2551,08±0,0a 6122,45±0,07a 63,95±0,59 b

FI 1275,54±0,0b 219,62±0,13d 6,36±0,03d

*valores expressos em base úmida

**valores com letras diferentes na mesma coluna apresentam diferença significativa (p≤0,05).

***valores médios (média ± desvio-padrão) de triplicatas;

FS: fase superior; FI: fase inferior.; AA: ácido ascórbico; AT: antocianinas totais;

64
 Conforme os resultados de ácido ascórbico (AA) mostrados na tabela 11 para a
fase superior, que contém majoritariamente antocianinas, álcool e água a quantidade de
AA encontrada foi de 2551,08 mg/100g no sistema à 35ºC, e para a fase inferior, que
contém majoritariamente, água e o sal sulfato de amônio foi obtido 1275,54 mg/100g, a
metade da quantidade da fase superior. Podemos considerar que este sistema SAB
(etanol+(NH4)2SO4+H2O) preservou o AA sem interferir na concentração de
antocianinas.

A quantidade de AA obtidos neste trabalho para as fases inferiores estão próximas

dos encontrados por Freire et al. (2013), que obtiveram 1457,69 mg/100g para acerola in
natura, esses autores também averiguaram a atividade antioxidante de outras frutas (caju,
goiaba e morango) e observaram que a acerola apresentou os melhores resultados, sendo,
assim, a de maior atividade antioxidante dentre as demais amostras analisadas.

Também na tabela 11 pode ser observado que com o aumento da temperatura de

25ºC para 35ºC, a quantidade de antocianinas totais variou de 73,08±0,55 (mg/100g) para
63,95 ±0,59 e de 9,53±0,0 (mg/100g) para 6,36±0,03 (mg/100g) nas fases superior e
inferior respectivamente, indicando que a variação de temperatura apresentou discreto
decréscimo no conteúdo de antocianinas totais em ambas as fases. Indicando assim que o
SAB proposto conseguiu particionar com eficiência as antocianinas totais do extrato, se
comparado com o conteúdo de AT encontrado por Batista et al (2012), para alguns
cultivares de acerola, para AT.

Uma das principais características da acerola é seu elevado teor de ácido ascórbico
e antocianinas totais que atuam como poderosos antioxidantes. Para preservar essa
propriedade após os processos de extração, foram avaliadas as amostras dos extratos
particionados da casca da acerola. A atividade antioxidante das amostras foi expressa em
função da concentração de Trolox (µM Trolox/g de amostra). Neste trabalho, foi possível
observar que o extrato da casca da acerola não só preservou sua capacidade antioxidante,
mas também apresentou uma taxa de desempenho de aproximadamente 6122,45±0,07
(µM Trolox/g de amostra) para a FS do sistema á 35ºC correspondendo a
aproximadamente 3 vezes a capacidade de antioxidante presente no extrato particionado
às FS do sistema com temperatura de 25ºC 2136,76±0,04(µM Trolox/g de amostra).

Ao elevar a temperatura do sistema de 25º para 35º C é possível perceber um

decréscimo na sua atividade antioxidante de 1263,42±0,04 (µM Trolox/g de amostra)

65
para 219,62±0,13 (µM Trolox/g de amostra) na fase inferior do sistema, entretanto
podemos observar que o comportamento inverso aconteceu com a fase superior que
triplicou, conforme mostrado na tabela 11.

A análise de DPPH foi realizadas para nos ensaios LA1 e LA2 e foi observado
que a análise de ABTS refletiu melhor o conteúdo de atividade antioxidante para a casca
da acerola, pois na realização da análise de DPPH, ao levar as amostras para serem feitas
as leituras no espectrofotômetro as mesmas apresentaram-se instáveis, variando
bruscamente a sua absorbância, impossibilitando a obtenção de dados para esta análise.

Lima, (2008) observou que o método DPPH apresenta vantagens quando a

substância em estudo é mais solúvel em solventes orgânicos. Possivelmente a
instabilidade das respostas na leitura de absorbância deveu-se ao fato de que tanto as
antocianinas como a forma radical não-reagida de DPPH absorvem na mesma faixa
visível, e o método espectroscópico é baseado nas medidas de intensidade de cor em 517
nm. Com isso não foi possível obter os resultados da atividade antioxidante total pelo
método DPPH, verificando assim que esta metodologia não se aplica para a amostra em
questão.

66
 Tabela 12- Análises realizadas nas LA2 dos sistemas de 25ºC e 35ºC

LA ºBRIX pH Açúcares Ketanol=FS/FI* KAT KAA Kat E%AA E%AT Eat

totais

25ºC

FS 20,00±0,0d 4,52±0,03 a 58,22±0,32a 8,20 7,67 1,78 1,63 58,11 85,67 56,00

LA1 FI 37,27±0,06a 4,01±0,01b 35,66±0,28d

35ºC

FS 24,83±0,47c 4,48±0,26a 57,52±0,09b 8,93 10,05 2,0 1,43 59,48 88,06 51,22

LA2 FI 36,37±0,47b 4,09±0,08b 40,21±0,16c

*valores expressos em base úmida; *valores com letras diferentes na mesma coluna apresentam diferença significativa (p≤0,05).; *valores médios (média ± desvio-padrão) de
triplicatas.; dados da literatura.; FS: fase superior FI: fase inferior.; AA: ácido ascórbico; AT: antocianinas totais; at: Açúcares totais *K: coeficiente de partição; E%: eficiência
de extração

67
 O pH manteve-se entre 4,01 a 4,52. É desejável para antocianinas pH< 7 para
manter-se em meio ácido haja visto que o pH alto >7 o meio estará básico causando a
degradação das antocianinas. Com isso a escolha do pH é muito importante uma vez que
a estrutura química das antocianinas varia com o valor do pH da solução (HUA et al.,
2013). De acordo com os ensaios de (ALMEIDA H, 2016), onde se variou o pH de 3,0 a
5,5, quanto maior o pH maior foi o rendimento da recuperação da antocianina na fase
superior em relação a fase inferior.

Na tabela 12 mostra que com o aumento da temperatura aumentou o coeficiente

de partição (k) do etanol no sistema em branco reportados na literatura, isso refletiu no
coeficiente de partição das AT e AA que apresentou o mesmo comportamento, ou seja o
coeficiente de partição das AT e do AA aumentou com o aumento da temperatura do
sistema. Esse comportamento é comprovado com os valores da eficiência de extração,
que também mostraram que o sistema etanol+ sulfato de amônio+ água tem uma
eficiência de extração de AT maior que 88,06 % na temperatura de 35ºC e uma eficiência
de extração de AA de 59,48% à 35ºC. Tal comportamento foi também observado por Wu
et al., (2011) para o mesmo sistema e na temperatura de 35ºC obtiveram melhor
coeficiente de partição (K) nestas condições. Um comportamento inverso foi observado
para açúcares totais (at) que mostraram maior coeficiente de partição (1,63) para o sistema
com menor temperatura (25ºC), esse mesmo comportamento foi observado para
eficiência de extração (Eat) 56%.

Os resultados de sólidos solúveis totais (ºBrix) aumentaram nas fases superiores

(de 20,00±0,0 para 24,83±0,47) e decresceram nas fases inferiores (de 37,27±0,06 para
36,37±0,47) de ambas as temperaturas, conforme mostrado na tabela 12.

Na tabela 13 estão os resultados das análises de cor que foram realizadas para os
sistemas das LA1 e LA2, tendo o extrato como branco.

68
Tabela 13-Resultados da análise de cor

LA L* a* b* a*/ b* ∆E* C*

25ºC

FS 28,13d 4,23a 12,43a 0,34a 9,23c 13,14a

LA1 FI 34,57b -0,67c 4,77c -0,14c 9,40c 4,81c

35ºC

FS 33,20c 0,90b 7,93b 0,11b 7,45b 7,99b

LA2 FI 37,73a -0,80c 4,77c -0,14c 10,43a 4,84c

*valores expressos em base úmida

*letras iguais na mesma coluna indicam que não houve diferença significativa

Para estudar sistematicamente a qualidade da cor do extrato particionado da casca

da acerola que tem considerável potencial em antocianinas, foi utilizado o sistema CIE
L* a * b * (Comissão Internacional de Iluminação, Viena) expostos na tabela 14. Podemos
observar que os valores de a* para o sistema de 25ºC aumentaram de maneira significativa
na FS (4,23) onde tem uma maior concentração de antocianinas (conforme mostrado na
tabela 12), em relação à fase inferior de ambos os sistemas (-0,67 e -0,80) em decorrência
da menor concentração das antocianinas, tendendo para a cor verde, de acordo com o
significado geométrico das coordenadas L* a * b *.Nos resultados onde os valores de a*
se apresentaram negativos (-0,67 e -0,80), teve como consequência, os valores de L*
aumentados nas FI de ambos os sistemas (34,57 e 37,73). A fase superior do sistema a
25ºC apresentou cor mais escura (L*=28,13), e a fase inferior do sistema de 35ºC, a mais
clara (L*=37,73).

Comparando-se os resultados da avaliação cromática com a quantificação das

antocianinas, confirma-se a importância das coordenadas de cromaticidade a* e b* no
estudo da avaliação do comportamento de pigmentos naturais, visto que estes parâmetros
estão diretamente relacionados aos teores antocianinas totais presentes na casca da
acerola. Maiores decréscimos foram observados nos valores de a* dos extratos das fases
inferior de ambos os sistemas, que reafirmam as maiores reduções nos teores de
antocianinas totais desses frutos discutidos anteriormente.

69
 Em relação ao ΔE*, diferença total de cor, o sistema de 35ºC, apresentou uma
maior diferença de cor com valores de 7,45 e 10,43 das fases superior e inferior
respectivamente, o que pode ser atribuído a uma maior reação oxidação de compostos
fenólicos responsáveis pela coloração, como as antocianinas.

Com relação ao croma (C*), observaram-se para o sistema de 25ºC, valores

variando de 4,81 até 13,14 (fase inferior e superior, respectivamente), indicando que a
fase inferior apresenta uma coloração mais opaca, enquanto a fase superior mostra uma
cor mais viva.

70
6 CONCLUSÃO

O ensaio de extração com diluição de 98,72% etanol/H2O da extração por

agitação magnética acoplado ao banho termostático (ensaio 13) obteve maiores
concentrações de antocianinas totais de 57,04±0,36 (mg/100g). Este extrato foi
particionado no SAB etanol+ sulfato de amônio+ água à temperatura de 25 e 35ºC, e foi
observado que com o aumento da temperatura, aumentou o coeficiente de partição (K)
das antocianinas. Este resultado foi comprovado com os valores da eficiência de extração,
que também mostraram que o sistema etanol+ sulfato de amônio+ água tem uma
eficiência de extração de AT maior que 88,06 % e uma eficiência de extração de AA de
59,48% ambos na temperatura de 35ºC.

Após o particionamento foi observado que a atividade antioxidante, em ambas as

fases se mostraram elevadas, concluindo que o SAB além de particionar o AA e AT
preserva a sua capacidade antioxidante e também apresentou uma taxa de desempenho de
aproximadamente 6122,45±0,07 (µM Trolox/g de amostra) para a FS do sistema á 35ºC
correspondendo a aproximadamente 3 vezes a capacidade de antioxidante presente no
extrato particionado às FS do sistema com temperatura de 25ºC 2136,76±0,04(µM
Trolox/g de amostra).

Em relação a cor foi verificado que os valores de a* para o sistema de 25ºC

aumentaram de maneira significativa na FS (4,23) onde tem uma maior concentração de
antocianinas em relação à fase inferior de ambos os sistemas (-0,67 e -0,80) em
decorrência da menor concentração das antocianinas.

As amostras da casca de acerolas avaliadas podem ser consideradas fonte de

compostos bioativos, como ácido ascórbico, antocianinas extraíveis e atividade
antioxidante, sendo recomendado seu consumo, visando à manutenção de uma boa saúde.

71
7 REFERÊNCIAS

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