PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
Curso: Biomedicina
Disciplina: Microbiologia Clínica
PRÁTICA VII: Qualidade microbiológica de carne moída e identificação de
Enterobactérias.
Professor(a): Alzira Batista Cecílio
Alunos: Glenda Teixeira
Helisandra Breguêz Lage
Luana Mendes Campos
Natalia Oliveira de Medeiros
Ramon Souza Carvalho
Stéfane Leão Parreira
Betim
2018
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO-------------------------------------------------------------------------------------- 1
2. OBJETIVO--------------------------------------------------------------------------------------------3
3. MATERIAIS E MÉTODO---------------------------------------------------------------------------
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4. RESULTADOS---------------------------------------------------------------------------------------7
5. DISCUSSÃO----------------------------------------------------------------------------------------10
6. CONCLUSÃO---------------------------------------------------------------------------------------
13
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS----------------------------------------------------------
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1. INTRODUÇÃO
A carne faz parte da dieta dos brasileiros de todas as camadas sociais, de qualquer
faixa etária, sua importância exige maior atenção na sua produção e distribuição,
principalmente no que diz respeito ao seu controle higiênico-sanitário.Segundo a
Instrução Normativa n. 83 de 21 de novembro de 2003, entende-se por carne moída
o produto cárneo obtido a partir da moagem das massas musculares de carcaças de
bovinos, seguido de resfriamento ou congelamento.
A carne moída é considerada uma fonte de alto risco na disseminação de
microrganismos patogênicos, por muitas vezes ser originária de retalhos
manipulados nos mercados e açougues, além de permanecer à temperatura
ambiente por longos períodos.Ela constitui também um meio altamente favorável
para multiplicação bacteriana. Existem diversas fontes de contaminação da carne,
dentre elas, destacam-se o abate do animal, tempo e temperatura de estocagem
nos pontos de venda e varejo, higienização dos equipamentos e excesso de
manipulação.
A sanidade da matéria-prima, a higiene no manuseio, as condições de fabricação e
conservação e a limpeza dos equipamentos são fatores importantes que estão
ligados diretamente à qualidade dos produtos cárneos.
Visando a segurança dos alimentos, a contagem de coliformes termotolerantes,
assim como a pesquisa da presença de Salmonella, tem sido utilizada para avaliar
as condições higiênico-sanitárias dos alimentos. Coliformes termotolerantes
constituem um grupo de enterobactérias capazes de fermentar a lactose a 45ºC
com produção de gás e ácido. Altas contagens de coliformes termotolerantes
indicam falhas higiênicas ao longo do processamento e possibilidade da presença
de microrganismos patogênicos. Um método utilizado no controle sanitário dos
alimentos é a contagem de bactérias mesófilas. Este método nos fornece
informações sobre as condições higiênicas durante o armazenamento e a
manipulação dos alimentos. Podemos considerar que uma elevada contagem de
mesófilos significa que houve condições para o desenvolvimento desses
microrganismos, colocando em risco a saúde dos consumidores, uma vez que todas
as bactérias patogênicas de origem alimentar são mesófilas. Por ser amplamente
consumida, revela-se de fundamental importância atentar-se para a qualidade
higiênico-sanitária da carne moída, que tem sido alvo de preocupação e destaque,
uma vez que uma variedade de perigos microbiológicos poderá ser veiculada pela
carne, já que este alimento apresenta características favoráveis ao desenvolvimento
microbiano, que pode ocorrer em toda a cadeia produtiva até o consumo.
2. OBJETIVO
O objetivo desta prátca foi analisar a qualidade higiênica-sanitária da carne
moída avaliando seu perfil microbiológico e identificar colônias isoladas de
Enterobatérias.
3. MATERIAIS E MÉTODO
PARTE I –
Materiais: Tubos de caldo tetrationato, tubos de caldo lactosado, 20g de carne
moída, 8 placas de meios para isolamento (2 de Mc Conkey, 2 de SS, 2 de EMB e 2
de CLED), bateria bioquímica para identificação, alças de platina, alças
descartáveis, Bico de Bunsen, caneta permanente, fósforo, luvas, álcool 70%.
Métodos:
1) Após o início da aula, lavou-se as mãos, colocou-se as luvas descartáveis,
realizou-se a higienização da bancada e o bico de Bunsen foi aceso.
2) Foram inoculadas 10 gramas de carne moída no erlenmeyer de caldo
tetrationato e caldo lactosado, que foram identificados e incubados a 37°C
por 24 horas.
3) Após o período de incubação, sempre atrás da chama, retirou-se uma alçada
do conteúdo de cada caldo e transferiu-se por esgotamento para os meios de
isolamento (Mc Conkey, SS, EMB, CLED), foi identificado e incubado a 37°C
por 24 horas.
4) O bico de Bunsen foi apagado, realizou-se a higienização da bancada,
retirou-se as luvas e lavaram-se as mãos.
PARTE II –
Materiais: Meios de isolamento incubados na última aula (Mc Conkey, SS, EMB,
CLED), alça de platina, bateria de Gram, álcool 70%, luvas, fósforo, bico de Bunsen,
caneta permanente, microscópio, lâminas e óleo de imersão.
Métodos:
1) Após o início da aula, lavaram-se as mãos, colocaram-se as luvas
descartáveis, realizou-se a higienização da bancada e o bico de Bunsen foi
aceso.
2) Selecionou-se uma colônia isolada dos meios de isolamento e realizou-se a
coloração de Gram, flambando a alça antes da retirada da colônia.
3) Foi realizada a leitura da lâmina no microscópio, na objetiva de 100x.
4) O bico de Bunsen foi apagado, realizou-se a higienização da bancada,
retirou-se as luvas e lavaram-se as mãos.
PARTE III –
Materiais: Testes bioquímicos Bactray 2 e 3, testes EPM, MILI e Citrato, tubos
contendo caldo arginina, ornitina e lisina, caldo tripticaseína, meio Rugai, tubo
controle solução 0,5 mcfarland, água esterilizada, óleo mineral, frasco contendo
solução salina, pipetas 1000µl. alça de platina especial (sem a ponta arredondada),
tabela M Biologic diagnósticos, luvas, álcool 70%, bico de Bunsen, fósforos, caneta
permanente.
Métodos:
1) Após o início da aula, lavou-se as mãos, colocou-se as luvas descartáveis,
realizou-se a higienização da bancada e o bico de Bunsen foi aceso.
2) Identificaram-se todos os testes e tubos.
3) A alça de platina foi flambada e selecionou-se colônias isoladas nos meios de
isolamento, sempre atrás do fogo, para realização dos seguintes testes
bioquímicos:
4) Bactray 2 e 3 – Inseriu-se a colônia isolada nos frascos contendo solução
salina e homogeneizou-se. A turbidez do tubo foi comparada com a solução
0,5 mcfarland, verificando se está viável. No caso estava viável, e foi
pipetado 1 mL no teste Bactray 2 e 1 mL no teste Bactray 3, sempre com os
teste inclinados e foram realizados movimentos até que toda porção desejada
fosse coberta. No teste Bactray 3 foram inseridas 3 gotas de óleo mineral nos
compostos sublinhados (CTL, ARG e URE) com o recipiente inclinado.
Incubou-se a 37ºC por 24 horas em câmara úmida. Após esse período de
incubação, foi realizada a leitura por comparação com o que é apresentado
no site do teste.
5) Caldo Arginina, Lisina e Ornitina – Inoculou-se a colônia selecionada em
cada um dos tubos com o auxílio da alça de platina e homogeneizou-se.
Foram incubados a 35ºC por até 72 horas. Após esse período observou-se
os resultados.
6) EPM, Mili e Citrato – Inoculou-se a colônia selecionada em cada um dos
tubos teste com o auxílio da alça de platina especial, inserindo bem ao fundo
e na retirada realizou-se movimento de zigzag ou estria. Foram incubados a
37°C por 24 horas. Após esse período observou-se os resultados.
7) Meio Rugai – Inoculou-se a colônia selecionada no tubo Rugai com o auxílio
da alça de platina especial, inserindo bem ao fundo e na parte superior
(inclinada) realizou-se movimento de zigzag ou estria. Foi incubado a 37°C
por 24 horas. Após esse período observou-se os resultados por comparação
com os presentes na tabela M Biologic diagnósticos.
8) O bico de Bunsen foi apagado, realizou-se a higienização da bancada,
retirou-se as luvas e lavaram-se as mãos.
4. RESULTADOS
PARTE I –
Após o período de incubação das placas de Ágar CLED, EMB, MacConkey e
SalmonellaShigella foram verificados as seguintes características de cada colônia.
Caldo Meio de Descrição das Possível bactéria ou
Lactosado cultura colônias característica da
colônia
EMB Eram redondas, Fermenta Lactose
brilhantes, pequenas Escherichia Coli
(algumas grandes) com
bordas irregulares e de
coloração esverdeada.
CLED Eram redondas, Fermenta Lactose
opacas, pequenas
(algumas grandes) com
bordas irregulares de
coloração
amarelada/alaranjada.
MacConkey Eram redondas, Fermenta Lactose
opacas, pequenas, com
bordas definidas e
regulares e de
coloração rosa.
SS Eram ovais, opacas, Fermenta Lactose
médias, com bordas
irregulares de coloração
amarelada/rosada.
Caldo
Tetrationato
EMB Eram redondas, Não fermenta Lactose
brilhantes, pequenas,
com bordas regulares e
de coloração rosa.
CLED Eram sem forma Fermenta Lactose
definida, opacas,
grandes, com bordas
irregulares de coloração
amarelada/alaranjada.
MacConkey Eram redondas, Fermenta Lactose
opacas, médias, com
boredas regulares e de
coloração rosa claro.
SS Eram ovais, opacas, Não fermenta Lactose
médias, com bordas Proteusspp. ou
irregulares de coloração Salmonella spp.
enegrecida.
PARTE II –
Após o período de incubação foi retirado uma amostra do Ágar EMB, na qual foi
utilizado o caldo Lactosado.
Foi escolhida 1 colônia e após fazer o esfregaço e corar pelo Gram foram obtidos os
seguintes resultados através das imagens do microscópio de imersão (aumento de
1000x): Foi visualizado uma lâmina com bactérias Gram negativas, em forma de
bacilos.
PARTE III –
Após o período de incubação dos testes bioquímicos foram obtidos os seguintes
resultados.
Amostra
TSB Turva
Indol +
L – triptofano -
Sacarose +
Glicose +
Ác. Sulfídrico -
Uréia -
Lisina +
Motilidade -
Formação de gás -
C. Orinitina -
C. Arginina -
Citrato -
Possível bactéria Kleibsiellapneumoniae ou
VibrioChlorae ou Escherichia Coli
Os kits para testes bioquímicos usados Bactray 2 e Bactray 3, secaram
inviabilizando a leitura dos resultados.
5. DISCUSSÃO
PARTE I –
De acordo com os procedimentos feitos acima em relação aos meios de cultura para
crescimento e identificação de enterobacteriaceae, no Ágar CLED, o mesmo não é
um meio seletivo, para a identificação, de fermentadora de lactose, é necessário
que o meio passe a se tornar amarelo, no caldo tetrationato, e no lactosado, o meio
se tornou amarelo, confirmando que a bactéria é fermentadora de lactose.
No Ágar EMB é um meio usado para isolamento e diferenciação, além de em sua
composição possuir lactose, sacarose, eosina e azul de metileno, também é
utilizado para distinção entre colônias fermentadoras de lactose e as não
fermentadoras, nos dois caldos foi identificado fermentadoras de lactose, sendo que
no caldo lactosado, foi identificado a possibilidade de se tratar de Escherichia Coli,
já que a mesma é uma bactéria fermentadora e devido as características
encontradas no gram feito dessa colônia, que no caso foram encontrados bacilos
gram- negativos e pela característica da colônia, que nesse meio de cultura, possui
a característica peculiar de presença de pigmento verde nas bactérias.
No Ágar MacConkey, as bactérias fermentadoras de lactose apresentam a
características da colônia como uma coloração rosácea ou avermelhada, que foi
possível essa visualização, nas duas placas, utilizando o caldo tetrationato quanto o
caldo lactosado.
No Ágar SS, é um meio diferencial para identificação de Salmonella spp. e Shigella
spp., as mesmas não são fermentadoras de lactose, logo formariam colônias claras
e transparentes, no uso do caldo lactosado foi evidenciado bactérias que fermentam
lactose, excluindo a possibilidade de serSalmonella spp., Shigella spp. ou Proteus
spp. Já no uso do caldo tetrationato foi evidenciado colônias com o centro
enegrecido, o que possibilita serSalmonella spp. e Proteus spp. já que as mesmas
produzem H2S que é capaz de reagir com citrato férrico e tiossulfato de sódio
presentes no meio, e não são fermentadoras de lactose.
PARTE II –
Após a realização da coloração de gram, de colônia retirada do Ágar CLED, em que
foi semeado amostra de caldo lactosado, foi possível a visualização de uma lâmina
com bactérias gram negativas, é possível chegar a essa afirmação, devido após a
coloração de gram, as bactérias que se corarem em vermelho ou rosa são
consideradas como gram negativas. Em relação ao formato eram bacilos, que
possuem formato de bastonete, podendo estar sozinho ou agrupados, nesse caso,
os bacilos não estavam agrupados.
PARTE III –
O meio rugai por se tratar de meio de cultura adequado à identificação, recomenda-
se utilizar colônias puras para inoculo. Este inoculo deve seguir à regra, as
instruções de uso do produto. É um teste, para triagem, sendo necessário a
realização de teste bioquímicos confirmatórios, principalmente enzimáticos, para
certificar – se realmente do patógeno, que possa estar causando a infecção.
O teste TSB, é um meio de enriquecimento, se deu como turvo, pelo fato de indicar
o crescimento bacteriano, o que confirma que as bactérias presentes são capazes
de se multiplicar nesse meio.
A prova do citrato, define bactérias que são capazes de obter energia a partir de
citrato, quando isso ocorre há alteração de cor de verde para azul, a mostra
cultivada, não é capaz de usar citrato como fonte de energia, logo é considerado
citrato negativo.
A prova citrato, Mili e EPM são triagens bioquímicas de enterobactériasgram
negativas, tudo que esses meios avaliam, o meio Rugai também avalia de forma
conjunta.
O caldo ornitina, o caldo lisina e o caldo arginina indica a capacidade da bactéria
quebrar os aminoácidos para usar como fonte de energia, caso o meio se mantenha
amarelo indica que a bactéria não possui a enzima capaz de quebrar o aminoácido,
e caso se torne roxo, indica que apresenta essa enzima, a bactéria cultivada nesse
caso, não possui essa enzima, logo é ornitina negativo, mas no caso do caldo lisina
já foi visualizado a lteração de cor para roxo, o que indica a presença da enzima
capaz de quebrar a lisina para usar como fonte de energia, logo ele é lisina positivo.
Já no caldo orginina, ocorreu o mesmo do que no caldo ornitina, não houve
alteração de coloração do meio, ou seja o mesmo se mantem amarelo, logo
ausência da enzima capaz de quebrar a arginina, ou seja arginina negativo.
Após a realização do meio rugai, foi realizado outros testes bioquímicos, além do
agrupamento dessas informações, que ajuda na identificação do possível patógeno,
sendo que devido as características, é possível chegar à conclusão de que pode –
se ser Kleibsielapneumoniaeou VibrioChlorae ou EscherichaColi, todos os três
possuem características compatíveis com os testes bioquímicos, rugai e o gram
realizado, além das características avaliadas no meio de cultura, como a
fermentação de lactose.
6. CONCLUSÃO
Podemos concluir que a partir de todas as análises realizadas a carne moída tem
sido uma grande fonte de contaminação de microrganismos da família das
Enterobacterias, o que gera uma grande preocupação já que algumas de suas
espécies tais como a Salmonella, podem causar diversos danos ao ser humano. A
partir disso podemos ver que os grandes responsáveis são os abatedouros e os
funcionários de açougues nos quais não praticam uma higienização adequada do
local onde é manuseada a carne e nem de si mesmo. Com isso se pode chegar a
conclusão de que deve ser tomadas medidas higiênicas-sanitárias urgentes nestes
locais para que assim a taxa de infecção dessas bactérias sejam menor.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
PELCZAR Jr., M.J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e
aplicações. 2. ed. São Paulo: Makron Books, 1996. v.2.
MURRAY, P.R; PFALLER, M.A; ROSENTHAL, K.S. Microbiologia Médica, 6ª ed –
Rio de Janeiro: Elsiever, 2009.
HANGUL, Sabrina; FEREIRA, Aline; DOURADO, Alessandra; MARTINS, Juliana;
VARGEM, Daiana; SILVA, Joel. Revista Eletrônica de Farmácia – Analise
Microbiológica da Carne Bovina Moída Comercializada na Cidade de Anápolis,
Goiás, Brasil. Data de publicação- 30/06/2015, Anápolis- Goiás.
