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PESQUISA ORIGINAL
publicado: 07 de março de 2017
doi: 10.3389/fphys.2017.00093

Efeitos da cobertura tópica em

Inflamação, Angiogênese,
Revascularização e Miofibra
Regeneração no músculo esquelético
Após lesão por contusão
Maria A. Woodruff 2
Daniel P. Singh1 , Zohreh Barani Lonbani Roland 1, , Tony J. Parker 1, 3 ,
Steck 4 e Jonathan M. Peake1, 3 *

1
Grupo de Reparação e Regeneração de Tecidos, Instituto de Saúde e Inovação Biomédica, Universidade de Tecnologia de Queensland,
2
Brisbane, QLD, Austrália, Grupo de Biofabricação e Morfologia de Tecidos, Instituto de Saúde e Inovação Biomédica,
Universidade de Tecnologia de Queensland, Brisbane, QLD, Austrália, 3 Escola de Ciências Biomédicas, Universidade de Queensland de
4
Tecnologia, Brisbane, QLD, Austrália, Centro de Pesquisa em Engenharia Médica, Universidade de Tecnologia de Queensland,
Brisbane, QLD, Austrália

Editado por:
Li Zuo,
Universidade Estadual de Ohio, EUA
Lesões por contusão no músculo esquelético ocorrem comumente em esportes de contato e
Revisados pela:
acidentes de trabalho veiculares e industriais. O gelo tem sido tradicionalmente usado para
RobinLewis Cooper, tratar tais lesões sob a premissa de que alivia a dor, reduz o metabolismo dos tecidos e
Universidade de Kentucky, EUA
modifica as respostas vasculares para diminuir o inchaço. Pesquisas anteriores examinaram
Brenda Schoffstal,
Universidade Barry, EUA os efeitos do gelo na inflamação e na dinâmica microcirculatória após lesão muscular. No
Zewen Liu, entanto, se o gelo influencia a angiogênese, o crescimento de vasos colaterais ou a
Universidade de Wuhan, China
regeneração de miofibras permanece desconhecido. Comparamos os efeitos do gelo versus
*Correspondência:
Jonathan M. Peake
um tratamento simulado na presença de neutrófilos e macrófagos; expressão de CD34, fator
[email protected] de von Willebrands (vWF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e nestina; volume
do vaso; densidade capilar; e regeneração de miofibras no esqueleto após lesão por contusão muscular e
Seção especializada:
Este artigo foi submetido para
O tecido muscular foi coletado 1, 3, 7 e 28 dias após a lesão. Em comparação com ratos não
Fisiologia do Músculo Estriado, feridos, os músculos dos ratos que sofreram a lesão por contusão exibiram grande necrose,
uma seção da revista
inflamação e expressão aumentada de CD34, vWF, VEGF e nestina. Em comparação com o
Fronteiras em Fisiologia
tratamento simulado, o gelo atenuou e/ou atrasou a infiltração de neutrófilos e macrófagos; a
Recebido: 13 de outubro de 2016

Aceito: 06 de fevereiro de 2017

expressão de vWF, VEGF e nestina; e a mudança no volume do vaso dentro do músculo nos
Publicado: 07 de março de 2017 primeiros 7 dias após a lesão (P <0,05). Por outro lado, o gelo não influenciou a densidade
Citação: capilar no músculo 28 dias após a lesão (P = 0,59). A porcentagem de miofibras imaturas em
Singh DP, Barani Lonbani Z,
relação ao número total de fibras foi maior no grupo de gelo do que no grupo placebo 28 dias
Woodruff MA, Parker TJ, Steck R e Peake JM
(2017) Efeitos do gelo tópico na inflamação, após a lesão (P = 0,026), mas a área transversal das miofibras não diferiu entre os grupos
angiogênese, revascularização e regeneração
após 7 dias (P = 0,35) e 28 dias (P = 0,30). Em conclusão, embora o gelo tenha interrompido
de miofibras no músculo esquelético
após lesão por contusão.
a inflamação e alguns aspectos da angiogénese/revascularização, estes efeitos não resultaram
em diferenças substanciais na densidade capilar ou no crescimento muscular.
Frente. Fisiol. 8:93.
doi: 10.3389/fphys.2017.00093 Palavras-chave: lesão muscular, crioterapia, regeneração, inflamação, angiogênese

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Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º
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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

INTRODUÇÃO lesões por esmagamento ou contusão (Merrick et al., 1999; Lee et al., 2005;
Schaser et al., 2006, 2007; Carvalho et al., 2010; Puntel et al., 2011; Takagi et
Trauma fechado de tecidos moles ou lesões por contusão no músculo al., 2011; Vieira Ramos et al., 2016). A infusão de solução salina fria no músculo
esquelético são relativamente comuns entre atletas (Canale et al., 1981; Volpi esquelético lesionado restaura a hemodinâmica microvascular em 1 hora
et al., 2004) e trabalhadores industriais (Dement e Lipscomb, 1999). Esses (Schaser et al., 2006) e 24 horas (Schaser et al., 2007) após a lesão.
tipos de lesões geralmente ocorrem quando uma força compressiva repentina
e pesada é aplicada ao músculo e, portanto, são comuns em esportes de Até o momento, nenhuma pesquisa investigou se a crioterapia influencia a
contato (Jarvinen et al., 2005). angiogênese durante as fases posteriores do crescimento/regeneração
Lesões por contusão são clinicamente manifestadas por dor localizada, muscular (ou seja, > 1 dia após a lesão). É importante compreender como o
inchaço, redução da amplitude de movimento e sensibilidade à palpação (Kary, gelo influencia a angiogênese no músculo esquelético após lesão por dois
2010). No nível molecular, as lesões contusivas resultam em necrose motivos. Primeiro, o gelo é um tratamento comum para lesões musculares. Em
transitória, infiltração de células inflamatórias e expressão de citocinas pró- segundo lugar, a angiogênese está intimamente ligada ao reparo muscular.
inflamatórias. Esses processos são seguidos pela formação de novas miofibras Evidências de outros tipos de tecidos sugerem que a hipotermia pode alterar
e posterior maturação das miofibras (Merrick et al., 1999; Lee et al., 2005; a secreção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Coassin et al.,
Schaser et al., 2006, 2007; Carvalho et al., 2010; Puntel et al., 2011; Takagi et 2010; Takeyama et al., 2015) e a angiogênese (Kuo et al., 2010; Kao et al., 2011).
al., 2011; Vieira Ramos et al., 2016).

Ainda não se sabe se a hipotermia exerce efeitos semelhantes no tecido

O processo de cicatrização muscular começa logo após a lesão e envolve muscular esquelético.
fases de destruição, reparo e remodelação tecidual. O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos do gelo logo após a lesão
Essas fases envolvem regeneração de miofibras, formação de tecido cicatricial por contusão muscular na inflamação subsequente, na angiogênese, no
conjuntivo, angiogênese e vascularização (Jarvinen et al., 2005; Ceafalan et volume do vaso e na regeneração das miofibras.
al., 2015). A angiogênese é um processo chave na regeneração muscular após Nossa hipótese é que o gelo atenuaria a inflamação, a angiogênese e as
lesão (Ochoa et al., 2007; Miyazaki et al., 2011; Huey et al., 2016). A regeneração alterações no volume dos vasos, o que pode retardar a regeneração das
muscular bem-sucedida depende da restauração da rede vascular necessária miofibras.
para a troca de oxigênio e nutrientes e da formação de fibras musculares
maduras (Rhoads et al., 2009). Após a lesão, a angiogênese é estreitamente
MATERIAIS E MÉTODOS
coordenada com a proliferação, diferenciação e fusão de células satélites às
miofibras existentes (Christov et al., 2007). As células satélites ativadas
Os procedimentos experimentais neste projeto foram aprovados pelo Comitê de Ética
acumulam-se e proliferam perto dos capilares e são estimuladas a crescer por
Animal da Universidade de Tecnologia de Queensland (número de aprovação ética
vários fatores de crescimento secretados pelas células epiteliais circundantes
11-318). Os experimentos foram conduzidos de acordo com o Código Australiano de
(Christov et al., 2007). A proliferação e diferenciação de células satélites
estimulam as células endoteliais a se unirem para formar vasos sanguíneos
Prática para o cuidado e uso de animais para fins científicos (Conselho
nascentes (Christov et al., 2007) e fragmentos microvasculares para formar Nacional de Saúde e Pesquisa Médica, 2013).
novos brotos (Rhoads et al., 2009). A angiogênese na regeneração do tecido
muscular também depende de macrófagos, quimiocinas, como a proteína Visão Geral Experimental O curso
quimiotática de monócitos 1, e vários fatores de crescimento e seus receptores temporal dos procedimentos experimentais está descrito na Figura 1. Noventa
(Ochoa et al., 2007; Wagatsuma, 2007; Novak et al., 2011; Ceafalan et al., 2015 ). ratos machos adultos da linhagem Wistar (12 semanas de idade) foram
adquiridos do Animal Resources Center (Canning Vale, WA, Austrália). Ratos
adultos foram escolhidos para minimizar quaisquer efeitos de crescimento na
regeneração do tecido muscular durante as semanas seguintes à lesão. Oitenta
ratos foram divididos aleatoriamente em um grupo de gelo ou um grupo
Uma variedade de opções são utilizadas para tratar lesões musculares, simulado (n = 40 por grupo). Ambos os grupos de animais foram submetidos
incluindo: imobilização/remobilização; repouso, gelo, compressão e elevação a uma lesão muscular por contusão, após a qual foi aplicado gelo ou tratamento
(ARROZ); ultrassom; oxigenoterapia hiperbárica; medicamentos anti- simulado na pele que cobria o local da lesão. Os ratos de cada grupo foram
inflamatórios ou antifibróticos; e tratamento com plasma rico em plaquetas ou sacrificados em quatro momentos distintos: 1, 3, 7 e 28 dias após a lesão (n =
células-tronco derivadas de músculo. O gelo é um tratamento básico para 10 por grupo em cada momento). Dez ratos foram utilizados como controles
muitos tipos de lesões musculoesqueléticas agudas (Meeusen e Lievens, não feridos e não tratados.
1986). A justificativa geral para o uso de gelo no tratamento de tais lesões é
aliviar a dor, reduzir o metabolismo dos tecidos e modificar as respostas Lesão por Contusão Muscular A anestesia
vasculares para restringir o inchaço (Swenson et al., 1996). Vários estudos foi induzida antes da lesão, colocando o rato em uma câmara de indução
investigaram os efeitos da crioterapia (por exemplo, gelo ou perfusão de contendo 5% de isofluorano administrado em 2–3 l O2/min. A anestesia foi
solução salina fria) na regeneração muscular, inflamação e estresse oxidativo então mantida por pelo menos 20 minutos após a lesão através de uma
após máscara facial que administrava 2–2,5% de isofluorano em 1–1,5 L O2/min.
Este procedimento foi utilizado para que os ratos não se movessem durante o
tratamento com gelo ou simulação.
Abreviaturas: TC, tomografia computadorizada; HIF-1ÿ, fator 1ÿ induzível por
hipóxia; ROS, espécies reativas de oxigênio; FvW, fator de von Willebrand; VEGF, foi aplicado. A analgesia foi obtida por injeção subcutânea de buprenorfina
fator de crescimento endotelial vascular. (0,05 mg/kg) imediatamente antes da lesão e

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

FIGURA 1 | Curso temporal de procedimentos experimentais. Os grupos de controle não ferido, gelo e tratamento simulado em cada momento do sacrifício foram divididos em
grupos de seis ratos para histologia e imuno-histoquímica e quatro ratos para imagens de micro-TC.

administração de tramadol (25 mg/l) na água de bebida durante os embebido em cera de parafina (Thermo Excelsior Tissue Processor
primeiros 5 dias após a lesão. Esses tratamentos anestésicos e e estação de incorporação de parafina, Thermo Fisher Scientific, EUA).
analgésicos podem ter induzido a expressão de mediadores-chave Secções seriadas transversais (5 µm de espessura) foram cortadas
da angiogênese, como o fator 1ÿ indutível por hipóxia (HIF-1ÿ) e usando um micrótomo (Leica Biosystems RM2235, Sydney,
VEGF (Li et al., 2006; Singleton et al., 2006; Luk et al., 2006; Singleton et al., 2006; Luk
Austrália) et al. , 2012).
e montadas em lâminas de vidro de adesão de poli-L-
No entanto, como administramos esses tratamentos a todos os lisina (Thermo Fisher Scientific, Brisbane, Austrália). Seções entre
animais experimentais, quaisquer desses efeitos foram profundidades de 50 e 250 µm foram utilizadas para análise. As
provavelmente semelhantes entre os grupos de gelo e placebo. lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E, Sigma-
Durante o trabalho piloto, estabelecemos um modelo de lesão Aldrich, Sydney, Austrália) para análise histológica qualitativa da
por contusão não invasiva usando um dispositivo personalizado regeneração muscular. Para imuno-histoquímica, as lâminas foram
baseado em uma abordagem descrita por Stratton et al. (1984) que desparafinizadas, tratadas com H2O2 a 3% por 30 min e depois
tem sido amplamente utilizado em outras pesquisas. Este trabalho bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 2% por 60 min. A
piloto confirmou que esta abordagem causou contusão muscular recuperação antigênica induzida por calor foi realizada utilizando
tampão citrato trissódico (Sigma-Aldrich) por 40 min a 70ÿC em
substancial sem perfurar a pele ou fraturar os ossos do membro posterior.
O procedimento envolveu colocar um rato com o membro posterior forno (forno Cole-Parmer StableTemp, Sydney, Austrália). As
esquerdo em posição estendida sobre uma plataforma. Um peso lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ÿC com os seguintes
cilíndrico de 400 g foi colocado em uma coluna metálica a uma anticorpos primários: granulócitos monoclonais de camundongo
altura de 1,66 m acima da plataforma e mantido temporariamente no anti-rato (HIS48, 1:50; BD Pharmingen, San Diego, CA, EUA) para
lugar com um pino metálico. O peso foi liberado puxando o pino da identificar neutrófilos; anti-CD68 monoclonal de camundongo (ED1)
coluna. O peso então caiu sobre o membro posterior do rato, (1:500; Abcam, Cambridge, MA, EUA) para identificar macrófagos;
especificamente na região do músculo bíceps femoral. Dessa forma, VEGF A-20 anti-humano policlonal de coelho (sc-152, 1:500; Santa
a lesão foi localizada em uma região específica de interesse entre a Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) como fator pró-
incisura tibial da articulação do joelho e a conjunção da tíbiofíbula. angiogênico; anti-CD34 monoclonal de coelho (EP373Y, 1:500;
Abcam) e Fator von Willebrand policlonal de coelho anti-humano
Tratamento com gelo e tratamento (vWF) (pronto para uso; Dako, Carpinteria, CA, EUA) para identificar
simulado O tratamento com gelo foi administrado com base no células endoteliais associadas a capilares ( Qu et al., 1997; Niiyama
método descrito por Takagi et al. (2011). Cinco minutos após a lesão et al., 2003; Fujino et al., 2005; Wiik et al., 2005; Ho et al., 2006;
contusiva ter sido induzida e enquanto o rato ainda estava Hollemann et al., 2008); e anti-nestina monoclonal de camundongo
anestesiado, um bloco de gelo cilíndrico de 5 cm de diâmetro foi (Rat-401, 1:400; Santa Cruz Biotechnology) como marcador de
aplicado na pele ao redor do músculo lesionado por 20 minutos. O maturação de células endoteliais no músculo (Cizkova et al., 2009b).
bloco de gelo foi massageado em movimento “Figura 8” na área As lâminas foram então incubadas durante 40 min com um anticorpo
lesionada sem compressão. A parte inferior da perna estava apoiada secundário de cabra anti-murganho e anti-coelho conjugado com
em uma bolsa de gelo. No grupo sham, um béquer de fundo plano peroxidase de rábano (Dako). A cor foi desenvolvida utilizando 3,3ÿ
de 50 ml (mantido em temperatura ambiente) foi utilizado para -diaminobenzidina (DAB Substrate Kit; Dako) seguida de
massagear a área lesionada e simular o movimento do bloco de contracoloração com hematoxilina de Mayer. A exclusão do
gelo, também por 20 min. Esses tratamentos de gelo e simulação anticorpo primário, bem como um controle de isotipo (controle de isotipo IgM de
foram aplicados uma vez no dia da lesão. Após a aplicação do gelo
ou do tratamento simulado, os ratos ficaram livres para se Análise de Imagem Os
movimentar pelas gaiolas enquanto se recuperavam da lesão muscular. slides
Aos 1, foram
3, 7 oudigitalizados
28 dias apósusando
a lesão,um
osscanner
ratos foram sacrificados
de slides Leica por asfixia com C
SCN400 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) e as imagens
Histologia e Imunohistoquímica foram capturadas usando o software Digital Image Hub (Leica
Biópsias musculares do músculo bíceps femoral foram fixadas em Microsystems). Resumidamente, com ampliação de 40x, 10 campos
formalina tamponada neutra a 10% por 1 dia, processadas e depois de visão foram capturados e quantificados por lâmina para todos os seis animais

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e ponto no tempo. O software ImageJ foi utilizado para quantificar áreas de a técnica não mede o edema. Em vez disso, como o agente de contraste estava
coloração positiva e identificar células e tecidos de interesse. Para quantificar limitado ao espaço vascular, não foi observado vazamento do agente de
neutrófilos e macrófagos, as células coradas positivamente foram contadas e contraste para o espaço extravascular por micro-TC ou avaliação histológica.
expressas como o número de células por campo de visão. Foi calculada a
média dos 10 campos de visão e um único valor foi registrado por animal. A Após a perfusão, os ratos foram armazenados a 4ÿC durante a noite para
expressão de CD34, vWF, VEGF e nestina foi avaliada pela área de coloração permitir a polimerização do agente de contraste. No dia seguinte, os membros
positiva como uma percentagem da área total de tecido dentro do campo de posteriores foram removidos e uma biópsia de tecido foi retirada da região de
visão. O uso dessa abordagem relativa evitou problemas causados pelo interesse (como descrito acima) utilizando um punção de biópsia descartável
inchaço das fibras musculares e das células endoteliais e nos permitiu de 8 mm. Esta abordagem garantiu que as biópsias fossem obtidas
comparar amostras de maneira mais confiável. Foram excluídas áreas de tecido consistentemente da mesma região do músculo em cada animal.
muscular com vasos com diâmetro >100 µm e miofibras orientadas As biópsias musculares foram digitalizadas usando um sistema de imagem
longitudinalmente. micro-CT (µCT 40, Scanco Medical, Bassersdorf, Suíça) e avaliadas usando o
A área transversal das fibras musculares foi avaliada traçando o contorno software Scanco (µCT Evaluation Program, V6.5-3, Scanco Medical). As
de 100 fibras usando o software Digital Image Hub para calcular a área da fibra. biópsias musculares foram escaneadas com energia de 55 kVp, intensidade
As fibras regenerativas foram identificadas como aquelas com núcleos de 145 µA e tempo de integração de 250 ms, o que resultou em tamanho de
localizados centralmente e são expressas como uma proporção do número voxel de 6 µm. A rede vascular foi segmentada a partir do tecido circundante
total de fibras em 10 campos de visão. Os grupos experimentais e de controle usando um limite inferior de 1.434 unidades Hounsfield e um filtro gaussiano
foram comparados, e o número de células inflamatórias e a extensão da passa-baixo (ÿ = 0,8, suporte = 1). O volume total dos vasos sanguíneos
angiogênese foram representados graficamente para determinar os efeitos do menores (<78 µm de diâmetro) foi quantificado para as 250 principais fatias de
tratamento com gelo. imagem dos exames de biópsia. Esses dados foram usados para calcular o
A densidade capilar foi quantificada contando o número de células CD34+ volume do vaso. Para reduzir a variabilidade potencial nos resultados da micro-
e fibras de cinco campos de visão por lâmina com ampliação de 20x usando o CT, os dados dos ratos feridos foram normalizados em relação aos ratos não
software Digital Image Hub. A densidade capilar é expressa como capilares feridos (isto é, feridos/ilesos × 100). Os valores discrepantes nos dados de
por fibra e capilares por milímetros quadrados. Conforme relatado por Ochoa volume do vaso foram identificados usando a fórmula média - (1,5 × DP) <
et al. (2007), a necrose nas seções de tecido obtidas 1, 3 e 7 dias após a lesão valor medido < média + (1,5 × DP). A Figura 2 mostra uma imagem micro-CT
dificultou a identificação das bordas das fibras musculares individuais nesses representativa da rede vascular dentro de uma pilha de biópsia (250 fatias) de
pontos. Assim, pudemos quantificar a densidade capilar apenas aos 28 dias um animal 1 dia após a lesão. A Figura 3 mostra um histograma representando
após a lesão. a distribuição de vasos com diâmetro de 6 a 78 µm dentro de uma pilha de
biópsia (250 fatias) de um animal 1 dia após a lesão.

Análise do volume do vaso A caracterização

quantitativa e tridimensional do volume do vaso no tecido muscular foi
realizada por meio de tomografia microcomputadorizada (micro-CT). Esta Análise Estatística Todos os
análise foi realizada num grupo separado de 36 ratos daqueles ratos utilizados
dados foram testados e confirmados como normalmente distribuídos usando
para histologia muscular e imuno-histoquímica (ver Figura 1).
a fórmula de Shapiro-Wilks. A análise de variância de dois fatores foi

Imediatamente após a eutanásia, a vasculatura foi lavada com solução

salina heparinizada (soro fisiológico 0,9% e heparina sódica (100 U/ml), Pfizer
Ltd, Sydney, Austrália) usando uma bomba de infusão peristáltica (Bomba 1:
Cole-Parmer, 6-600 RPM , Extech Equipment Pty Ltd, Melbourne, Austrália).
Uma vez que o perfusato retornou claro no ponto de saída no átrio direito, os
vasos sanguíneos foram então perfundidos com agente de contraste Microfil
(kit MV-122 Microfil, consistindo de composto MV, diluente MV e agente de
cura MV; Flow Tech Inc. ., Carver, MA, EUA), conforme descrito por Duvall et
al. (2004), utilizando uma segunda bomba peristáltica (Bomba 2: 505 U, 220
RPM, Watson Marlow Ltd, NSW, Austrália). O volume de agente de contraste
utilizado por rato foi de 165 ml e compreendia uma proporção composto-
diluente de 1:2 misturado com 10% de agente de cura (isto é, 50 ml de
composto, 100 ml de diluente e 15 ml de agente de cura).

O agente de contraste foi bombeado para o rato a uma taxa de 20 ml/min para
manter a pressão de perfusão suficientemente baixa para evitar qualquer
ruptura ou fuga da vasculatura. Nem todo o agente de contraste permaneceu
dentro da vasculatura porque o átrio direito foi puncionado para liberar o meio
de perfusão após a perfusão da vasculatura. No entanto, o volume perfundido
FIGURA 2 | Imagem micro-CT representativa da rede vascular dentro de
e a duração da perfusão garantiram a perfusão completa do animal. Esse
uma pilha de biópsia (250 fatias) de um animal 1 dia após a lesão.

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

mais abundante no músculo do grupo de gelo do que no grupo placebo aos 3

dias após a lesão (d = 1,6; P = 0,027). Não houve neutrófilos presentes no
músculo em nenhum dos grupos aos 7 e 28 dias após a lesão (dados não
mostrados).
O número de macrófagos foi maior no músculo dos grupos de gelo e sham
em comparação com o grupo controle em todos os momentos após a lesão
(Figura 7B). Os macrófagos foram mais abundantes no músculo do grupo
sham do que no grupo de gelo em 1 dia (d = 2,0; P = 0,035) e 3 dias após a
lesão (d = 2,5; P = 0,001). Por outro lado, os macrófagos foram mais abundantes
no músculo do grupo de gelo do que no grupo placebo aos 7 dias (d = 1,5; P =
0,045) e 28 dias (d = 1,9; P = 0,020) após a lesão.

A coloração CD34 foi utilizada para identificar células endoteliais (Wiik et

al., 2005; Ho et al., 2006; Hollemann et al., 2008) (Figura 8).
FIGURA 3 | Histograma mostrando a distribuição do tamanho do vaso. O
tamanho do vaso foi determinado por micro-CT (diâmetro do vaso 6-78 µm) dentro de A coloração para CD34 foi quantificada como a área de coloração positiva
uma pilha de biópsia (250 fatias) de um animal 1 dia após a lesão. como uma percentagem da área total de tecido dentro do campo de visão.
A porcentagem de área corada com CD34 foi menor no músculo dos grupos
de gelo e placebo do que no grupo controle 1 dia após a lesão (P < 0,001)
(Figura 9A). Posteriormente, a percentagem de área corada com CD34 foi maior
realizado para determinar se houve algum efeito principal do tempo e das
no músculo dos grupos de gelo e placebo do que no grupo de controle. A
interações grupo ou grupo x tempo. Se quaisquer efeitos principais
porcentagem de área corada com CD34 tendeu a ser maior no músculo do
significativos (P < 0,05) fossem evidentes, testes t não pareados foram
grupo sham do que no grupo de gelo aos 3 dias (d = 1,1; P = 0,082) e 7 dias (d
usados para comparar o grupo controle versus os grupos de cobertura e
= 1,3; P = 0,053) após a lesão. Por outro lado, a porcentagem de área corada
simulação, e os grupos de cobertura versus simulação. Esta análise
com CD34 foi maior no músculo do grupo de gelo do que no grupo placebo
estatística foi realizada utilizando o IBM SPSS Statistics (versão 23, IBM,
aos 28 dias após a lesão (d = 1,7; P = 0,013).
Armonk, NY, EUA). A taxa de descoberta falsa foi usada para controlar
múltiplas comparações entre grupos. O tamanho do efeito de Cohen (d)
A coloração do vWF foi utilizada para identificar células endoteliais (Qu et
também foi calculado para avaliar os efeitos do tratamento e foi considerado
al., 1997; Fujino et al., 2005; Hollemann et al., 2008). Em contraste com a
pequeno (d < 0,2), moderado (d = 0,2–0,5) ou grande (d ÿ 0,8). Todos os
dados são apresentados como média ± DP. coloração para CD34 e consistente com outros relatórios (Qu et al., 1997), a
coloração do vWF foi restrita a vasos maduros maiores e bem estabelecidos
(Figura 10). A coloração para vWF foi quantificada como a área de coloração
RESULTADOS positiva como uma percentagem da área total de tecido dentro do campo de
visão. A porcentagem de área corada com vWF foi maior no músculo dos
A histologia de rotina com coloração H&E revelou extensa necrose das fibras grupos de gelo e placebo do que no grupo controle em todos os momentos
musculares 1 dia após a lesão nos grupos sham e glacê (Figura 4). As fibras após a lesão (Figura 9B), e essa porcentagem foi maior no músculo do grupo
musculares necróticas foram identificadas por miofibras aumentadas sem de gelo do que no grupo de gelo em 3 dias (d = 1,6; P = 0,022) e 7 dias (d = 3,0;
núcleos. A infiltração de células inflamatórias acompanhou a necrose e P < 0,001) após a lesão.
compreendeu principalmente leucócitos multinucleados (neutrófilos) (Figura
5). Nos ratos sacrificados 3 dias após a lesão, a necrose desapareceu quase A ampla coloração de fundo para VEGF era aparente no tecido muscular e
totalmente no grupo simulado, enquanto várias áreas necróticas ainda estavam os focos de coloração de VEGF eram evidentes ao redor dos vasos sanguíneos
presentes no grupo de gelo. O infiltrado inflamatório neste momento consistia (Figura 11). A porcentagem de área corada com VEGF foi maior no músculo
principalmente de leucócitos mononucleares, que foram identificados como dos grupos de gelo e simulação do que no grupo controle em todos os
macrófagos pelo seu tamanho e núcleos únicos (Figura 6). Vários macrófagos momentos após a lesão, mas pareceu atingir o pico 3 dias após a lesão (Figura
eram visíveis em todo o tecido necrótico no grupo simulado, mas estas células 9C). Foi maior no músculo do grupo sham versus o grupo de gelo 3 dias após
não eram tão proeminentes no grupo de gelo. Nos ratos sacrificados 7 dias a lesão (d = 2,0; P = 0,007).
após a lesão, a necrose havia desaparecido e várias fibras musculares imaturas
com nucleação central eram evidentes no tecido muscular dos grupos Usamos a nestina para identificar células endoteliais em maturação
simulado e de gelo. Nos ratos sacrificados 28 dias após a lesão, o influxo de (Cizkova et al., 2009b). Semelhante à coloração do vWF, a coloração com
células inflamatórias foi resolvido e a estrutura normal do tecido foi quase nestina foi localizada em vasos sanguíneos maiores (Figura 12). A coloração
restaurada, com exceção de grandes miofibras em maturação. para nestina foi quantificada como a área de coloração positiva como uma
percentagem da área total de tecido dentro do campo de visão. A área de

coloração de nestina foi maior no músculo dos grupos de gelo e placebo do

O número de neutrófilos foi maior no músculo dos grupos de gelo e que no grupo controle em todos os momentos após a lesão (Figura 9D). A área
simulação em comparação com o grupo controle em 1 dia e 3 dias após a lesão de coloração de nestina foi maior no músculo do grupo placebo do que no
(Figura 7A). Os neutrófilos foram mais abundantes no músculo do grupo sham grupo de gelo aos 3 dias após a lesão (d = 3,2; P < 0,001), mas foi maior no
do que no grupo de gelo 1 dia após a lesão (d = 1,9; P = 0,010), enquanto os músculo do grupo de gelo do que no grupo placebo aos 7 dias ( d = 2,7; P =
neutrófilos foram

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FIGURA 4 | Seções transversais representativas do tecido muscular esquelético. O tecido muscular foi corado com H&E no grupo sham (A – D) e no grupo de gelo (F – I) aos 1,
3, 7 e 28 dias após a lesão. (E) Mostra tecido muscular de um rato ileso para comparação. As setas indicam fibras musculares necróticas. As setas indicam fibras musculares em
regeneração (núcleos localizados centralmente). Barra de escala = 100 ÿm.

0,001) após lesão. Nestina também foi detectada no sarcoplasma de por fibra aos 28 dias após a lesão não diferiu significativamente (P =
miotubos e miofibras imaturos. Aos 28 dias, poucas fibras musculares 0,59) entre o grupo de cobertura (1,90 ± 0,27) e o grupo sham (1,82 ±
grandes expressavam nestina. 0,18). O número de capilares por milímetro quadrado também não
O volume do vaso no músculo foi determinado por micro-CT. diferiu significativamente (P = 0,13) entre o grupo de gelo (240 ± 24) e
O volume do vaso foi maior no grupo sham do que no grupo de gelo o grupo placebo (218 ± 0,23) aos 28 dias após a lesão.
aos 3 dias (d = 2,5; P = 0,029) e 7 dias (d = 3,2; P = 0,021) após a lesão,
enquanto não houve diferença entre os grupos após 28d (P = 0,84) Aos 7 dias após a lesão, muitas fibras musculares em regeneração
(Figura 13A). O número de capilares centralmente nucleadas estavam presentes no grupo placebo, enquanto apenas

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 6 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

FIGURA 5 | Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica de neutrófilos. O tecido muscular esquelético foi corado com anticorpo HIS48 para identificar
neutrófilos. Grupos Sham (A,C) e glacê (B,D) em 1 e 3 dias após a lesão. Barra de escala = 20 ÿm.

alguns estavam presentes no grupo de cobertura. A porcentagem gelo (Carvalho et al., 2010; Puntel et al., 2011; Takagi et al., 2011)
de fibras em regeneração em relação ao número total de fibras ou solução salina fria (Lee et al., 2005; Schaser et al., 2006,
não diferiu significativamente entre os grupos de gelo e placebo 2007). Este declínio/atraso na inflamação pode resultar de uma
aos 7 dias após a lesão (P = 0,11). Por outro lado, esta diminuição na expressão de moléculas de adesão na superfície
percentagem foi maior no grupo de gelo do que no grupo das células inflamatórias (Haddix et al., 1996; Inamasu et al., 2001).
placebo aos 28 dias após a lesão (d = 1,5; P = 0,026) (Figura Este é o primeiro estudo a investigar se o gelo influencia a
13B). Não houve diferenças significativas entre os grupos de angiogênese e o volume dos vasos na regeneração muscular.
gelo e sham para a área transversal da fibra aos 7 dias (P = 0,35) ou 28 dias (P o
Coramos = tecido
0,30) (dados nãopara
muscular mostrados).
CD34 e vWF para identificar
capilares (Qu et al., 1997; Niiyama et al., 2003; Fujino et al., 2005;
DISCUSSÃO Wiik et al., 2005; Ho et al., 2006; Hollemann et al. ., 2008). A lesão
por contusão induziu um aumento sustentado na expressão do
O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos do gelo logo vWF no músculo que durou pelo menos 28 dias. Por outro lado,
após a lesão por contusão muscular na inflamação subsequente, a lesão por contusão pareceu suprimir a expressão de CD34 no
angiogênese, revascularização e regeneração de miofibras. músculo nos primeiros 7 dias após a lesão. O gelo reduziu a
Nosso estudo é o primeiro a demonstrar que o gelo atrasou e/ou expressão de vWF e CD34 (em menor grau) entre 3 e 7 dias após
atenuou a expressão de fatores pró-angiogênicos e alterações a lesão. Conforme relatado por Ochoa et al. (2007), a necrose no
no volume do vaso na regeneração muscular nos primeiros 7 tecido muscular aos 3 e 7 dias após a lesão dificultou a
dias após a lesão. Apesar dessas diferenças, a densidade identificação da borda das fibras musculares e, portanto, a
capilar e a área transversal das miofibras não diferiram quantificação do número de capilares por fibra (isto é, densidade
significativamente entre os grupos de gelo e placebo. Esses capilar). No entanto, conseguimos quantificar a área de coloração
achados sugerem que, embora o gelo possa suprimir levemente positiva para CD34, vWF e VEGF como percentagens da área
a inflamação e alguns aspectos da angiogênese/revascularização, total de tecido dentro do campo de visão. Apesar de uma
diferença
esses efeitos não são suficientes para retardar a regeneração muscular na intensidade
após lesão de coloração de CD34 no músculo após
por contusão.
A lesão por contusão causou extensa necrose no músculo 28 dias (Figura 9A), a densidade capilar não diferiu
esquelético durante os primeiros 3 dias após a lesão. O gelo significativamente entre os grupos de gelo e placebo neste
pareceu prolongar a eliminação do tecido necrótico, momento. No entanto, é possível que a densidade capilar tenha
possivelmente prevenindo (ou retardando) a infiltração de diferido entre esses grupos aos 3 e 7 dias após a lesão. Alguma
neutrófilos e macrófagos no músculo danificado (Teixeira et al., coloração de VEGF foi evidente nas células endoteliais e nos
2003; Summan et al., 2006). O declínio ou atraso na infiltração vasos sanguíneos circundantes (Figura 11), mas houve também
coloração
de células inflamatórias é consistente com os resultados de outros estudos quede fundo geral
trataram para
lesões VEGF, quecom
musculares muito provavelmente representa co

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 7 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

FIGURA 6 | Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica de macrófagos. O tecido muscular esquelético foi corado com anticorpo CD68 para identificar
macrófagos. Grupos Sham (A – C) e glacê (D – F) em 1, 3 e 7 dias após a lesão. As setas indicam macrófagos. Barra de escala = 20 ÿm.

FIGURA 7 | Dados quantitativos para contagem de neutrófilos (A) e macrófagos (B) no tecido muscular esquelético. n = 6 ratos por grupo. Os dados são média ± DP e são expressos
como uma diferença de vezes em relação aos ratos de controle não feridos. Neutrófilos e macrófagos não estavam presentes no tecido muscular esquelético de ratos controle não lesionados. Principais efeitos para
contagens de neutrófilos: tempo (P < 0,001), grupo (P = 0,029) e interação grupo x tempo (P < 0,001). Principais efeitos para contagens de macrófagos: tempo (P < 0,001), grupo (P =
0,008) e interação grupo x tempo (P < 0,001). *P < 0,05 para teste t não pareado vs. ratos controle não lesionados. #P < 0,05 para teste t não pareado vs. ratos tratados com simulação.

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 8 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

FIGURA 8 | Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica de células endoteliais. O tecido muscular esquelético foi corado com anticorpo CD34 para
identificar células endoteliais. Grupos Sham (A – D) e glacê (E – H) em 1, 3, 7 e 28 dias após a lesão. As setas indicam embarcações. Barra de escala = 50 ÿm.

Estas diferenças na coloração para vWF e VEGF entre os grupos Hershey et al., 2001, 2003). É possível que o gelo tenha exercido um efeito maior no
de gelo e simulação foram acompanhadas por menor volume de volume do vaso do que na angiogênese. Nossos achados contrastam com pesquisas
vasos aos 3 e 7 dias após a lesão, conforme medido por micro-CT anteriores que mostram que a perfusão do músculo esquelético com solução salina
com contraste (Figura 13A). Como não foi possível avaliar a fria a 8ÿC restaura a densidade capilar funcional e o diâmetro da vênula 1 dia após a

densidade capilar nesses momentos, é difícil comparar os cursos lesão (Schaser et al., 2006, 2007). Nossos resultados não são diretamente comparáveis
de tempo da angiogênese e do crescimento dos vasos colaterais, com esta outra pesquisa porque avaliamos medidas estáticas de angiogênese,
conforme avaliado pelo volume do vaso. Outros relataram enquanto Schaser et al. mediu mudanças na dinâmica microcirculatória no músculo

diferenças no curso da angiogênese e no crescimento de vasos usando microscopia intravital

colaterais no músculo esquelético após isquemia dos membros posteriores (Ito et al., 1997;

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 9 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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FIGURA 9 | Dados quantitativos para a área de coloração positiva para CD34 (A), vWF (B), VEGF (C) e nestina (D). Os dados são apresentados como uma percentagem relativa à
área total de tecido muscular dentro do campo de visão. Os dados são média ± DP, n = 6 ratos por grupo, e são expressos como uma diferença de vezes relativa aos ratos de
controlo não lesionados. Principais efeitos para CD34: efeito de tempo (P < 0,001), efeito de grupo (P < 0,001) e interação grupo x tempo (P < 0,001). Principais efeitos para o FvW: efeito
de tempo (P < 0,001), efeito de grupo (P = 0,63) e interação grupo x tempo (P < 0,001). Principais efeitos para VEGF: efeito de tempo (P < 0,001), efeito de grupo (P = 0,56) e interação
grupo x tempo (P < 0,001). Principais efeitos para a nestina: efeito de tempo (P < 0,001), efeito de grupo (P = 0,98) e interação grupo x tempo (P < 0,001). *P < 0,05 para teste t não pareado
vs. ratos controle não lesionados. #P < 0,05 para teste t não pareado vs. ratos tratados com simulação.

(Schaser et al., 2006, 2007). Sua avaliação também foi restrita a 1 dia A incubação de células endoteliais vasculares humanas sob
após a lesão. O gelo pode induzir diferentes efeitos na dinâmica condições “hipotérmicas” (ou seja, ÿ34ÿC) reduz sua capacidade de
microcirculatória do músculo nos dias e semanas após a lesão. formar tubos in vitro (Coassin et al., 2010; Takeyama et al., 2015). A
hipotermia também reduz significativamente a secreção de VEGF e a
Vários fatores ou mecanismos podem explicar porque o gelo atenuou expressão de mRNA pelas células epiteliais pigmentares da retina
e/ou atrasou a expressão de VEGF e vWF na regeneração do tecido (Coassin et al., 2010; Takeyama et al., 2015). Esses efeitos parecem
muscular. O gelo atrasa a proliferação de células satélites no músculo estar ligados ao menor metabolismo celular (Coassin et al., 2010;
danificado (Takagi et al., 2011), o que também pode explicar parcialmente Takeyama et al., 2015). Quando amputados, os membros isquêmicos
porque o gelo reduziu a expressão de VEGF e vWF no presente estudo. dos gatos ficam expostos à hipotermia, a depleção de ATP e fosfocreatina
A evidência para esta noção é que células satélites em proliferação e e a acidose tecidual são atenuadas (Osterman et al., 1984; Sapega et al.,
diferenciação estimulam células endoteliais vasculares humanas a 1988).
formar estruturas tubulares in vitro (Christov et al., 2007), possivelmente Os efeitos da hipotermia na produção de espécies reativas de
secretando VEGF e expressando HIF- 1ÿ (Rhoads et al., 2009). . O oxigênio (ROS) são variáveis (Rauen e de Groot, 2002; Alva et al., 2013b).
músculo esquelético expressa a proteína A do domínio do choque frio Algumas pesquisas demonstram que, quando aplicada isoladamente, a
(Saito et al., 2011). Esta proteína suprime a atividade do promotor VEGF hipotermia aumenta a produção de ERO pelas células epiteliais basais
e a secreção de VEGF pelas células musculares esqueléticas sob alveolares adenocarcinômicas (A549) (Sun et al., 2016) e induz a
condições normóxicas e hipóxicas (Saito et al., 2011) e suprime a peroxidação lipídica e diminui a concentração sanguínea de glutationa
formação de tubos pelas células endoteliais (Saito et al., 2011). Embora em ratos (Dede et al. , 2002). Por outro lado, muitos estudos relataram
não se saiba se o gelo influencia a expressão da proteína A do domínio que, quando aplicada após lesão, a hipotermia reduz a formação de ERO
do choque frio no músculo esquelético, é possível que esta proteína em células neuronais (Gao et al., 2014, 2016), células adrenais PC12
possa ter sido parcialmente responsável pela redução/retardo da (Hasegawa et al., 2009), tecido cerebral (Maier et al., 2009), tecido
expressão de VEGF e vWF no presente estudo. cerebral (Maier et al., 2016). ., 2002; Horiguchi et al., 2003; Lv et al., 2016)
tecido hepático e sangue (Alva

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 10 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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FIGURA 10 | Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica para anticorpo vWF para identificar células endoteliais no tecido muscular. Grupos
simulados (A – C) e glacê (D – F) em 1, 3, 7 e 28 dias após a lesão. As setas indicam vasos maduros. Barra de escala = 50 ÿm.

FIGURA 11 | Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica com anticorpo VEGF. O tecido muscular foi obtido dos grupos sham (A) e glacê (B) 3 dias
após a lesão. As setas indicam vasos que expressam VEGF. As setas indicam macrófagos corados positivamente. Barra de escala = 50 ÿm.

e outros, 2013a). No músculo esquelético de ratos lesionados, evidências de que a hipóxia estimula a produção de ERO nas
o glacê diminui a formação de ânions superóxido, a peroxidação fibras musculares esqueléticas (Zuo e Clanton, 2005; Zuo et al., 2013b).
lipídica e a atividade da enzima antioxidante catalase (Merrick Os efeitos da hipotermia ou da crioterapia na produção de
EROoutras
et al., 1999; Carvalho et al., 2010). Estas descobertas contrastam com pelas células e tecidos podem, portanto, depender de vários fatores

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 11 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

FIGURA 12 | Imagens representativas da coloração imuno-histoquímica. O anticorpo Nestin foi usado para identificar células endoteliais no tecido muscular dos grupos
sham (A – D) e glacê (E – H) aos 1, 3, 7 e 28 dias após a lesão. As setas indicam células endoteliais coradas positivamente. Barra de escala = 50 ÿm.

incluindo a temperatura na qual as células e tecidos são tratados, a expressão de VEGF (e HIF-1ÿ) por células T98G (derivadas de
a extensão da isquemia e hipóxia que ocorre em resposta à glioblastoma multiforme humano) independentemente de
hipotermia ou crioterapia, e se esses tratamentos são aplicados alterações no consumo de O2 (Tanaka et al., 2010). Também
às células/tecidos isoladamente ou após lesão (Alva et al., 2013b; existem evidências de que a hipotermia aumenta a angiogênese
Zuo e outros, 2013a). Não medimos a formação de ERO no músculo na medula espinhal (Kao et al., 2011) e no cérebro (Kuo et al.,
no presente estudo, mas é tentador especular que o gelo pode ter 2010). Portanto, são necessárias mais pesquisas para compreender
reduzido a expressão de VEGF e vWF e o volume do vaso no os efeitos do gelo na produção de ERO e na angiogênese no
músculo esquelético, reduzindo a produção de ERO (Merrick et al., músculo esquelético após lesão.
1999; Carvalho et al., 1999; Carvalho et al., 1999; Carvalho et al., 1999; Carvalho
Medimos
et al.,
a expressão
1999; Carvalho
da nestina
et al. al.,
como 2010).
marcador de
No entanto, outras evidências indicam que a hipotermia suprime revascularização no músculo esquelético (Cizkova et al., 2009b).

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 12 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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FIGURA 13 | Dados quantitativos para volume de vasos (A) e número de miofibras em regeneração (B) no tecido muscular esquelético. Os dados são média ± DP. Os dados para o
volume do vaso foram obtidos de n = 4 ratos por grupo e são expressos como uma diferença de vezes em relação aos ratos de controlo não lesionados. Os dados para o número de
miofibras em regeneração foram obtidos de n = 6 ratos por grupo. Principais efeitos para o volume do vaso: efeito de tempo (P = 0,098), efeito de grupo (P < 0,001) e interação grupo x tempo
(P < 0,001). #P < 0,05 para teste t não pareado vs. ratos tratados com simulação.

A nestina foi detectada em células endoteliais (Mokry et al., 2004; mudança no volume do vaso no músculo após lesão. No entanto,
Cizkova et al., 2009b), pericitos (Birbrair et al., 2014) e vasos sanguíneos estes efeitos não foram suficientes para reduzir a densidade capilar
(Amoh et al., 2005) no músculo esquelético. Consistente com outras ou impedir a regeneração muscular eficaz. Aplicamos o tratamento
pesquisas (Vaittinen et al., 2001; Cizkova et al., 2009a,b), observamos com gelo em apenas um momento, logo após a lesão muscular. É
que a expressão de nestina foi maior na regeneração do tecido muscular possível que o congelamento mais frequente possa ter produzido
entre 3 e 7 dias após a lesão. Aos 3 dias após a lesão, parecia haver efeitos diferentes na inflamação, na angiogênese e na regeneração
forte coloração de nestina ao redor dos vasos sanguíneos (Figura 12), das miofibras. Também usamos apenas ratos machos. O gelo pode
sugerindo que a nestina era expressa por células endoteliais em ter produzido efeitos diferentes em ratas devido aos efeitos do
maturação (Cizkova et al., 2009b). Os pericitos também expressam estrogênio no decorrer do tempo e na dinâmica da regeneração
nestina, colocalizam-se com células endoteliais e capilares no músculo muscular (Enns e Tiidus, 2010). Pesquisas futuras poderiam
esquelético e contribuem para a angiogênese (Birbrair et al., 2014). examinar sistematicamente se a duração, o momento ou a
Descobrimos que o gelo atenuou ou atrasou a regulação positiva da frequência do tratamento com gelo influenciam a inflamação, a
expressão de nestina no músculo em regeneração. Considerando que a angiogênese e a regeneração do tecido muscular após a lesão.
nestina está envolvida na diferenciação de células endoteliais (Cizkova Também é interessante saber se o gelo influencia a expressão/
et al., 2009b), a supressão da expressão da nestina após o congelamento atividade de fatores antiangiogênicos, como endostatina e
também pode ter contribuído para a redução na expressão do vWF e no angiostatina, ou a liberação de fatores inflamatórios neurogênicos
volume do vaso que observamos. Não coramos duas vezes o tecido (por exemplo, bradicinina, fator de crescimento nervoso, peptídeo relacionado a
muscular para nestina e outro marcador de células endoteliais (por
exemplo, CD34, vWF) ou pericitos (por exemplo, NG2). Nem coramos o CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
músculo para miotubos, células de Schwann ou axônios, que também
expressam nestina (Cizkova et al., 2009b). Assim, não podemos DS, ZB, MW, TP, RS e JP conceberam o estudo. DS, ZB e RS
estabelecer definitivamente se a coloração de nestina que observamos realizaram os experimentos. DS, ZB, RS e JP analisaram e
representa apenas revascularização. interpretaram os dados. DS, ZB, MW, TP, RS e JP redigiram e
Descobrimos que o congelamento não alterou a área transversal revisaram o trabalho. DS, ZB, MW, TP, RS e JP aprovaram a versão
da miofibra aos 7 ou 28 dias após a lesão. No entanto, pareceu final. DS, ZB, MW, TP, RS e JP concordam em ser responsáveis
atrasar a maturação das miofibras, como indicado por um maior por todos os aspectos do trabalho, garantindo que questões
número de miofibras imaturas com núcleos localizados relacionadas à precisão ou integridade de qualquer parte do
centralmente aos 28 dias após a lesão (Figura 13B). Nossos trabalho sejam adequadamente investigadas e resolvidas.
achados contrastam com os de Takagi et al, que relataram que o
congelamento resultou em miofibras mais imaturas aos 14 dias FINANCIAMENTO
(mas não aos 28 dias) e menor área transversal das miofibras aos
28 dias após a lesão (Takagi et al., 2011). Essas diferenças podem Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Instituto de Saúde e
ser explicadas pela utilização de ratos mais jovens (8 semanas de Inovação Biomédica da Universidade de Tecnologia de Queensland.
idade) e indução de lesão por esmagamento do músculo extensor
longo dos dedos com pinça por 30 s no estudo de Takagi et al. AGRADECIMENTOS
Coletivamente, esses fatores podem ter resultado em diferentes
graus de lesão muscular e/ou taxa de reparo muscular entre os estudos, o que, por sua
Agradecemos vez,
aos pode ter influenciado
funcionários a eficácia Research
do Central Analytical do tratamento com gelo.
Em conclusão, o gelo atenuou ou atrasou a infiltração de células Facility (Histologia), Institute for Future Environments, Queensland
inflamatórias, a expressão de fatores pró-angiogênicos e University of Technology por sua assistência neste trabalho.

Fronteiras em Fisiologia | www.frontiersin.org 13 Março 2017 | Volume 8 | Artigo 93.º

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Singh et al. Lesões musculares esqueléticas e de gelo

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inibe a angiogênese induzida por opiáceos e VEGF: papel da transativação do de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution (CC
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