Microscopia

MICROSCOPIA

 Ciência que estuda os métodos e as

aplicações em que se usa o Microscópio
para observação de objetos, ou
pormenores de objetos, com dimensões
inferiores ao limite de resolução do olho
humano (0,1 mm).
 Quais os tipos de microscópio?
 De luz (ML) / óptico (campo claro)
Modificado (variações) com propósitos especiais

 Contraste de fase  Invertido

 Polarização  Fluorescência

 Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de

elétrons
 Microscópio eletrônico de transmissão (MET)
 Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
 Classificação dos Microscópios em
função do número de sistemas de lentes:

 Microscópio simples ou Lupa – apenas

possui uma lente ou um sistema de lentes
centradas;

 Microscópio composto – possui dois

sistemas de lentes centradas, ocular e
objetiva, para produzir uma imagem
ampliada
Classificação dos Microscópios compostos em
função do princípio de iluminação que utiliza

 Fotônico – em que o responsável pela

transmissão de imagem é um feixe de
fotões (luz visível, ultravioleta ou infra-
vermelho).

 Eletrônico – emprega um feixe de eletrões

para produzir imagens ampliadas.
A História do
Microscópio
 Robert Hooke, estudioso
inglês, foi o primeiro (em 1665)
a observar células. Para tal
valeu-se de um rudimentar
microscópio, idealizado anos
antes por um outro estudioso,
Anthony Van Leeuwenhoeck.

 Hooke observou cortes finos

de cortiça, que se
apresentavam ao microscópio
com um aspecto similar a
pequenos favos de mel
empilhados. A cada um destes
favos Hooke atribuiu a
designação de cellulae
(células).
 A história do
microscópio óptico
começa na
antiguidade clássica,
com a lente de
aumento simples, e
apresenta um
“renascimento” no
séc. XVII.
 Cerca de dez anos mais tarde o próprio
Leeuwenhoeck observou pequenos seres vivos,
que designou por “protozoários”, aos quais mais
tarde foi dada a designação de bactérias.
 Assim, à medida que se dava a evolução do
microscópio óptico, também o conhecimento da
constituição dos diferentes organismos ia
evoluindo.

 A ciência atravessava uma fase de grande

desenvolvimento, que viria a culminar no
séc. XIX.

 Durante todo este período a preocupação dos

homens da ciência centrava-se não só no
aperfeiçoamento dos sistemas ópticos, mas
também na evolução das técnicas inerentes à
preparação do material para observação.
 Em meados do nosso século, o aparecimento do microscópio
eletrônico e, mais recentemente, do microscópio confocal laser,
associados a sistemas computadorizados de análise de imagem,
contribuíram para o avanço da biologia celular e molecular,
continuando assim o conhecimento iniciado por Hooke.

Adaptado de Gonçalves et al, 2002

MOC – Microscópio Óptico Composto
MET – Microscópio Eletrônico de Transmissão
MOC
Microscópio Óptico Composto
Como Funcionam o Microscópio Ópticos

Formado por:

 Fonte luminosa → luz branca

(lâmpada com filamento de
tungstênio)

 Óptica → lentes
ampliação
condensação
 Mecânica

 Sistema de iluminação
 Como Funcionam o Microscópio Ópticos
 Fonte luminosa: Trajeto da luz

Fonte de luz → Lentes

O posicionamento estratégico das lentes no microscópio

proporcionam a formação de uma imagem Invertida
Como Funcionam o Microscópio Ópticos
 Oculares

Composto pelas lentes

oculares, que ficam próximas
ao olho do observador e na
qual se projetam as imagens.
Ampliam a imagem fornecida
pelo sistema de objetivas.
Canhão ou tubo

Serve de
suporte ao
sistema ocular
Braço

Serve de
suporte à
platina e ao
revólver.
Revólver

Serve de suporte às
objetivas e permite
a sua mudança.
 Objetivas

São lentes objetivas, as

mais importantes ao
microscópio,
responsáveis pela
formação da imagem.
Amplia a imagem do
objeto que está a ser
observado.
Objetivas

4x = Vermelha 40x = Azul claro

10x = Amarela 100x = Preta/ branca
Platina

Serve de suporte à
preparação a observar.
Tem uma abertura na
pane central (janela da
platina).
Condensador

Distribui regularmente no
campo da preparação a
luz que atravessa o
diafragma
Diafragma

Regula a intensidade
da luz captada pelo
espelho e que incide
na preparação.
Fonte de Luz
Parafusos Macrométrico e
Micrométrico

Permite movimentos (de

maior ou menor amplitude)
de aproximação ou
afastamento entre a
preparação e as objectivas.
Base ou pé Constitui a base
de suporte de
todos os
elementos do
microscópio.
 Como Funcionam o Microscópio Ópticos

A luz, após ser concentrada no

condensador, atravessa o objeto em
observação, passa pelas lentes da
objetiva e da ocular e chega ao olho
do observador como uma imagem
ampliada.

Multiplicando o aumento fornecido pela objetiva, calculamos o valor

final de observação.

Por exemplo: Se empregarmos uma ocular de 10x e uma objetiva

de 40x, o valor final da ampliação será de 400x.
Os microscópios modernos fornecem aumentos médios entre 100x
e 1.500x. Se um objeto que mede 0,01mm de diâmetro (invisível ao
olho nu) for ampliado 1.000x, sua imagem ampliada terá 10mm
(1cm) e poderá ser visualizada.
Poder de Resolução e Limite de Resolução
 Técnicas de Visualização
TÉCNICA A FRESCO
 Observação in vivo (exame a fresco)

Técnica relativamente simples. O material é colocado sobre a

lâmina e lamínula observado.

Utilizada frequentemente para se observar células vegetais vivas.

Fixação das células
Técnica utilizada para evidenciar detalhes internos das células. Nesse
caso, o material tem que passar por diferentes tratamentos antes de ser
observado.

Geralmente o primeiro tratamento é a fixação, que consiste em matar

rapidamente as células, preservando o máximo de sua estrutura interna.

Para obter esse efeito, costuma-se mergulhar as células em

líquidos fixadores (álcool, formol, ácido acético, etc)
 Coloração das células
As estruturas celulares mesmo fixadas apresentam baixo contraste

Técnicas de realce das estruturas foram desenvolvidas, através da

coloração de certas estruturas celulares.

Após fixadas, as células são mergulhadas em corantes

citológicos. Os corantes tem afinidade por certas estruturas da
célula.

Após a coloração, a amostra é lavada e observada ao microscópio.

As estruturas coradas destacam-se das demais, permitindo a sua
visualização.
 Fixação e coloração das células
 Coloração das células

Uma técnica bem comum é a coloração com hematoxilina (azul-

arroxeado) e eosina (alaranjado).

Hematoxilina tema afinidade com o núcleo celular e pouca afinidade

com o citoplasma.

A eosina tem grande afinidade pelo citoplasma celular.

 Também é possível observar células a fresco com
coloração.

Corantes especiais como o azul de metileno penetram na

célula e evidenciam suas estruturas sem matá-la.
  Esfregaço
Técnica utilizada para material biológico com células isoladas
ou pouco unidas entre si.
O esfregaço de sangue, também conhecido como distensão
sanguínea ou ainda extensão sanguínea.

Evita que as células fiquem

empilhadas e permite serem
observadas isoladamente.
 Esmagamento

Técnica utilizada para células frouxamente associadas, como as

partes moles de tecidos vegetais e animais.

O material geralmente já fixado e corado é colocado entre uma

lâmina e uma lamínula de vidro e esmagado pela pressão suave do
dedo polegar.

Em alguns casos, pode-se aquecer previamente o material para que

as células se separem com mais facilidade.
 Corte manual

Quando o material biológico

tem células firmemente
unidas entre si, é necessário
cortá-lo em fatias bem finas,
denominadas:

Cortes histológicos
 Inclusão e corte com micrótomo

O estudo microscópico detalhado das células requer que elas

sejam cortadas em fatias muito finas. Por isso, são submetidas a
tratamentos e procedimentos que facilitam o corte.

O mais comum é chamado de inclusão. Neste, o material é

mergulhado é uma substância líquida que depois endurece,
preenchendo-o e envolvendo-o completamente.

A substância mais comumente utilizada é a parafina. Quando o

material fica solidificado dentro do molde, pode ser cortado em
fatias bem finas, com uso do micrótomo.
 Inclusão e corte com micrótomo
 Inclusão e corte com micrótomo
  Fracionamento celular por centrifugação

Essa técnica envolve a maceração das células e sua

homogeneização. Em seguida, o homogeneizado celular é
submetido a centrifugação.

De acordo com a velocidade de aceleração da centrifugação,

determinadas partes da célula são separadas. Por exemplo, os
núcleos celulares são separados a uma força de 600 g.

O líquido sobrenadante é colocado novamente para centrifugar

para separação de outras organelas, a outra velocidade. As
mitocôndrias, por exemplo, são separadas a 20.000 g
 Fracionamento celular por centrifugação