Introdução:
A atividade laboratorial “Genes que brilham” foi realizada, no âmbito da
disciplina de biologia, nas instalações da Escola Superior de Biotecnologia da
Universidade Católica Portuguesa do Porto.
Esta atividade laboratorial teve como objetivo efetuar a transformação
de bactérias E. coli competentes (capazes de receber DNA exógeno) para
produzirem a proteína GFP (Green Fluorescent protein), naturalmente
sintetizada pela medusa bioluminescente Aequorea victoria. Isto teve como
finalidade a exibição de fluorescência, de cor verde, característica da medusa,
pelas bactérias quando colocadas sob a luz ultravioleta. Esta ocorrência é
provocada pela transformação genética envolvendo a inserção do gene
codificante da GFP do DNA da medusa no genoma das bactérias através do
plasmídeo pGLO.
Fundamentação:
Para a realização da transformação bacteriana foi utilizado o plasmídeo
pGLO. Um plasmídeo é um segmento circular de DNA, mais pequeno
que o cromossoma bacteriano, que se encontra nas bactérias, e que
contém genes para uma ou mais características.
A sequência de pGLO do plasmídeo utilizado foi modificada de modo a
conter certos genes que permitissem a expressão da proteína GFP no
fenótipo da bactéria; estes genes podem ser representados pelo seguinte
esquema:
Legenda:
araC: sistema de regulação de genes que
requer o açúcar arabinose para induzir a
expressão de GFP
GFP: gene que codifica a proteína verde
fluorescente
bla: gene codificante da proteína que fornece
às bactérias resistência ao antibiótico
ampicilina.
O plasmídeo incorpora um sistema de regulação de genes, o AraC,
responsável pela regulação da síntese das enzimas que digerem a arabinose
(monossacarídeo utilizado como fonte de energia pelas bactérias). Contudo,
os genes codificantes destas enzimas foram substituídos pelo gene GFP,
resultando na indução da transcrição deste gene na presença de arabinose.
Sendo assim, o AraC é bastante importante no procedimento uma vez que
permite o controlo da expressão da proteína de interesse (proteína GFP).
O gene que oferece à bactéria resistência ao antibiótico ampicilina (bla)
permite selecionar as bactérias que contêm o plasmídeo pGLO uma vez que,
posteriormente, as bactérias vão ser colocadas em meios de cultura LB
contendo ampicilina, sobrevivendo somente aquelas que têm resistência ao
antibiótico, ou seja, as que possuem no seu genoma o pGLO. Estas bactérias
são denominadas por bactérias transformantes e são estas que apresentam
cor verde fluorescente quando expostas luz ultravioleta.
Procedimento:
O procedimento é constituído pela preparação das placas de Petri
iniciais e pela transformação genética das bactérias E. coli. Como o
procedimento tem como duração um período superior a 2 horas (tempo
estipulado para a realização da atividade laboratorial), a preparação das
placas de Petri iniciais foi executada previamente pelo professor para que nos
fosse possível realizar a transformação genética. Sendo assim, só nos foi
atribuída a tarefa da transformação das bactérias E. coli, tendo como
procedimento:
1. Etiquetar um microtubo com +pGLO e outro com –pGLO e também
com o nome/número do grupo;
2. Com uma micropipeta transferir 250 μl da solução de transformação
(CaCl2) para cada tubo;
3. Colocar os tubos em gelo;
4. Com uma ansa de inoculação, recolher uma única colónia de
bactérias provenientes da placa inicial e colocá-la no tubo +pGLO;
agitar até que toda a colónia fique dispersa na solução de
transformação. Colocar, novamente, o tubo no gelo e repetir o processo
para o tubo – pGLO;
5. Mergulhar uma ansa de inoculação esterilizada no tubo com o plasmídeo
pGLO. Misturar o plasmídeo da ansa na suspensão de células do tubo
+pGLO. Fechar o tubo e voltar a colocá-lo no gelo. (Não adicionar o
plasmídeo no tubo –pGLO);
6. Incubar os tubos no gelo durante 10 minutos;
7. Enquanto os tubos estão no gelo, marca as placas de Petri com agar
(marcar as placas por baixo) da seguinte forma:
a) Placa 1: (+pGLO) LB/amp
b) Placa 2: (+pGLO) LB/amp/ara
c) Placa 3: (-pGLO) LB/amp
d) Placa 4: (-pGLO) LB
8. Choque térmico.
e –pGLO para um banho-maria a 42ºC, durante 50 segundos exatos.
Passados os 50 segundos volta a colocar os tubos no gelo. Incubar os
tubos no gelo durante 2 minutos. (Para que os resultados da
transformação sejam bons a transferência do gelo para os 42ºC e
novamente para o gelo deve ser rápida.);
9. Remover o suporte com os tubos do gelo e coloca-los na bancada.
Usando uma pipeta esterilizada, adiciona 250 μl do caldo de nutrientes LB.
Repetir o mesmo para o outro tubo com uma nova pipeta. Incubar os
tubos durante 10 minutos à temperatura ambiente;
10. Dar pancadinhas no tubo com os dedos para misturar a solução.
Usando uma pipeta esterilizada, colocar 100 μl das suspensões de
transformação e controlo nas placas apropriadas;
11. Espalhar as suspensões pela superfície do meio, usando uma ansa de
inoculação esterilizada para cada placa. (não fazer muito pressão para
não furar o meio);
12. Colocar as placas numa estufa a 37ºC durante 18 a 24 horas.
13. Leitura das placas com exposição à luz ultravioleta.
Registos/resultados:
Os resultados obtidos estão apresentados na imagem que se encontra a
seguir:
Placa 1:
(+pGLO) LB/amp Placa 2: (+pGLO) LB/amp/ara
Placa 3: (-
pGLO) LB/amp Placa 4: (-pGLO) LB
Discussão dos resultados:
Nesta atividade experimental foram utilizadas 4 placas de agar, com
composições e intuitos diferentes. Enquanto que três delas representam
placas de controlo (placa 1, placa 3 e placa 4), a segunda é a placa
experimental.
Na placa 1, as bactérias que não foram capazes de incorporar o
plasmídeo não sobreviveram visto que não possuíam o gene de
resistência ao antibiótico. Assim sendo, foram obtidos resultados expectáveis
porque existiu seleção das bactérias transformantes, ou seja, apenas aquelas
que incorporaram o plasmídeo pGLO sobreviveram.
Relativamente à placa experimental (placa 2), podemos afirmar que se
obteve os resultados esperados, sendo estes a emissão de fluorescência
quando a placa é exposta à luz UV. Visto que a emissão de fluorescência
verde é uma característica conferida pela proteína GFP, só se verifica a
fluorescência quando existe expressão de GFP. Assim, confirma-se a
presença desta proteína na placa se houver emissão de fluorescência
verde. Conclui-se que a arabinose induziu a expressão de GFP, visto que a
única variável entre esta placa e a placa 1 é a presença/ausência de
arabinose.
Quanto à placa 3, os resultados os esperados visto que a colónia de
bactérias não sobreviveu porque não tinha resistência ao antibiótico
ampicilina, característica conferida pelo pGLO, que não foi introduzido no
genoma das bactérias desta colónia.
Na placa 4, pode-se observar proliferação de colónias bacterianas em
linhas, resultado da inoculação com a ansa, e, portanto, todas as bactérias
adicionadas no meio inicialmente passaram pelo crescimento, não havendo
seleção pois as bactérias não foram expostas ao antibiótico ampicilina.
Conclusão:
Embora os resultados obtidos não tenham sido produto do nosso
procedimento devido à sua duração, todos foram expectáveis o que indica
que o procedimento foi executado com eficácia. Com efeito, conseguimos
relacionar os resultados com a fundamentação teórica.
Reconhecemos que esta técnica de transformação genética de
bactérias com DNA plasmídico possui diversas aplicações e é amplamente
usada no âmbito da biotecnologia e obtivemos prática laboratorial na
execução do procedimento.
Concluímos que foi uma atividade didática e esclarecedora e
agradecemos a disponibilidade da Universidade em nos receber.
Bibliografia:
[Link]
resources?ID=NISQOC15
[Link]
Resumo - atividade laboratorial: Genes que brilham
PGLO: O plasmídeo pGLO é um plasmídeo projetado usado em biotecnologia como
vetor para a criação de organismos geneticamente modificados. O plasmídeo contém
vários genes repórteres, mais notavelmente a proteína verde fluorescente e o gene de
resistência à ampicilina. A GFP foi isolada da medusa Aequorea victoria.
O plasmídeo pGLO da Bio-Rad contém sequências de DNA que permitem sua
replicação e expressão da característica fluorescente (fenótipo) em bactérias após a
transformação.
Bactéria competente - é uma bactéria apta a receber DNA exógeno.
Dois métodos podem ser utilizados para a transformação: a técnica do choque térmico,
que consiste na preparação das células, para torná-las competentes, através do
tratamento das mesmas com cloreto de cálcio ou outro íon bivalente (cloreto de lítio
ou magnésio). Os íons atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do
DNA. Após um choque térmico na temperatura de 37º a 42ºC, criam-se poros na
membrana deixando-a mais fluida e assim o acesso do DNA ao interior da célula é
facilitado.
Solução transformação: Entres os métodos mais utilizados para tornar as
bactérias competentes está aquele que utiliza cloreto de cálcio. Considerando a
abundância de cargas negativas na membrana celular e no DNA, procede-se à
incubação numa solução de CaCl, onde os catiões divalentes (Ca2+), vão ocultar
as cargas da membrana, diminuindo as repulsões entre as cargas negativas,
facilitando a atração eletrostática com as moléculas do DNA na zona de adesão (locais
onde as membranas internas e externas se unem, formando poros, apenas durante o
crescimento exponencial). Posteriormente é ainda aplicado um choque térmico que
complementa este processo de captação que, através de um desequilíbrio térmico entre
o interior e o exterior da bactéria, auxilia a passagem do DNA pela zona de adesão.
Bactérias [Link]: Na realização desta atividade laboratorial transformaram-se
bactérias E. coli, dado o vasto conhecimento sobre esta espécie, o seu rápido
crescimento e a transformação e expressão proteica em níveis favoráveis.
Meio LB: O Meio LB (Luria Bertani) é um meio desidratado utilizado para
manutenção e cultivo de cepas recombinantes de Escherichia coli em procedimentos
de Biologia Molecular.
AraC: Genes reguladores que codificam a proteína receptora do AMP cíclico para
utilização da L-arabinose na E coli. É um exemplo de controle positivo ou de
regulação da expressão gênica no operon bacteriano.
Gene que codifica para a AraC, uma proteína que regula a produção de GFP.
Bla: O gene bla, quando expresso, codifica para a resistência à ampicilina produzindo
beta-lactamase, enzima cuja função é inativar a ação dos antibióticos, como a
penicilina. A sua expressão só é possível graças à composição do meio nutritivo:
hidratos de carbono, aminoácidos, nucleótidos, sais minerais e vitaminas.
Gene que codifica para a beta-lactamase, uma proteína que dá às bactérias resistência
à ampicilina.
As bactérias transformantes apresentarão fluorescência verde, à radiação UV,
nas placas em que a arabinose esta presente no meio e cor branca nas placas
em que a arabinose está ausente. Para a seleção das bactérias transformantes estas são
colocadas em meios contendo ampicilina. Neste meio, apenas as bactérias
transformantes sobrevivem, uma vez que têm incorporado no DNA plasmídico o gene
que codifica para a resistência a este antibiótico. Por sua vez, as bactérias não
transformadas não serão capazes de sobreviver.
Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC): separa as moléculas com base nas
diferenças em sua hidrofobicidade de superfície.
Discussão de resultados: Durante a elaboração desta atividade experimental foram
utilizadas 4 placas de agar, com composições e intuitos diferentes. Enquanto que três
delas representam placas de controlo (figuras 2, 3 e 4), a quarta é a placa experimental
(figura 5)
No passado dia 10 de novembro, no âmbito da disciplina de Biotecnologias e
Estrutura Química dos Alimentos, os alunos do 12.º ano do curso de
Tecnologias e Segurança Alimentar realizaram , com o objetivo de realizarem
atividades de implementação de técnicas da biotecnologia, nomeadamente, a
transformação bacteriana com genes de medusa (Aequorea victoria).
Untitled_A atividade realizada denominava-se “Genes que brilham’’ e tinha
como principal finalidade transformar a bactéria Escherichia coli, de modo a
que esta obtivesse a fluorescência, de cor verde, característica da medusa
Aequorea victoria. Esta transformação foi obtida através da transferência do
gene, que condiciona esta fluorescência, do ADN da medusa para a bactéria.
Esta técnica de transferência de genes é hoje muito utilizada, como por
exemplo para a produção de insulina humana por transformação bacteriana.
Esta atividade laboratorial teve como objetivo efetuar a transformação
de bactérias E. coli competentes (capazes de receber DNA exógeno) para
produzirem a proteína GFP (Green Fluorescent protein), naturalmente
sintetizada pela medusa bioluminescente Aequorea victoria. Isto teve como
finalidade a exibição de fluorescência, de cor verde, característica da medusa,
nas bactérias provocada pela transferência do gene codificante da GFP do
DNA da medusa para o genoma das bactérias através do plasmídeo pGLO.
A transformação bacteriana foi realizada através da incubação das
células numa solução transformação de cloreto de cálcio (CaCl), onde os
catiões Ca2+ vão diminuir as repulsões entre as cargas negativas, facilitando
a atração eletrostática com as moléculas de DNA na zona de adesão ( locais
onde as membranas internas e externas se unem, formando poros ). De seguida, é aplicado
um choque térmico que complementa o processo de captação do pGLO pelas
bactérias, que, através de um desequilíbrio térmico entre o interior e o exterior
da bactéria, auxilia a passagem do DNA pela zona de adesão
Para terminar este procedimento é realizada a purificação da GFP por
cromatografia de interação hidrofóbica pela razão desta proteína ser
hidrofóbica, devido à sua constituição rica em aminoácidos hidrofóbicos, em
contraste com as outras proteínas bacterianas.
Procedimento:
Como o procedimento tem como duração um período superior a 24 horas, o
procedimento foi realizado previamente pelo professor para que fosse possível a
análise dos resultados. Sendo assim, só nos foi atribuída a tarefa da transformação das
bactérias E. coli, tendo como procedimento:
Transformação:
1) Rotular dois microtubos fechados um com +pGLO e outro com -pGLO;
2) Abrir os microtubos e transferir com uma pipeta estéril de 250µl solução de
transformação (CaCl2) para cada microtubo;
3) Colocar os microtubos em gelo durante 5 minutos;
4) Usar uma ansa de inoculação estéril para recolher 2 a 4 grandes colónias de
bactérias da placa de Petri;
a) Selecionar as colónias com maior diâmetro (1-2mm), sendo importante
recolher colónias individuais e escolher apenas colónias de bactérias
circularmente uniformes com limites definidos.
b) Submergir a ansa na solução de transformação que se encontra no microtubo
+pGLO.
c) Agitar a ansa entre o dedo indicador e o polegar até que a colónia esteja
dispersa na solução de transformação.
d) Voltar a colocar no gelo e repetir o procedimento com uma nova ansa para
o microtubo -pGLO.
5) Pipetar 10µl de pGLO plasmídeo para o microtubo de +pGLO e misturar. Não
adicionar no microtubo –pGLO. Fechar os microtubos e colocá-los em gelo.
6) Encubar os microtubos em gelo durante 10min;
7) Enquanto os microtubos estão no gelo, rotular placas de LB agar com as seguintes
legendas:
8) Choque térmico: Usar um suporte para os microtubos para transferir tanto o
+pGLO, como o -pGLO para um banho de 42ºC, durante exatamente 50 segundos.
Verificar a temperatura do banho com um termómetro. Após os 50 segundos voltar a
colocar os microtubos no gelo, durante 5 minutos.
9) Remover os microtubos do gelo. Usando um pipeta estéril, adicionar 250µl de LB a
cada um dos microtubos (+pGLO e -pGLO) e incubar a temperatura ambiente durante
10min.
10) Agitar gentilmente com o dedo os microtubos fechados para misturar e
ressuspender a bactéria. Usar uma nova pipeta esterilizada para pipetar 100µl de cada
microtubo para as placas de agar apropriadas:
11) Usar novamente uma ansa para cada placa para espalhar igualmente a suspensão
por toda a superfície do LB agar;
12) Empilhar as placas, uni-las com fita-cola e armazena-las até ao dia seguinte de
modo a que cultura fique virada para baixo, numa incubadora a 37ºC.
Purificação:
