COLORAÇÃO DE GRAM
1. Introdução
A coloração Gram, ou bacterioscopia, permite classificar as bactérias de acordo com suas
características morfológicas e tintoriais. Esse teste serve para um diagnóstico presuntivo
rápido de um agente infeccioso e para uma avaliação da qualidade da amostra. A coloração de
Gram diferencia as bactérias com base nas características de suas paredes celulares. As
bactérias Gram-positivas possuem uma parede espessa de peptidoglicano e grandes quantidades
de ácido teicoico, os quais retêm o corante inicial (cristal violeta), não sendo afetado pelo
passo de descoloração com álcool absoluto (ou álcool acetona). Dessa forma, as células apresentam ao
final da coloração uma cor azul/roxa. As Gram-negativas, por sua vez, possuem uma parede celular
constituída de uma camada fina de peptidoglicano, que permite a descoloração do cristal violeta com o
álcool absoluto (ou álcool acetona), e posterior coloração com o corante de fundo, a fucsina. Ao final do
processo, as bactérias Gram-negativas apresentam cor rosa/vermelha.
2. Objetivos
Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método
de coloração de Gram.
3. Materiais e métodos
Água
Álcool
Cristal violeta
Lugol
Safranina
Alça de Platina
Lâminas de vidro
Fucsina;
Pipetas de Pasteur
Suporte para coloração das lâminas
Placa com crescimento bacteriano: E.coli e S.aureus
Tubo de ensaio
Microscópio óptico
Bico de Bunsen
Utilizando-se da área estéril em volta do bico de Bunsen ou a capela de fluxo laminar,
retirar, com o auxílio da alça de platina, uma pequena porção da bactéria desejada (já
inoculada em placa petri).
Colocar uma gota de água destilada em um lâmina, esfregar a ponta da alça de platina
com a bactéria na gota, fazendo um círculo.
Secar a água com o auxílio do bico de bunsen.
Corar com Cristal violeta por 60 segundos.
Lavar com esguicho de água destilada
Corar com Lugol por 60 segundos.
Lavar com esguicho de água destilada.
Passar álcool acetona até que não haja mais desprendimento de corante.
Lavar com esguicho de água destilada.
Corar com fucsina por 30 segundos.
Lavar com esguicho de água destilada e esperar secar.
Visualize no microscópio. Logo após leia em objetiva de imersão (100 X).
Leitura e interpretação dos resultados
Os microorganismos roxos, eram gram-positivos (Staphylococcus aureus).
Os de coloração rosa com forma de bastonetes eram gram-negativos (Escherichia coli).
Essa diferença de cor ocorre, pois as bactérias gram-positivas possuem uma densa camada de
peptideoglicano em sua parede celular, enquanto as gram-negativas possuem uma fina camada
desse composto e uma membrana externa, constituída por lipopolisacarídeos. Ao corar as
bactérias com cristal violeta e lugol, o complexo de cristal violeta-iodo é absorvido por ambas,
porém, ao serem tratadas com álcool, as espessas paredes celulares das bactérias gram-positivas
são desidratadas, provocando a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as
impermeáveis ao complexo; enquanto a porção lipídica das membranas externas das bactérias
gram-negativas se dissolve, deixando o complexo ser removido. Ao corar ambas com a safranina,
as gram-negativas absorvem esse contracorante por estarem incolores, diferentemente das gram-
positivas, que não absorvem por já estarem coradas.
Conclusão
Concluiu-se que a atividade desenvolvida foi de extrema importância para o conhecimento
das bácterias gram positivas e gram negativas.
referências
Técnica de Coloração de GRAM. Ministério da Saúde Secretaria de Políticas de Saúde Programa Nacional de
DST e Aids. Brasília 2001.
MOREIRA, J. L. B. et al. Visualização bacteriana e colorações. Imprensa Universitária da Universidade
Federal do Ceará (UFC).
