A estrutura de DNA proposta por Watson e Crick não é a única existente na Natureza.

Outras formas podem ser criadas em

laboratório ou mesmo existirem em trechos do DNA nos seres vivos. O que há de comum entre todas estas formas?

No processo de replicação do DNA fita dupla, porque são formados os fragmentos de Okasaki e quais os possíveis mecanismos de
retirada dos primers de DNA nas suas extremidades 5’?

Sobre o esquema abaixo desenhe os 13 elementos em suas posições sobre o DNA e sobre o RNA, justificando cada localização em
sua folha de respostas. Entregue o esquema preenchido, assinado e com nome legível, junto com sua folha de respostas.

 Por que a presença de glicose no meio de cultura não permite a alta expressão do gene lacZ de Escherichia coli, mesmo quando há
lactose no meio de cultura? Qual o mecanismo molecular pelo qual isto ocorre? (use um esquema, se desejar, mas não deixe de
explicar o mecanismo por escrito).

 O esquema abaixo representa o trecho de DNA conhecido como sequência líder, do operon triptofano. Qual o significado de cada
elemento no desenho e como funciona o sistema para atenuar a expressão do operon? (empregue esquemas para cada situação, se
desejar, mas não deixe de explicar o mecanismo por escrito).

 
Qual a diferença fundamental entre uma biblioteca de cDNA e uma bilbioteca genômica? Suponha que a primeira seja feita em
plasmídeo, enquanto a segunda foi feita num fago. Como deverá ser a triagem, em cada caso, se seu objetivo é encontrar um gene
que codifica uma determinada proteína?
 
Descreva o princípio de sequenciamento de DNA pela técnica de interrupção de síntese pela incorporação de dideoxinucleotídeos,
supondo sequenciamento manual com precursores de DNA radiativos.
 
Você foi chamada(o) a estudar uma população de emas e determinar sua origem. Dois plantéis da espécie são suspeitos, um na
Paraiba e outro no Ceará. Que técnica você empregaria e por que?
 
A cor da pétala de uma certa flor de interesse comercial é determinada por um único gene. O alelo recessivo é muito raro e
diferencia-se do alelo dominante por um único par de bases, que elimina um sítio EcoRI da sequência do alelo dominante. Descreva
como você poderia estudar os portadores do alelo mutante entre populações selvagens empregando PCR/RFPL.
 
Num teste de paternidade, onde há certeza de que o filho em questão é realmente do casal estudado, o resultado obtido por PCR,
empregando 8 sistemas de STR (small tandem repeats), mostrou discordância em um deles, como mostrado abaixo:
 

 Descreva o princípio da técnica e  explique como poderia ter surgido o resultado em questão.

Exercícios na forma de múltipla escolha

 (gabarito ao final da série!)

1. As enzimas de restrição

a) Quebram ligações fosfodiester somente em posições opostas na fita dupla de DNA

b) Atuam especificamente sobre seqüências de bases com repetições em tandem.
c) Reconhecem sítios palindrômicos e retiram bases das duas fitas do DNA.
d) Ligam-se a sítios com espaçamento regular ao longo do DNA.
e) Clivam as duas fitas de DNA dentro de sítios palindrômicos.

 2. Os sítios de restrição

a) são mais frequentes em DNA viral.

b) são muito raros em DNA eucarioto.
c) ocorrem com uma frequência proporcional ao seu tamanho (em pb).
d) são tanto mais raros quanto maiores (em pb), em qualquer DNA.
e) podem conter trechos compostos pela repetição de uma única base.
 
  
3. Para  gerar com a enzima de restrição A fragmentos de DNA com tamanho maior do que os gerados com uma enzima B, como se
deve proceder? Por que?
 
a) A enzima A deve agir à temperatura mais baixa que a enzima B, porque assim vai reconhecer sítios de restrição com baixa
estringência e, consequentemente, com maior frequência, e portanto cortar o DNA em fragmentos maiores
b) A enzima B deve reconhecer sítios compostos de menor número de bases, porque desta forma os fragmentos gerados serão
menores.
c) A temperatura na qual a enzima A atua deverá ser necessariamente maior do que a que B atua, independente do tamanho do sítio
de restrição, porque a alta temperatura favorece a atividade enzimática e fará com que a enzima A corte com maior frequência e
gere fragmentos menores.
d) Não é possível produzir fragmentos de restrição de tamanhos médios distintos, porque os sítios para qualquer enzima de restrição
ocorrem ao acaso.
e) O sítio de restrição da enzima A deve ser maior do que o da enzima B, porque a probabilidade dele ocorrer no DNA alvo será
menor do que o da enzima B, o que implica que a enzima A cortará menos frequentemente que a enzima B.

 4. As enzimas de restrição cortam o DNA em sítios específicos, criando:

a) Sempre extremidades coesivas, com bases despareadas que tendem a formar ligações covalentes com outros fragmentos de DNA
cortados com a mesma enzima.
b) Extremidades cegas ou coesivas, que tendem a parear através de pontes de hidrogênio com extremidades complementares
geradas com as mesmas enzimas.
c) Sempre extremidades coesivas, com bases despareadas que tendem a formar ligações covalentes com outros fragmentos de DNA
cortados com a mesma enzima.
d) Extremidades cegas ou coesivas, tendendo as últimas a parear através de pontes de hidrogênio com extremidades
complementares geradas com as mesmas enzimas.
e) Sempre extremidades cegas, que se unem a outras do mesmo tipo pela ação da ligase.

 5. Um plasmídeo de clonagem qualquer deve ter pelo menoscertas características, resumidas abaixo, que facilitam a clonagem e
permitem avaliar a qualidade das bibliotecas genômicas com ele construídas. São elas:

a) Um sítio de restrição único para determinada enzima, localizado na ORF de um gene de resistência a uma droga A, um segundo
gene para resistência a uma droga B e uma origem de replicação.
b) Um promotor 5’ do inserto, um origem de replicação e um gene de resistência a droga.
c) Um trecho de DNA fita simples que possa parear com o cDNA a ser inserido, dois genes de resistência a droga e uma origem de
replicação.
d) Um sítio múltiplo de restrição (MRS ou poly-linker), uma origem de replicação e um gene de resistência a drogas cuja ORF deve
conter o MRS.
e)  Um promotor e um RBS, 5’ do inserto, que deve ser precedido de um códon ATG plasmidial, uma origem de replicação e um
gene de resistência a drogas.

 6. A qualidade de uma biblioteca genômica é avaliada pela proporção de plasmídeos vazios (isto é, sem insertos), entre o conjunto
de plasmídeos da biblioteca. Isto é feito:
a) Através do uso de sondas que reconhecem apenas o gene de resistência não interrompido pelo inserto e hibridizam com o DNA
plasmidial em membrana de nylon.
b) Através do uso de sondas que reconhecem apenas o gene de resistência interrompido pelo inserto e hibridizam com o DNA
plasmidial em membrana de nitrocelulose.
c)  Com o auxílio de PCR/RFLP, que detecta a perda dos sítios de restrição do MRS empregados na clonagem quando o inserto está
inserido.
d) Com o auxílio de plaqueamento de uma alíquota da biblioteca em meio contendo o antibiótico cuja resistência está determinada
pelo gene que contem o MRS (ou poly-linker), seguido de réplica em meio contendo o segundo antibiótico cuja resistência está
determinada pelo plasmídeo.
e) Com o auxílio de plaqueamento de uma alíquota da biblioteca em meio contendo o antibiótico cuja resistência está determinada
pelo gene que não contem o MRS (ou poly-linker), seguido de réplica em meio contendo o segundo antibiótico cuja resistência está
determinada pelo plasmídeo.

 7. A triagem (screening) de uma biblioteca genômica costuma empregar:

 a) Anticorpos que reconhecem proteínas recombinantes produzidas pela célula hospedeira, fixando-se sobre as colônias em placas
contendo meio nutriente sólido.
b) Sondas de DNA que hibridizam com o inserto do plasmídeo, em membrana de nylon obtida como réplica de placa de Petri
contendo colônias de bactérias.
c) PCR de colônia e análise das sequências dos produtos.
d) Clivagem do inserto de cada colônia por enizmas de restrição e análise do tamanho do fragmento em gel (northern blot).
e)  Sondas de RNA que hibridizam com os mRNAs produzidos pelas colônias e que foram previamente capturados por blot em
membrana de nylon.

8. Duas bibliotecas genômicas de excelente qualidade foram construídas no mesmo vetor, com as mesmas enzimas de restrição,
mas provenientes uma de tecido epitelial de feto humano e a outra de baço de um paciente com esquistossomose mansônica.
Podemos afirmar que:
 
a) As duas bibliotecas contêm essencialmente o mesmo conjunto de genes, porque no processo de construção delas as regiões
intergênicas foram eliminadas.
b) A biblioteca de baço conterá necessariamente genes do parasita Schistosoma mansoni.
c) As duas representam da mesma forma o genoma do ser humano.
d) A biblioteca de baço é maior que a do epitélio fetal, por se tratar de um indivíduo adulto.
e) A biblioteca de epitélio fetal é maior do que a de baço, pois um maior número de genes expressos ocorre no tecido em
diferenciação.

9. Sobre o passo 2 da figura 1 podemos afirmar :

a) O primer poli-T anela com a extremidade 5’ do mRNA.

b) A DNA polimerase I copia o mRNA e faz a primeira fita (cDNA).
c) O tamanho do cDNA dependerá do momento em que a transcriptase reversa encerrar seu trabalho
d) A extremidade 3’ do cDNA recém-sintetizado deverá necessariamente conter o códon ATG de iniciação da síntese proteica do
eucarioto.
e) Haverá sempre ao menos um trecho da ORF original do mRNA eucarioto copiado em DNA.

10. Sobre o passo 5 da figura 1 podemos afirmar:

a) As sequências repetidas nas extremidades da fita dupla de DNA representam as regiões teloméricas do cromossoma
b) As sequências repetidas nas extremidades da fita dupla de DNA são adaptadores para uma enzima de restrição, adicionados após
a síntese da segunda fita e colados ao DNA pela ligase.
c) As sequências repetidas nas extremidades da fita dupla de DNA representam adaptadores para uma enzima de restrição,
sintetizados in vitro pela telomerase.
d) As sequências repetidas nas extremidades da fita dupla de DNA servirão para a clonagem bidirecional do cDNA
e) As sequências repetidas nas extremidades da fita dupla de DNA permanecem no DNA plasmidial depois da clonagem.

11. Numa biblioteca de cDNA construída em plasmídeo de expressão, a produção de proteína recombinante a partir do inserto

a) É rara porque poucos insertos representam genes expressos no organismo original

b) É rara porque as proteínas heterólogas são geralmente degradadas pelas proteases das hospedeiras.
c) Ocorre para todos os insertos, desde que a clonagem tenha sido unidirecional.
d) Ocorre para cerca de 30% dos insertos, desde que a maior parte dos clones contenha ORFs dos mRNAs originais e que a
clonagem tenha sido feita unidirecionalmente.
e) Ocorre em 1 clone a cada seis, em média, porque há 3 quadros de leitura possíveis e dois sentidos de inserção do cDNA nas
clonagens unidirecionais.

12. As bibliotecas de cDNA em geral

 
a) Representam todos os genes expressos em um organismo
b)  Representam todos os genes expressos em um tecido ou conjunto de células
c)   Representam o elenco de genes expressos pelo conjunto de células empregado na extração de mRNA.
d)   Representam o elenco de genes do conjunto de células empregado na extração de mRNA.
e)   Representam o elenco de genes expressos pelo conjunto de células empregado na extração de mRNA, no momento imediato
que antecedeu à extração do RNA mensageiro.

 13. A ausência de atividade revisora 3’-5’ da Taq polimerase in vitro implica

a)  Na presença constante de erros de sequência nos fragmentos de DNA gerados pela PCR, que leva à formação de bandas de peso
molecular discrepante, o que permite em geral a produção de uma banda relativamente espessa em gel de agarose ou mesmo duas
ou mais bandas de intensidades distintas.
b) Na possibilidade de que uma parte detectável (25% ou mais) de sequências amplificadas tenha uma base erroneamente copiada
do segmento de DNA original, desde que o erro de cópia tenha sido gerado nos primeiros dois ciclos da PCR.
c) Na incorporação de bases anômalas em pelo menos alguns fragmentos amplificados, o que leva  ao pareamento errôneo dos
primers e interrupção da reação de PCR.
d) Na necessidade de se fazer mais que 20 ciclos de amplificação, número suficiente em teoria para se alcançar 1 milhão de cópias
de DNA, prara compensar a não amplificação dos fragmentos de DNA com bases errôneas.
e) No insucesso da maior parte das reações de PCR.

 14. O ciclo térmico básico da PCR inicia-se a uma certa temperatura, prossegue para outra e finalmente vai para uma terceira,
quando então recomeça, por pelo menos 25 vezes. Quase estas temperaturas (na ordem descrita acima) e o que ocorre nelas?

 
a)  56oC – pareamento dos primers; 96oC – extensão de fita pela Taq; 72oC – desnaturação da fita dupla.
b)  96oC - desnaturação da fita dupla; 56oC – pareamento dos primers; 72oC – extensão de fita pela Taq
c)  96oC - desnaturação da fita dupla; 72oC – pareamento dos primers; 56oC – extensão de fita pela Taq
d)  72oC – pareamento dos primers; 56oC – extensão de fita pela Taq; 96oC - desnaturação da fita dupla.
e) 96oC - desnaturação da fita dupla; 72oC – extensão de fita pela Taq; 56oC – pareamento dos primers.

 15. Se a menor temperatura de um ciclo de PCR for reduzida de 56oC para 45oC, o que provavelmente ocorrerá? Por que?

a) A reação não se processará devido ao esgotamento dos primers através de hibridizações múltiplas não específicas
b) A banda observada no gel terá menor peso molecular porque a Taq polimerase trabalhará mais lentamente.
c) Outras bandas poderão aparecer no gel como resultado de hibridizações dos primers com novos sítios, com baixa estringência.
d)  A banda formada terá maior peso molecular devido à reação anômala da Taq polimerase, que incorpora resíduos de adenina a
baixa temperatura.
e) Não serão formadas bandas porque com a queda da temperatura abaixo de 50 oC o DNA se renatura por inteiro e impede a nova
hibridização de primers.

 16. Na figura 2 abaixo está representado o trecho de um plasmídeo de expressão típico, que permite também o sequenciamento do
DNA inserido. Do esquema pode-se inferir que:

a) (8) representa a 3´ UTR do procarioto.

b) (4) representa a sequência de Shine-Delgarno.
c)  (2) e (9) representam os sítios de restrição para as enzimas empregadas na clonagem.
d) (7) representa parte da ORF do cDNA eucarioto clonado
e) A parte mais escura do cilindro (15) representa o componente eucarioto da proteína quimérica.

 17. Ainda na figura 2 abaixo,  pode-se inferir que:

a) 0s fragmentos de DNA gerados pelo sequenciamento 3´ do trecho representado conterão quase sempre o trecho não traduzido do
cDNA eucarioto.
b) (12) contém apenas o trecho da ORF inicial do gene original do plasmídeo.
c)  (2), (3), (6) e (11) representam o promotor, o operador, o sítio para uma enzima de restrição empregada na clonagem e a região
terminadora da transcrição.
d) (13) representa aORF completa do cDNA eucarioto
e) o sequenciamento de DNA a partir de 5´ nunca alcança a região (8) porque a ORF do cDNA clonado é sempre muito longa.

 18. Você foi convidado a clonar e sequenciar um gene da ararinha azul, mas o material disponível desta espécie é muito escasso
para a construção de uma biblioteca genômica ou de cDNA. Mas as seqüências completas do gene em questão, em outras aves, já
estão disponíveis no GenBank. Como você deverá proceder?

a) Deverá produzir uma biblioteca de cDNA de uma ave filogeneticamente próxima, procurar clones positivos com o anticorpo da
ararinha e sequenciar todos os clones positivos.
b)  Fazer um PCR com primers que hibridizem com regiões conservadas entre os vários genes homólogos de outras aves, e
sequenciar os produtos.
c)  Fazer o RAPD com DNA da ararinha, fixar o material em membrana de nylon e capturar os segmentos de DNA de outras
espécies de pássaros sobre a membrana. Eluir os fragmentos capturados, clonar e sequenciar.
d) Montar os contigs de fragmentos de RAPD gerados a partir de DNA de ararinha, sequenciando diretamente as bandas a partir de
material eluído do gel.
e) É impossível atingir este objetivo.

 19. A produtividade dos campos de atuns na costa do Nordeste tem diminuído muito. Desconfia-se que a pesca predatória no Sul
do país seja a responsável por isto, mas os peixes provêem também de campos no Caribe. Como você avaliaria a composição e a
origem dos atuns do Nordeste?

a) Por PCR, procuraria determinar a presença de STRs característicos destas duas populações, porque os STRs são marcadores
extremamente polimórficos.
b)  Construiria duas bibliotecas genômicas, a partir de dois pools de animais, do Caribe e do Sul do país, procuraria clones em cada
uma delas com sondas obtidas a partir de genes de peixes do Nordeste. A bibliotecque gerasse mais clones seria dos peixes que
deram origem ao plantel nordestino.
c)  Faria RAPDs de pelo menos 20 exemplares de cada região de origem provável, procuraria estabelecer um padrão de bandas
distinto para cada uma destas duas regiões e em seguida examinaria pelo menos 100 peixes capturados no Nordeste. A semelhança
do padrão individual de cada peixe, com os padrões sulista ou caribenho, determinaria a origem dos peixes e a composição relativa
de cada origem.
d)  Imunizaria camundongos com extratos de células dos peixes do Caribe e do Sul, e com os anticorpos procuraria obter clones de
uma biblioteca produzida a partir de peixes do Nordeste. O anticorpo que produzisse mais clones positivos indicaria a origem
provável dos peixes na costa nordestina.
e) Produziria uma sonda de DNA a partir de DNA total de peixes do Caribe (por marcação aleatória de fragmentos de DNA) e outra
a partir de peixes do Sul, e empregaria estas sondas para avaliar a intensidade de hibridização com o DNA de peixes
(individualmente) do Nordeste. As reações mais intensas indicariam a origem e a composição relativa.

 Figura 1 (abaixo): construção do cDNA para clonagem unidirecional.

 
 
 Figura 2 (abaixo)
 
 Gabarito para as 19 questões acima
 
1E 2D 3E 4D 5A 6E 7B 8C 9C 10 B
11 D 12 E 13 B 14 B 15 C 16 D 17 A 18 B 19 C   
 
 
 Exercícios de data-mining
 
A seguir, adicionamos uma tabela com algumas sequências de mRNA com ORFs completas (cds completas), para exercício. Os gi
estão vinculados diretamente no NCBI, para facilidade. O aluno deve seguir essencialmente o roteiro de aula (aula 9)
gi Locus Descrição Total Cds início e
pb fim
22779445 AB079665 Holotrichia diomphalia proPO-II mRNA for prophenoloxidase- 2357 37-2091
II, complete cds
22779449 AB084067 Tenebrio molitor mRNA for masquerade-like serine 1451 46-1380
proteinase homologue, complete cds
22789214 BK000460 Chlamydomonas reinhardtii p72 mRNA, complete cds 2617 89-1995
22789233 BC037526 Mus musculus, tyrosine aminotransferase, clone 2351 53-1417
MGC:37796 IMAGE:5097795, mRNA, complete cds
22779438 AB052957 Homo sapiens mRNA for soluble form FELE-1, complete cds 2474 56-2467
22779272 AB081072 Rattus norvegicus Trip15 mRNA for Thyroid receptor 2053 151-1482
interacting protein 15, complete cds
22531248 AY136463 Arabidopsis thaliana putative beta-amylase (At2g32290) 1853 24-1757
mRNA, complete cds
14318645 BC009121 Mus musculus, amylase 1, salivary, clone MGC:11568 1670 79-1614
IMAGE:3710941,mRNA, complete cds