Fotometria

Profa. Laura Alves Cota e Souza

Ouro Preto
2019
Fotometria

Ramo da óptica que se dedica a medidas da luz

 Espectrofotometria

 Método de análises óptico mais utilizado nas investigações biológicas e

físico-químicas
 Por que estudar fotometria?

 Método de análise de muito analitos bioquímicos importantes na clínica

Glicose Ureia Creatinina

Albumina Ácido úrico Sódio

Coletesterol
Potássio Triglicerídeos
total
Radiação Eletromagnética
 Ondas que se propagam no ar ou no vácuo.

Capacidade de transportar energia

 Diferenciação de diferentes radiações eletromagnéticas

Comprimento de onda
 Comprimento de Onda
  = comprimento de onda em nm (caracteriza a energia radiante)

1nm = 10-9 m


Maior o 

A
Menor a
energia
Espectro Eletromagnético
 Espectro Ultravioleta

UVC Completamente UVB Parcialmente UVA Não absorvidos

absorvidos pela absorvidos pela
pela camada de
camada de camada de
ozônio
ozônio; ozônio

Ação
Propriedades Relacionada a
potencialmente
bactericidas: danos oculares
carcinogênica
 Espectro Infravermelho

 Útil na determinação de grupos funcionais em compostos orgânicos;

Retorno ao
Ação em
Vibram e estado
Energia ligações Medida
deformam original libera
covalentes
energia
 Espectro Infravermelho
 Espectro Infravermelho
 Espectro Visível
  Cores Fundamentais

Cor fundamental Comprimento de onda nm

Violeta 400 – 440

-.
Azul 440 – 500
Verde 500 – 570
Amarelo 570 – 590
Alaranjado 590 – 620
Vermelho 620 – 780

 Cores Complementares

Soluções coloridas absorvem com maior intensidade em

determinadas faixas de λ do espectro, correspondendo a
cor complementar
 Fotometria
 Muitas determinações realizadas no laboratório clínico são
baseadas em medições de energia radiante sob condições
controladas.

Transmitida Absorvida Dispersa Refletida

 Princípio

Propriedades Absorver e
Processo de
Espectrometria dos átomos e emitir energia
medida
moléculas eletromagnética
 Leis da Fotometria

1 Raio de energia radiante atravessa uma solução

Energia incidente (Io) será sempre mais intensa

que a energia emergente (I)

Raio incidente Io I Raio emergente

 Razões da dissipação da energia e atenuação da intensidade de
energia

 1 - Reflexões nas interfaces da cubeta

Ar e a parede da cubeta
Parede da cubeta e a solução

 2 - Dispersão por partículas presentes na solução

 3 - Absorção da energia pela solução

 Nas aplicações da fotometria, a absorção da energia é o fator
primário na redução da energia incidente

 Quando se usa energia monocromática (comprimento de onda simples)

 A fração da radiação absorvida pela solução, será função da concentração e

espessura da solução.

Ignoradas perdas por reflexão e dispersão

 Absorbância Transmitância

Luz transmitida (I)

Transmitância (T) =
Luz insidente (Io)
 Leis da Fotometria

2 Raio de energia radiante atravessa uma solução

Quantidade de energia transmitida diminui

exponencialmente

Aumento da
concentração ou Aumento da
intensidade de cor espessura da solução
da solução

Lei de Lambert-Beer
  Lei de Lambert-Beer

Concentração de uma substância é diretamente proporcional à intensidade de

luz absorvida ou inversamente proporcional ao logaritmo da luz transmitida

a = absortividade constante
A = a.b.c b = caminho óptico
c = concentração da solução
 Absorbância x Transmitância

Se não há absorção, a transmitância será igual a 100

 Io = I
 T=1 100%
 Absorbância x Transmitância

 T= I/Io T%= I/Io x 100

log T%= log I/Io + log 100

log T%= log I/Io + 2

 Se log Io/I =A então log I/Io = -A

log T%= -A + 2
log T%= 2 – A

A= 2 – log T%
 Interesse

Medida da energia radiante transmitida ou absorvida por átomos ou moléculas

em solução, em uma determinada área do espectro eletromagnético

 Equipamentos
 Isolar uma faixa estreita do comprimento de onda do espectro.

Fotômetros Espectrofotômetros

Utilizam prismas
Aparelhos que
ou grades de
utilizam filtros
difração
Espectrofotômetros
 Instrumentos capazes de registrar dados de absorbância ou
transmitância em função do comprimento de onda.

 O espectro de absorção é característico para cada espécie química,

sendo possível a identificação de uma espécie química por seu
“espectro de absorção”.

Permitem seleção de radiações monocromáticas, o que possibilita

fazer determinações quantitativas regidas pela Lei de Beer
Componentes dos Espectrofotômetros

 1 – Fonte de energia elétrica – fornecedora de energia regulada, constante e

apropriada para a operação do instrumento;
 2 – Fonte de energia radiante – capaz de medir uma mistura de comprimentos de
onda;
 3 – Fenda de entrada da luz;
 4 – Monocromador – utilizado para isolamento da porção desejada do espectro;
 5 – Fenda de saída da luz;
 6 – Cubeta - recipiente que recebe o líquido da reação a ser medido;
 7 – Detector – utilizado para receber a energia radiante transmitida através da
solução e transformá-la em energia elétrica;
 8 – Circuito medidor – recebe a energia elétrica emitida pelo detector apresentando-
a ao operador sob uma forma útil de medida: absorbância ou concentração.
 1 – Fonte de Energia Elétrica

 Reguladores eletrônicos, magnéticos e baterias

Regulada Constante Adequada

 Pode ser necessário o uso de estabilizadores

Corrigem a tensão da rede elétrica fornecendo

uma alimentação estável e segura

 Protegem os equipamentos contra sobretensão, subtensão e

transientes.
2 – Fontes de Energia Radiante

Excitação de
Descargas elétricas filamentos de Energia radiante
diferentes

Incandescentes Laser

 As mais comuns baseiam-se na incandescência

 Requisitos

Potência suficiente Potência radiante

para permitir a sua deve ser Vida longa
detecção estável/constante

Gerar radiação
Baixo custo
continua

Emitir todos os comprimentos de onda, dentro

da região espectral utilizada
  Lâmpadas Incandescentes

H ou Quartzo-
Tungstênio Mercúrio
Deutério iodo
Mais utilizada para Usada para
Invólucro de Mais usada em
UV próximo e emissão de
quartzo fluorimetria
visível radiação UV

Emissão continua Emitem radiação

Emite radiação de Úteis no visível e
na faixa de 350 a contínua de 180 a
200 a 3000nm UV
1000nm 370nm

Deutério tem Geram muito calor

Pode atuar na
Uso limitado para intensidade de luz e precisam de
região do
radiação < 320nm 3x maior do que a sistema de
ultravioleta
de H (mais cara) resfriamento
 Laser
 Radiações produzidas para substituir as lâmpadas.

Emissão estimulada Muitos feixes estreitos e de intensa radiação

 Praticamente não há dispersão na propagação

Permite concentrar a energia num pequeno ponto,

mesmo que esteja numa distância considerável

 Exemplos
 Óxido de alumínio e óxido de cromo (690nm), argônio (568nm),
dióxido de carbono (337nm).
 3 – Monocromador

Isolar a energia radiante de um determinado comprimento de onda

 Podem ser filtros, prismas ou grades de difração.

Elemento de
Fenda de
dispersão da Fenda de saída
entrada
radiação
  FILTROS
 Filtros de Vidro

Filtro de corte Filtro composto

Corte no espectro com transmitância
Construído pela associação de dois ou
quase nula de um lado e grande
mais filtros de corte
transmitância do outro

Transmite uma faixa definida do

Usado para eliminar energia estranha
espectro.

É o tipo mais comumente empregado

nos fotocolorímetros.
 Filtro composto pode ser considerado monocromador?

 Não!!!

Transmite uma
Não isola um λ faixa muito
ampla de λ
 Filtros de Interferência

Transmitem uma faixa muito estreita

Pequena faixa de emissão
de comprimentos de onda

1- Energia radiante penetra no filtro, perpendicular à superfície prateada;

2- Atravessa o dielétrico;
3- Refletida pela camada prateada do lado oposto;
4- Retorna à primeira camada;
5- Reflete outra vez;
6- Sai do filtro com comprimento de onda selecionado.
 4- Cubeta

Recipiente pequeno usado para conter o material a ser analisado

 Quando não são bem cuidadas contribuem decisivamente para

aumentar o erro fotométrico.

Sílica
Vidro Plástico
(quartzo)

Comprimentos de onda abaixo de 340 nm

 Quadradas ou Retangulares

 Faces planas e paralelas;

 Polidas oticamente;
 1,0 cm de espessura de solução;

 Redondas

 Não são polidas;

 Podem apresentar irregularidades de superfície;
 Sujeitas aos erros de refração.
5 - Detectores

É o componente que recebe a energia radiante transmitida pela solução e a

transforma em energia elétrica

 É um receptor de fótons.

Elétron Fóton
(energia (energia
elétrica) luminosa)

Tubo
Fotodetectores Fotodiodos
fotomultiplicador
 6 - Circuito Medidor

Mostra a energia elétrica do detector em um sistema de leitura

Enviado a um
Sinal de saída Apresentação
Processamento dispositivo de
do detector do resultado
saída

 Analógico
 Digital (display numérico)
 Os espectrofotômetros podem ser de dois tipos

Mono-feixe

Duplo-feixe
Branco
O uso do Branco em fotometria é necessário para estabelecer a
absorbância zero do reagente utilizado

 Exemplo

 Dosagem de Proteínas Totais

 Reagente de Biureto apresenta uma absorbância em 545 nm em torno
de 0,120.

Elimina a
Zera o contribuição da
Branco
equipamento A dos reagentes
nos resultados
 Branco da Reação

 Usado em todas as leituras fotométricas

 Água destilada ou o reagente

 Branco da Amostra
 Amostra sem adição de reagentes para a formação de cor;
 Usado em algumas reações para eliminação de interferentes;
 Hemólise, triglicerídeos e bilirrubina em excesso.
Padrão
 Substância que está sendo investigada em uma concentração
conhecida.

Usado como referência para determinação da concentração da

substância na amostra

 Exemplo

 Dosagem de glicose em amostra de soro.

 Padrão? Glicose 100mg/dL

A padrão ------------ 100 mg/dL

A amostra ---------- x
Seleção da área espectral

Qual λ?

 Objetivo

 Selecionar o λ em que a energia radiante seja absorvida ao máximo

ou aproximadamente ao máximo

A fim de se obter o mais alto grau de sensibilidade

 Exemplo

 Solução VERDE

Absorção no vermelho com maior intensidade

Escolher comprimento de onda na região do

vermelho (620-750 nm)
 Atenção!

As vezes a medida fotométrica é realizada em λ diferente

daquele em que há o máximo de absorção

Sensibilidade

 Obter linearização
 Aumentar a faixa de trabalho Hemoglobina
 Eliminação interferentes Bilirrubina
Lipemia
 Como definir o comprimento de onda?

 Preparo da curva de absorção espectral

Relação entre A e λ
Faixa Útil de Trabalho
 Para obter uma exatidão máxima nas leituras fotométricas é
necessário conhecer a faixa útil do colorímetro ou
espectrofotômetro.

O manual do instrumento orienta quanto à faixa útil,

geralmente até de 2,000 de absorbância.