23/10/2012
Cronograma
Entrega do Relatrio 4
Entrega do Relatrio 5
Aula:
HOJE Eletroforese (SDS-PAGE) e Sequenciamento de Protenas
Prtica 6- Procedimento A (Dilise)
Execuo e Recolhimento do exercio 7
(Prova de Protocolo + Execuo e recolhimento Exerccio 10)
23/10
30/10 Laboratrio de informtica
06/11 Simulao computacional de purificao de protenas
Exerccio de Sequenciamento
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Tratamento da
amostra (SDS + -
mercaptoetanol)
100 C/5 min
Determinao da
massa molecular
Colorao
Descolorao
Identificao e
Sequenciamento da
protena
Dilise
Eletroforese (SDS-PAGE)
Identificao e Sequenciamento de protenas
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23/10/2012
Dilise
Objetivo: Remover o excesso de sais (ons) que atrapalham nas etapas de caracterizao da
protena.
Antes da dilise Depois da dilise
Protenas
ons do tampo H2O
H2PO4-/HPO42-
Na+/Cl-
Tampo fosfato 50 mM Tampo fosfato 0.025 mM Tampo fosfato 0.0000125 mM
+ NaCl 1 M (1 ml) NaCl 0.5 mM NaCl 0.00025 mM
H2O 2L (diluio de 2000x) H2O 2L (diluio de 2000x)
HOJE
-Acrescentar 20 l de tampo de amostra
- Incubar em gua fervente por 5 min
+ 20 l de Tampo de Amostra:
23/10
Tampo (Tris, pH 6.8)
Glicerol
SDS
Azul de Bromofenol
-mercaptoetanol
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Outros mtodos para separao da protena
Filtrao sob presso
Ideal para desalinizar e concentrar amostras
A amostra forada a passar
atravs de uma membrana
contendo poros de tamanho
definido colocando-se o tubo em
uma centrfuga
Dilise
Eletroforese (SDS-PAGE)
Identificao e Sequenciamento de protenas
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Prtica 6- SDS-PAGE
1) Receber o gel preparado e aplicar as amostras preparadas previamente
Poo 1: Padro de peso molecular
Poo 2: Lisado centrifugado
Poo 3: Material DEAE
Poo 4: Padro isolado de -galactosidase
2) Ligar a fonte
3) Eletroforese at o corante azul de
bromo-fenol atingir a base do gel. Desligar
a fonte.
4) Retirar o gel e colocar na soluo de
colorao (Azul de Coomassie) e depois na
de descolorao.
5) Visualizar as bandas das protenas.
Identificar a -glicosidase.
5) Determinar o Peso Molecular.
Eletroforese
Eletroforese descreve a migrao de uma partcula carregada
sob influncia de um campo eltrico.
+ +
Mobilidade eletrofortica: = v/E = Z/f
v=ZE
Velocidade f
de migrao
Fora do campo eltrico
Carga Lquida (V. cm-1)
Coeficiente Friccional
(resistncia encontrada pelo on;
Voet afetado pelo tamanho/forma do on)
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Eletroforese - Aplicaes
-Acompanhamento de purificao de protenas
-Acompanhar expresso de protenas
-Isolar protenas para anlise por MS
-Determinar o tamanho (Mr) da protena
Eletroforese em Gel
PAGE do ingls polyacrylamide gel electrophoresis o tipo de eletroforese mais
utilizado para anlise de protenas
Gel formado no
1. Uso de um campo eltrico espao formado entre
duas placas de vidro
2. Uso de um polmero grapeados contendo
(poliacrilamida ou agarose) espaadores ( 1mm)
3. Protenas carregadas
negativamente migram para o
polo positivo
4. Migrao depende da carga ,
massa, e formato das protenas
Lenhinger
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Fundamentos sobre a polimerizao do gel de Poliacrilamida
- Persulfato de amnio + TEMED: Formao de Persulfato de Amnio TEMED
Radicais Livres iniciadores da polimerizao
TEMED
S2O82 + e- SO4
- Radicais derivados do persulfato induzem a reao de
polimerizao dos monmeros de acrilamida e de bis-
acrilamida
R + M RM
RM + M RMM
RMM + M RMMM , etc.
Porosidade do gel dado pela % da acrilamida
[monmeros]
determina o
tamanho dos
poros Tamanho do poro
Ligaes cruzadas
(bis-acrilamida) Porcentagem de acrilamida:
5 %; 10 %, 15 %; 20 %; 30 %
Protenas
(SDS-PAGE)
Polmero de acrilamida
e bis-acrilamida
Gel serve como uma peneira
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Tipos de Eletroforese
No-Desnaturante (Nativa)
Separao por carga,
Eletroforese peso molecular e forma
Desnaturante (SDS-PAGE)
Separao por
peso molecular
Agente Denaturante
Torna a protena carregada negativamente
Protenas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de
migrao quando em eletroforese livre (sem o gel, somente tampo).
v=ZE
f SDS desnatura a protena
1 SDS liga a 2 resduos de aminocidos
No entanto, quando em gel as protenas so separadas segundo o seu peso molecular
Resumindo: Em SDS-PAGE as protenas so separadas basicamente pelo tamanho!
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SDS-PAGE no redutor e redutor
No-Desnaturante (Nativa)
Separao por carga, peso molecular e
forma
Eletroforese
No-Redutora
SDS
Protena
Desnaturante (SDS-PAGE)
SDS
Separao por peso
molecular
-mercaptoetanol
Redutora Ou DTT
Experimentos em SDS-PAGE no-redutor e redutor permitem observar a presena de
dmeros e outras protenas contendo pontes de disulfeto.
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Gel de aplicao ou empilhamento
Visualizao de Protenas aps Eletroforese
1. Colorao com o corante
(Coomassie blue, Prata)
2. Descolorao com cido actico
Lenhinger
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Estimativa do Peso Molecular de Protenas
( SDS Gel Electrophoresis)
Mr
d
D
Rm =d/D
Mr = massa molecular
(ou peso molecular) D= Migrao total
d = Migrao individual de cada banda
Lenhinger
Mtodos para determinar peso molecular
SDS-PAGE Mr Preciso
5-10 %
d
D
Migrao relativa
Rm =d/D
Mr = massa molecular
(ou peso molecular)
Cromatografia de Excluso
Preciso
10 %
Eluio relativa
Espectrometria de Massas
Mtodo bastante sensvel
Fornece valores de PM com
alta presiso
Preciso
0.001 %
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Eletroforese em
Gel-Bidimensional
Objetivo: Maximizar a separao de protenas
(c) Eletroforese em gel bidimensional
Primeira Dimenso Segunda Dimenso
Focalizao isoeltrica SDS gel electrophoresis
Separa de acordo com o pI Separa de acordo com o tamanho
Lenhinger
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Focalizao Isoeltrica
1. Eletroforese em gradiente de pH
2. Protenas so distribudas ao longo
do gradiente de pH de acordo com o
valor do seu pI.
3. Cada protena focalizada em uma
faixa estreita de pH prxima ao seu
pI
Lenhinger
Eletroforese em gel bidimensional das protenas de E. coli
- mais de 2,000 protenas podem ser visualizadas
Utilizada para comparar nveis de expresso de protenas
Protenas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos
Protenas so identificadas por espectrometria de massas
Lenhinger
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Dilise
Eletroforese (SDS-PAGE)
Identificao e Sequenciamento de protenas
O sequenciamento da protena fornece informaes
acerca da estrutura primria
Espectrometria de massas
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A sequncia de aminocidos pode ser determinada pela
sequncia do DNA do gene que o codifica
Proteoma
Genoma
No entanto, sequenciamento do gene NO:
- Localiza pontes de disulfeto (S-S)
- Identifica modificaes ps-traducionais
Sequenciamento de Protenas
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(a) Determinao da composio/proporo de aminocidos: Hidrlise cida (HCl 6 M)
1) hidrlise tambm pode ser realizada em meio bsico, utilizando 2-4 M de NaOH
2) A hidrlise tambm pode ser realizada por digesto enzimtica: Ex. Pronase
(mistura de proteases)
3) A separao e anlise dos aminocidos pode ser feita por diversas tcnicas
como HPLC ou cromatografia em camada delgada (TLC).
Na TLC (thin layer chromatografy) os aminocidos
so revelados (p. ex. com nihidrina) e identificados
Fig 7-6 Separao e Anlise de utilizando-se padres.
aminocidos por HPLC. (Voet 3ed).
(b) Identificao da extremidade amino-terminal utilizando:
Reagente de Sanger (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno, FNDB)
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(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetdica: Degradao de Edman
Fenilisotiocianato (PITC)
cido trifluoractico
(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetdica: Degradao de Edman
Limitaes:
Tempo de anlise longo
Grande quantidade de amostra
Atualmente o mtodo de
escolha para o
sequenciamento tem sido
a espectrometria de
massas
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Sequenciamento de protenas
grandes requer a clivagem parcial da
cadeia polipeptdica (enzimas)
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O sequenciamento dos peptdeos derivados da
clivagem parcial da protena pode ser feita por:
-Degradao de Edman
(tcnica pouco usada atualmente)
-Espectrometria de Massas
(tcnica mais utilizada atualmente devido a maior sensibilidade e
especificidade do mtodo)
Identificao e Sequenciamento de Protenas
por Espectrometria de massas (MS)
Aspectos histricos
Apesar da espectrometria de massa ser utilizada a muito anos para o estudo
de molculas orgnicas, sua aplicao para o estudo de macromolculas foi,
por muito tempo, limitado por problemas tcnicos.
Macromolculas como protenas, DNA e carboidratos so fragmentados
pelos processos necessrios para ionizar as molculas no vcuo do aparelho.
Porm, com o advento de duas novas tcnicas de ionizao, isto mudou, e
hoje a espectrometria de massas uma ferramenta importante em biologia.
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Requisito fundamental para anlise
no espectrmetro de massas
Gerao de ons em fase gasosa
Mas como volatilizar uma macromolcula???
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html
Nobel Prizes - Chemistry
2002
John B. Fenn is the chemist who invented Koichi Tanaka research engineer who
the ELECTROSPRAY method developed the MALDI technique
(1988). (1987).
Professor of Chemistry at Yale University, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.
USA, and at Virginia Commonwealth
University, USA
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Mtodos de Ionizaes Brandas
Protenas so ionizadas pela aquisio de prtons (ons c/ carga positiva)
A carga adquirida pela protonao de resduos bsicos da protena (Lys, Arg)
Massa da protena
[M + nH]n+
A ionizao por electrospray
produz protenas carregadas
com mltiplas cargas
A ionizao por MALDI produz
protenas monocarregadas
Vantagens da utilizao de espectrometria de massas
A espectrometria de massas permite determinar a massa da protena/peptdeo com alta
preciso (<0.001%). A preciso de massa na eletroforese (SDS-PAGE) de 5-10 %.
possvel identificar protenas atravs da anlise das massas do peptdeos
gerados (Peptide Mass Fingerprinting) e utilizao de softwares que fazem a
busca dos peptdeos detectados em banco de dados (p. ex. MASCOT)
Ainda mais, possvel realizar o sequenciamento completo de cada peptdeo.
Isso importante para identificao de novas protenas e de modificaes ps-
traducionais.
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Estratgias para a identificao de protenas por espectrometria de massas
Protena Desconhecida Digesto enzimtica
Em geral a protena isolada de gel 2D...
Mistura de Peptdeos
Determinao da massa da Determinao das massas de cada peptdeo
protena intacta por espetrometria de massas
por espectrometria de massas
Busca das massas
dos peptdeos
em Banco de Dados
(PMF*)
Match No Match
(protena conhecida) (protena desconhecida)
Identificao e Sequenciamento de cada
Caracterizao da Protena peptdeo por MS/MS
Match Busca das sequncias
(protena conhecida) em banco de dados de
sequncias
(PFF**) No Match
(protena desconhecida)
Caracterizao de uma
nova protena
*PMF = Peptide Mass Fingerprinting; **PFF = Peptide Fragmentation Fingerprinting
Peptide Mass Fingerprinting
(PMF)
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Protenas podem ser identificadas atravs das massas de peptdeos gerados na
sua hidrlise por enzimas conhecidas. Os dados das massas dos peptdeos so
colocados em um tipo de google para protenas (ex. Mascot)
Espetro de massa dos peptdeos gerados
pela clivagem da protena com uma protease
Identificao de protenas por
peptide mass fingerprint (PMF)
a) Busca em banco de dados de
protenas
b) Comparao dos peptdeos
detectados com os peptdeos tericos
obtidos na digesto de protenas com
a protease utilizada no experimento
c) Match! Identificao. ex.: MASCOT
Exemplo: Identificao da
beta-glicosidase
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23/10/2012
Procedimento: Remoo da banda da -glicosidase, digesto com
tripsina e anlise por espectrometria de massas
Tripsinizao
MALDI-TOF
Obs. O protocolo de digesto utilizado inclui uma alquilao prvia dos tiois livres com iodoacetamida,
Espetro de massa dos peptdeos derivados da digesto da
beta-glicosidase com tripsina Lista de
peptdeos
detectados
Intens. [a.u.]
x10 4 1179.511
m/z
698.315
742.326
2.5
780.283
866.400
936.431
2.0 963.414
963.414 1034.066
898.397
1082.483
1121.502
1.5
1154.519
1170.517
1179.511
1.0 1361.555
1333.524 1383.528
1515.656
742.326 1515.656 1728.736
0.5 1783.703
1783.703
1940.766
2065.844 2383.836
3313.082
2089.867
2938.198 4074.899
0.0
2272.853
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 2288.853
m/z
2310.801
2938.198
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Busca no Mascot utilizando as massas dos peptdeos detectados
Lista de
peptdeos
detectados
m/z
698.315
742.326
780.283
866.400
936.431
963.414
1034.066
1082.483
1121.502
1154.519
1170.517
1179.511
1361.555
1383.528
1515.656
1728.736
1783.703
1940.766
2089.867
2272.853
2288.853
2310.801
2938.198
Modificaes variveis mais comuns
Alquilao de tiis livres
Durante o preparo da amostra para anlise no espectrmetro de massa comum realizar a
reduo de pontes de disulfeto (beta-mercaptoetanol ou DTT) e a alquilao do tiolato (SH
livre) (p. ex. alquilao com iodoacetamide)
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As massas detectadas so comparados com as massas tericas da protena atravs
de softwares especficos (neste exemplo utilizou-se o Biotools da Bruker)
Massas detectadas Massas tericas
RESULTADO OBTIDO NO MASCOT
Scores acima de 86 so significantes (p<0.05)
O score obtido na busca foi de 121.
Portanto o resultado signifiante.
Parmatros utilizados na
busca pelo Mascot
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Resultado do Mascot mostrando as sequncias que tiveram match (em vermelho)
O match ocorre quando a massa experimental bate com a terica
Massas que
tiveram
match
Massas que no tiveram match. Essas massas podem ser de
uma outra protena ou de peptdeos que sofreram alguma
modificao.
Concluses da busca no Mascot
Os dados de anlises dos peptdeos derivados da digesto trptica da banda
retirada do gel de eletroforese mostram que a protena purificada corresponde
beta-glicosidase de Spodoptera Frugiperda.
A cobertura da sequncia foi de 23 % com um erro de 0.5 Da. possvel atingir
uma cobertura maior usando erros maiores (47 % com um erro de 2 Da), porm
isso pode levar interpretaes errneas sobre a identificao da protena.
Apesar da cobertura ser aparentemente baixa, as sequncias que foram cobertas
(sequncias que tiveram o match) possibilitam realizar a identificao da protena
com um score de 121. Esse score indica o grau de significncia do resultado e
para a busca realizada, scores acima de 86 so significantes (p<0.05).
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Sequenciamento de peptdeos
por espectrometria de massas
Antigamente o sequenciamento era
feito pela degradao de Edman.
Atualmente o mtodo de escolha a
espectrometria de massas.
Peptdeos podem ser fragmentados no espectrmetro de massa
A clivagem mais comum ocorre na ligao peptdica, gerando ons da srie y e b.
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Espectro MS/MS de um peptdeo
b2-b1
= 147.02
Phe (F)
y2-y1
= 128.06
Gln (Q)
= 128.06 = 163.07 = 71.03
Lys (K)
Glu(E)
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Captulo 9, pgina 382-383
Espectro de massa da mistura de peptdeos
Intens. [a.u.]
x10 4 1179.511
2.5
Seleo e fragmentao de peptdeo
2.0
963.414
(MS/MS)
898.397
1.5
1.0
1333.524
742.326 1515.656
0.5
1783.703
2065.844 2383.836
2938.198 3313.082 4074.899
0.0
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
m/z
Espectro de massa dos fragmentos de do on de m/z 1179.511
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23/10/2012
30/10/2012 (Turma A)
06/11/2012 (Turma B)
LABORATRIO DE INFORMTICA
30
