Microarrays

Biologia Molecular 2013/2014

Prof. Luka Clarke

Joana Guerreiro 40237 Patrcia Marques 40232 Vanda Paixo 41026

ndice
Histria

Microarrays
Como funciona

Sondas
Design Experimental

Bioinformtica
Anlise de dados

Aplicaes

Histria
As ferramentas necessrias para estudar o RNA esto disponveis h anos, como Northern blots, RT-PCR , ESTs, e SAGE .

O primeiro microarray surgiu na dcada de 80 e evoluiu da tcnica de Southern blotting e Northern blotting.

1995
Traou-se o prefil de expressao gnica pela primera vez.

1997
Inseriu-se o genoma completo da Saccharomyces cerevisiae num microarray.

2004
Conseguiu inserir-se o genoma humano inteiro num microarray.

Uma quantificao rpida e rentvel do transcriptoma tornou-se possvel devido ao desenvolvimento de microarrays de expresso gnica.

Microarrays
Os microarrays baseiam-se na capacidade de cadeias complementares de DNA se hibridarem uma em torno da outra numa soluo com elevada especificidade.

Os resultados da expresso gnica por microarrays forneceram informao bastante relevante:

Modo como o transcriptoma implantado nos diferentes tipos de tecidos e clulas; Modo como a expresso gnica muda ao longo dos diferentes estados de desenvolvimento e fentipos de doenas;
Como a expresso gnica varia entre espcies e dentro de uma.

Microarrays
Tipos de Microarrays
Microarrays de baixa densidade (spotted DNA microarrays)
-1.000 a 10.000 spots por cm2 - Estudo de parte do genoma - Sondas: cDNA, mRNA ou oligonucletidos 50-80pb

Microarrays de elevada densidade (GeneChip arrays)

- Perfect Match - PM e MisMatch MM - Sondas: oligonucletidos 25pb (fotolitografia) - Usados para efeitos comerciais

Microarrays
Suportes
Lminas de plstico Chips Lminas de vidro + resistente s elevadas temperaturas de hibridao + no-poroso + tem autofluorescncia baixa + boa geometria + passivo na fabricao de arrays de elevada densidade - superfcie planar tem uma capacidade de carga baixa - a ligao ao DNA no eficiente quimicamente.
Materiais porosos: Nitrocelulose, Nylon e Acrilamida + imobilizao de maiores quantidades de alvos + maior rea de superfcie -> mais sensvel

Como funciona um microarray?

mRNA
Transcriptase reverso

cDNA

Hibridza!

Colocado na lmina de microarray

Anlise com o scanner.

Gene muito activo.

Gene pouco activo.

Muita produo de mRNA

Menor produo de mRNA

Maior fluorescncia

Menor fluorescncia

E se no se observa fluorescncia?
Gene Inactivo

Sondas
Sondas

cDNA

Oligonucletidos

Pr-sintetizada

In situ

Sondas
Sonda de cDNA

Sequncias conhecidas de cDNAs so depositados nos poos do microarray e utilizadas como sondas .

Sintetizados antes de serem colocadas no microarray.

Sondas
Sonda de Oligonucletidos
Sequncias de oligonucletidos so concebidas para representar um gene ou um transcripto de interesse.

H dois tipos
Longos
(60 bases)

Longos To sensveis e quase to especficas como as sondas cDNA. Produzidos pela Agilent.

Curtos Menos sensveis mas menos dispendiosos. Produzidos pela Affymetrix.

Curtos
(25 bases)

Sondas
Sonda de Oligonucletidos Curtos
O processo de manufactura da Affymetrix restringe o tamanho das sondas a 20-25 nucletidos. Para cada gene h 16 sondas com aproximadamente 25 nucletidos. As sondas complementares chamam-se Perfect Match (PM) e so emparelhadas com sondas MisMatch (MM). O resultado obtido para um dado gene a mdia entre os sinais PM e MM.

Vantagens e Desvantagens
cDNA No necessrio conhecer previamente a sequncia; Elevada especificidade;
Isolamento e purificao prvia; As sequncias mais longas podem ter hibridao cruzada com outros genes ;

Oligonucletidos

Vantagens

No necessrio isolar nem purificar o DNA; Menos reactivos com as sequncias das amostras a utilizar ;
Necessrio conhecer as sequncias previamente; Menor especificidade; Demora mais tempo;

Desvantagens

Desing Experimental
Comparao entre duas amostras
Hiptese

Preparao do material gentico da amostra

Escolha do Mircroarray

Marcadores

Purificao, hibridao e lavagem

RESULTADOS

Preparao do material gentico da amostra

Extrao do mRNA Purificao Transcrio Reversa ampliao por PCR (RT-PCR) e

cDNA

Escolha do Microarray

Densidade de DNA Preo

Nmero de replicados Tipo de DNA que vai hibridizado

Marcadores

Marcao Ligao das

directa: sondas

durante a transcrio reversa. Cy3 e Cy5 os

mais utilizados.
Marcao indirecta: O mRNA trancripto reversamente presena na de

aminoalil-dNTPS que

sero marcados com

NHS fluorescente.

Purificao, hibridao e Lavagem I

Purificao, hibridao e Lavagem II

HIBRIDIZAO Temperaturas elevadas (42C- 60C) Concentrao salina e ph da soluo tampo adequado 12h-20h Agentes desnaturantes Formamida (diminuitemperatura de anealing)

PEG (aumenta a velocidade de anealing)

LAVAGEM

Eliminao das molculas de cDNA que no

hibridizaram (em condies de estringencia

Controlos
REFERNCIA Uma aliquiota de RNA de referncia hibridizada com cada array. A intensidade da amostra medida relativamente intensidade do RNA de referncia.

DESIGN DE BLOCOS A amostra hibridizada com marcadores diferentes de modo a eliminar interferncias provocadas por cada marcador

Recursos bioinformticos
Dificuldade na troca de data sobre microarrays

Fabricantes Protocolos Mtodos de anlise

Bioinformtica

Bases de dados: GeneNet, Ecocyc, aMAZE

Gridding atribuio de coordenadas aos spots

Normalizao

Analises estatsticas

Analise de Dados
Segmentao do spot
Verifica-se se o pixel pertence regio do sinal ou ao background

Segmentao de crculo fixo

Spots de igual dimetro e circulares.

Segmentao por variao de intensidade Spots marcados devido intensidade.

Analise de Dados
Quantificao da intensidade
Correco do background modo a remover erros. de

Determinada-se as intensidades background e do foreground.

do

O sinal do spot determinado atravs da subtraco do sinal do background.

Analise de Dados
genes expressos nas clulas saudveis

genes expressos nas clulas doentes

Amarelo: genes expressos nas duas clulas. Preto: genes no expressos nos casos estudados.

Analise de Dados
Normalizao
Os erros sistemticos podem afectar a determinao dos nveis de expresso gnica.

Mtodo Two-colors arrays :

Efectuam-se transformaes dos dados para corrigir essas fontes de erro.

Determinao da quantidade de genes do canal vermelho que esto sobre ou sub-expressos comparativamente ao canal verde.
Rjk ajustamento do background do sinal vermelho Gjk ajustamento do background do sinal verde Cjk factor de normalizao

Aplicaes
Transcritoma

O que ?

Conjunto de todos os genes que esto a ser expressos, num dado instante e numa dada clula. A sua caracterizao passa por identificar RNAs e determinar as suas abundancias relativas. Os genes mais expressos vo ter mais transcritos convertidos a cDNA marcado ; cDNA mais abundantes vo se ligar mais s sondas que aqueles de genes menos expressos; Os genes que so expressos ao mesmo nvel tero quantidades equivalentes de transcrito ligados s sondas.

Aplicaes
Deteco de mutaes e SNPs
Crucial sequenciar fragmentos (RT-PCR tem uma taxa de erro associada)
Polimorfismo de um nucletido Conservados ao longo da evoluo Podem ser usados como marcadores de gentipos

Caso particular: SNPs (Sondas so especificas) SNPs: sequncias de DNA que diferem apenas num nucletido entre pares de cromossomas ou diferentes espcies; Baaj Y. et al, 2008: sondas em hairloop maior especificidade

Podem ser detectadas determinadas doenas, ainda antes dos primeiros sintomas pela deteco de um marcador gentico ou de uma mutao.

Bibliografia
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