Biochimica: area della ricerca per comprendere i fenomeni biologici dal punto di vista chimico come struttura e funzione

delle proteine ad es. enzimi.

Genetica: area della ricerca che si occupa della trasmissione dei caratteri ereditari

STRUTTURA ACIDI NUCLEICI

La biologia molecolare è un punto di incontro da genetica e biochimica; ha avuto come primo successo approfondire gli aspetti molecolari e biochimici alla
base dei diversi processi biologici che avvengono all’interno della cellula.
Trascrizione e sinstesi proteica avvengono sia nelle cellule eucariotiche che procariotiche; nelle cellule procariotiche la trascrizione e la sintesi proteica
avviene nel citoplasma, negli eucarioti, invece, la trascrizione avviene nel nucleo e la sintesi proteica avviene nei ribosomi (nel compartimento citoplasma).
Alla fine del 1800 un chimico svizzero Miescher isolò dai globuli bianchi da cui ottenne gli acidi nucleici.
Il DNA è un polimero la cui unità di base sono i nucleotidi legati da un legame fosforico.
Esperimenti di Griffith: studiava il batterio streptococcus pneumoniae che si distingue in un ceppo benigno (R), che manca di una capsula esterna
polisaccaridica, e da quella maligna (ceppo S) che è circondata dalla capsula esterna che è in grado di provocare la polmonite proprio perché le difese
immunitarie non riescono ad attaccare e distruggere il virus.
Il ceppo virulento (maligno) tende ad uccidere il topo, ma nel momento in cui si forniva calore a questo ceppo, il topo sopravviveva poiché perde l’effetto
patogeno.
Se a questo ceppo riscaldato si mischiava quello non virulento, il topo moriva; griffith isolandò i batteri nel sangue di questo topo, scoprì che il ceppo R
acquisisce la capsula polisaccaridica e mantiene questa caratteristica geni tipica per molte generazioni. Egli, dunque, ipotizzò che qualcosa del ceppo S
inattivato penetrasse nel ceppo R convertendolo in un S virulento; egli identificò questo “qualcosa” principio trasformante.
Esiste un principio trasformante che trasformava il ceppo virulento in uno non virulento, ovvero il DNA; ciò venne scoperto da Avery(1944) che prese il
ceppo virulento, divise le varie componenti (Tripsina che digerisce le proteine, RNasi che degrada l’Rna, DNasi che degrada il DNA) e vide che misti a
quello non virulento, vide che solo il DNA riusciva a trasformare e trasmettere il carattere genetico, ovvero riusciva a far diventare il ceppo R in S
Nel 1952 Hersey e Chase dimostrarono che confermò il DNA come materiale genetico. Ciò avvenne tramite l’esperimento del frullatore e vennero usati
batteriofagi ; un fago è un piccolo virus che infetta i batteri e consiste di un capside proteico che ne racchiude il materiale genetico. Hersey è Chase
marcarono radioattivamente il DNA del fago con proteine marcate zolfo radiattivo 35 e fosforo radioattivo 32:
1) i virus infettano il batterio, iniettando il principio trasformante sulla loro membrana;
2) stacco il virus dalla cellula e centrifugo
3) cellula e virus vengono separati per centrifugazione
Se il virus ha iniettato le proteine zolfo 35 le trovo nell supernatante il principio trasformante è la proteina; se nelle cellule è presente il fosforo 32 allora il
principio è il dna situato nelle cellule.
Videro che il principio era proprio il DNA.
Questo esperimento ha dimostrato che il materiale genetico è il DNA.
Il DNA o genetotipo porta all’espressione genica o fenotipo.
Gli acidi nucleici, DNA e RNA, sono costituiti da catene polinucleotidiche, cioè polimeri lineari di unità chiamate nucleotidi.
I nucleotidi sono molecole costituite da tre componenti: uno zucchero pentoso, una base azotata, uno o più gruppi fosfato.
Nel caso del DNA lo zucchero è il deossiribosio (chiamato anche desossiribosio), mentre nell’RNA è il ribosio.
I due zuccheri differiscono per un gruppo OH presente sulla posizione 2 del ribosio e che manca nel deossiribosio; questa
differenza è molto rilevante, in quanto questo gruppo OH conferisce instabilità alle molecole di RNA. Il DNA che ha un H in
quella stessa posizione è metabolicamente più stabile.
Le basi azotate che si trovano negli acidi nucleici naturali sono di due tipi: purine (a doppio anello eterociclico) e pirimidine
(a singolo anello):
-purine: adenina e guanina;
-piramidina: citosina, timina e uracile.
La differenza tra uracile e timina è la presenza di un gruppo metilico in posizione 5 dell’anello pirimidinico. Di solito ci si
riferisce alle basi con le loro iniziali A, C, G, T e U.

Quando una delle basi è legata alla posizione 1 di uno zucchero (ribosio o deossiribosio), abbiamo i nucleosidi, che prendono
il nome di adenosina, guanosina, citidina, timidina e uridina.
Poiché in ciascun nucleoside sia lo zucchero che la base azotata hanno una numerazione 1, 2, 3 ecc. per indicare le varie
posizione della molecola si usa aggiungere un apice ['] alla numerazione relativa allo zucchero per distinguerla da quella della
base.
Ai nucleosidi possono essere legati uno o più gruppi fosfato e, in tal caso, prendono il nome di nucleotidi: questi sono
chiamati acido adenilico, acido guanilico ecc… . Infatti, il gruppo fosfato conferisce una valenza acida alla molecola. La figura
2.3 mostra come il gruppo fosfato possa trovarsi legato al carbonio 5' dello zucchero oppure al carbonio 3'. Inoltre, considerati
come molecole indipendenti, cioè non inserite nella catena polinucleotidica, i nucleotidi possono contenere un solo gruppo
fosfato oppure due o tre. In particolare, i nucleotidi che vengono utilizzati come substrato per la sintesi del DNA e dell’RNA
hanno tre gruppi fosfato legati in serie sulla posizione 5' dello zucchero.
Una base legata allo zucchero si definisce nucleoside e se il nucleoside è legato al fosfato si chiama nucleotide.
I nucleotidi sono legati tra loro a formare una catena polinucleotidica di DNA o di RNA; lo scheletro (o impalcatura) della
catena polinucleotidica è costituito dall’alternanza di zuccheri (deossiribosio o ribosio) e di gruppi fosfato, e che le basi
sporgono lateralmente da questo scheletro. Infatti, ciascuna zuccheri.base è legata alla posizione 1' di uno zucchero da un
legame glicosidico che interessa l’N1 delle pirimidine o l’N9 delle purine. Va notato che tra uno zucchero e l’altro c’è un solo
gruppo fosfato e che quindi si tratta di un polimero di nucleosidi monofosfato ciascun gruppo fosfato forma un legame estere
con il carbonio 5' di uno zucchero e un secondo legame estere con il carbonio 3' dello zucchero successivo. Questo tipo di
legame, chiamato fosfodiesterico, conferisce una sorta di asimmetria, o meglio di polarità, alla catena polinucleotidica, nel
senso che questa presenta due diverse estremità: da una parte c’è un nucleotide che ha il carbonio 5' libero, mentre il
carbonio 3' è impegnato nel legame fosfodiesterico con il nucleotide adiacente; dall’altra la molecola polimerica termina con
un nucleotide che ha il carbonio 5' impegnato nel legame fosfodiesterico con quello adiacente, mentre il carbonio 3' è libero.
5' e 3' liberi vuol dire che questi C-terminali non sono impegnati in legami fosfodiesterici; la loro valenza è comunque
impegnata da gruppi –OH o da gruppi fosfato.
Questa polarità 5' → 3' delle catene polinucleotidiche, sia di DNA che di RNA, è molto importante. Infatti, la struttura dello
scheletro della catena polinucleotidica è diversa se vista da un estremo o dall’altro.
Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici si scrivono in direzione 5' → 3', cioè dall’estremità 5' libera a sinistra
all’estremità 3' libera a destra. In disegni, schemi e sequenze è in genere utile indicare le due estremità.
Le basi vengono indicate con le convenzionali lettere AUCG, legate al carbonio 1’ degli zuccheri.
 Negli anni quaranta del secolo scorso fu acquisita un’altra informazione
sulla struttura chimica del DNA. Si tratta delle ricerche del chimico
Chargaff, presso alla Columbia University di New York, condotte sulla
composizione delle basi del DNA. Chargaff si era accorto che
preparazioni di DNA di origine diversa possono avere un differente
contenuto delle quattro basi A, C, G e T (espresse come contenuto
percentuale). Concluse che, mentre organismi di diverse specie
possono avere DNA con composizione in basi differente, il DNA
preparato da diversi tessuti od organi della stessa specie ha sempre la
stessa composizione in basi. Questa costanza nell’ambito dello stesso
organismo e diversità tra organismi diversi ben si accordava con l’idea
del ruolo del DNA come materiale genetico. Nel corso di questi studi
Chargaff fece un’altra osservazione che si rivelò poi importante nel
momento in cui Crick e Watson affrontarono il problema della struttura
fisica del DNA.
Chargaff osservò che, qualsiasi sia la fonte del DNA e nonostante la
diversa composizione in basi, veniva sempre rispettata una regola (che
venne poi chiamata regola di Chargaff): la per- centuale di A è sempre
uguale alla percentuale di T, e la percentuale di C è sempre uguale alla
percentuale di G. Questa regola non è valida nel caso dell’RNA.

Delbrück e Pauling pensarono che un gene doveva essere costituito da due parti complementari, nel senso di superfici
complementari che possano fare ciascuna da stampo per la replicazione. È evidente come questa idea si sia poi rivelata esatta
nella struttura a due filamenti complementari del DNA.
Dopo l’identificazione del DNA come materiale genetico, vari laboratori cominciarono a interessarsi alla sua struttura
tridimensionale utilizzando per lo più le tecniche che erano state messe a punto e già applicate con successo allo studio della
struttura delle proteine (ovvero prendere uno stampo dell’originale e duplicarlo). Tra questi ricordiamo Linus Pauling, Maurice
Wilkins e Rosalind Franklin.
La tecnica che si è dimostrata fondamentale per risolvere la struttura del DNA è stata la diffrazione dei raggi X, anche se altri tipi di
informazioni ottenute con metodi diversi sono state pure importanti.
La tecnica della diffrazione dei raggi X richiede che la macromolecola che si vuole analizzare possa essere ottenuta in forma di
cristallo in cui le molecole, e quindi gli atomi che le compongono, sono tutte allineate in maniera ordinata.
Il DNA può essere ridotto in forma di fibre in cui le lunghe molecole del DNA sono orientate più o meno parallelamente l’una
all’altra. Queste fibre di molecole orientate permisero di ottenere delle immagini di diffrazione dei raggi X che, anche se non ottimali
consentirono di ricavare alcuni parametri strutturali.
Nel 1952 Franklin produsse immagini di DNA visto in raggi X molto buone e fu proprio su queste immagini che Crick e Watson
basarono i loro studi; Crick guardando le immagini di Franklin, si rese conto che stava vedendo un’elica e cercò di studiarne i
parametri.
Nel 1953 Watson cercò un modo per appaiare le basi e si rese conto che se si appaiava A con T e G con C si ottene- vano due
coppie le cui estremità avevano la stessa distanza. La cosa più importante era che le coppie così formate erano
sovrapponibili e, quindi, in grado di formare molecole di lunghezza praticamente infinita se si impilavano una sull altra.
Decisero di disporre i due filamenti zucchero-fosfato all esterno e di sistemare le basi affacciate all interno della
struttura. Questa soluzione, insieme all idea di mettere di fronte una A a una T e una C a una G, permetteva allo stesso
tempo di giustificare la regolarità del diametro della doppia elica (ogni coppia di basi è costituita da una purina e una
pirimidina) e di dare una spiegazione logica alla regola di Chargaff (la quantità di A è uguale alla quantità di T e la
quantità di G è uguale alla quantità di C). La struttura del DNA era dunque risolta.
L accoppiamento tra le basi avviene sempre tra una prima su un filamento ed una piramidina sull altro.
I due filamenti che costituiscono il DNA sono complementari, ovvero la sequenza di un filamento detta la sequenza
del filamento compagno
Questo appaiamento è molto specifico:
- la guanina può appaiarsi solo con la citosina, attraverso 3 legami e Crick dissero che il DNA a idrogeno.
- l adenina con la timina, attraverso due laghi a idrogeno.
Questi legami a idrogeno sono mediati da idrogeno che va a legarsi ad ossigeno e azoto.
L appaiamento avviene solo se le basi azotate si trovano ad una distanza ottimale per formare legami a idrogeno.
Una caratteristica importante del modello è che le due catene polinucleotidiche sono “antiparallele”, cioè sono disposte
con una polarità 5' → 3' opposta l una rispetto all altra; i due filamenti sono costituiti dall alternanza di residui di
deossiribosio e di gruppi fosfato, mentre le basi sporgono lateralmente per appaiarsi con quelle dell altro filamento.
La doppia elica (duplex) del DNA ha una struttura regolare, destrorsa, compie un giro completo ogni 34 Å (armnstrong) e
ha un diametro di circa 20 Å. La distanza tra due coppie che si sovrappongono è uguale a 3,4 armnstrong, mentre la
distanza tra due coppie consecutive è di 3,4 nanometri.
Tra due coppie che si sovrappongono ci sono 10 coppie di basi.
Watson e Crick dissero che il DNA fisiologico ha una struttura a B.
L’elica è destrorsa, ovvero un elica che gira da destra. Siccome è necessaria la rotazione vi è un passo dell’elica, la
distanza tra due coppie che si sovrappongono è 3,4 armnstrong.
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
’
 L elica presenta un asimmetria dovuta alla posizione delle molecole di deossiribosio ai lati delle basi: infatti, come
conseguenza dell opposta polarità 5' → 3' delle due eliche, i due zuccheri di ciascuna coppia di nucleotidi si
vengono a trovare dallo stesso lati. Questa asimmetria genera nella doppia elica due solchi di dimensioni diverse:
-Solco minore
-Solco maggiore: ha molti più atomi che possono essere donatori o accettori di legami a idrogeno; ha un
“linguaggio” più vario infatti l alfa elica delle proteine va a legarsi a questo solco.

Il DNA ha una struttura a doppia elica in cui le catene polinucleotidiche presentano una parte idrofilica (lo scheletro zucchero-
fosfato) e una parte idrofobica (le basi azotate). Gli scheletri zucchero-fosfato si trovano all’esterno, a contatto con l’acqua,
mentre le basi si dispongono all’interno per evitare l’ambiente acquoso. La stabilità della doppia elica dipende da vari fattori:
• Legami idrogeno tra le basi: tre tra le coppie G-C e due tra le coppie A-T, essenziali per la specificità del legame ma
non sufficienti da soli a garantire la stabilità.
• Effetto idrofobico dello stacking: le basi azotate si impilano parzialmente lungo l’asse dell’elica, riducendo il contatto
con l’acqua e contribuendo alla stabilizzazione della struttura.
• Interazioni deboli tra orbitali degli anelli aromatici: rafforzano ulteriormente la stabilità della doppia elica.
La stabilità varia in base alla composizione delle basi: il DNA ricco in G-C è più stabile di quello con molte A-T. Inoltre, la
particolare sequenza dei nucleotidi influisce sull’impilamento e sulla stabilità complessiva.
Infine, la doppia elica non è perfettamente regolare, poiché le forze di repulsione e l’impilamento delle basi determinano
variazioni strutturali descritte da tre parametri principali:
• Twist: angolo tra due coppie di nucleotidi lungo l’asse dell’elica.
• Roll: inclinazione delle coppie di basi rispetto all’asse del DNA.
• Tilt: angolo formato rispetto allo scheletro zucchero-fosfato.
Queste variazioni possono portare a deformazioni della doppia elica, come la curvatura in presenza di specifiche sequenze di
basi.

La struttura a doppia elica del DNA, proposta da Crick e Watson, è nota come forma B ed è stata determinata tramite diffrazione a
raggi X in condizioni di alta umidità, simili a quelle cellulari. Tuttavia, esistono altre conformazioni del DNA che variano in base alle
condizioni ambientali o alla sequenza di basi. Le principali alternative sono la forma A e la forma Z.
Forma A:
-Si ottiene riducendo l’umidità.
-È destrorsa come la forma B, ma con una maggiore angolazione delle coppie di basi.
-Ha 11 coppie di basi per giro, un passo dell’elica di 25 Å e un diametro di 23 Å, risultando più “tarchiata” rispetto alla forma B.
-È presente anche in vivo in duplex di RNA-RNA o DNA-RNA, poiché il gruppo –OH in posizione 2’ del ribosio impedisce
l’assunzione della forma B.
Forma Z:
-È sinistrorsa, unica tra le forme del DNA.
-Ha un diametro di 18 Å e un passo dell’elica di 46 Å, apparendo più “magra e allungata” rispetto alla forma B.
-È stata scoperta in DNA sintetici con sequenze alternate di G e C, ma esistono prove della sua presenza in piccole quantità nelle
cellule.
-È caratterizzata da un cambiamento di orientamento del legame glicosidico tra guanina e deossiribosio, con alternanza tra
conformazioni syn e anti, conferendole un aspetto a zig-zag, da cui il nome “Z”.
-Sono state identificate proteine che si legano specificamente al DNA Z, suggerendo un possibile ruolo biologico.
’
’
’
’
Oltre alle classiche strutture a singolo filamento o doppia elica, in particolari condizioni il
DNA può formare anche regioni a tripla elica. Sebbene il loro ruolo naturale non sia
dimostrato, queste strutture suscitano interesse per il potenziale utilizzo come inibitori
specifici di geni bersaglio.
Un tratto di DNA a doppia elica con un filamento ricco di pirimidine e l’altro di purine può
accogliere nel solco maggiore una terza catena polinucleotidica composta di sole
pirimidine. Questa catena ha la stessa polarità 5’→3’ del filamento purinico, ma opposta
rispetto al filamento pirimidinico originale.
Le tre basi (due pirimidine e una purina) si orientano verso l’interno della struttura e
formano legami idrogeno non canonici detti appaiamenti di Hoogsteen, che sono alla
base di molte altre interazioni tra acidi nucleici.

Il quadruplex è una struttura formata da quattro tratti di DNA o RNA a

singolo filamento, ciascuno contenente almeno tre G consecutive. Questi
segmenti si affiancano e vengono stabilizzati da legami idrogeno di
Hoogsteen tra le G, diversi dai classici legami Crick e Watson.
Il tipo più comune è il quadruplex intramolecolare, in cui un singolo
filamento di DNA si ripiega su sé stesso tre volte per formare la struttura.
Esistono anche quadruplex intermolecolari, in cui le sequenze di G si
trovano su due o quattro filamenti distinti. I quattro filamenti possono
essere antiparalleli o, in alcuni casi, avere lo stesso orientamento.
I quadruplex di G si trovano in diverse molecole strutturate di RNA e
DNA, e si pensa che possano essere presenti nei telomeri dei cromosomi
eucariotici, con possibili implicazioni biologiche

Le ripetizioni invertite sono coppie di sequenze identiche presenti in un duplex

di DNA oRNA ma in orientamento opposto. Quando queste ripetizioni sono
adiacenti, formano una sequenza palindromica, che è identica su entrambi i
filamenti se letta nella stessa direzione 5’→3’.Dal punto di vista strutturale, le
sequenze ripetute invertite possono portare alla formazione di due tipi di
strutture:
-Struttura cruciforme: si forma nel DNA duplex quando ciascun filamento si
ripiega su sé stesso, generando due “steli” appaiati e due “anse” non appaiate.
-Struttura a forcina: si forma in un singolo filamento di RNA o DNA, dove una
sequenza trova una regione complementare nelle vicinanze, creando uno
stelo a doppia elica con un’ansa.
Queste strutture sono particolarmente importanti per l’RNA, poiché essendo a
singolo filamento, tende a ripiegarsi su sé stesso formando strutture
tridimensionali complesse, come la struttura a trifoglio dei tRNA.
Dato il numero limitato di basi (A, U, G, C), è comune trovare brevi tratti
ripetuti e invertiti lungo le sequenze di acidi nucleici, portando a diversi modi
alternativi di appaiamento intramolecolare.

La struttura B del DNA descritta da Crick e Watson è molto regolare, ma

nella realtà presenta variazioni locali dovute alle interazioni di impilamento
tra le basi. Un caso ben studiato è quello del DNA intrinsecamente curvo o
piegato.
Le coppie di basi adiacenti non sono sempre perfettamente parallele, ma
formano piccoli angoli che variano in base alla sequenza:
-Due coppie A-T tendono a piegarsi verso il solco minore.
-Due coppie G-C tendono a piegarsi nella direzione opposta.
In una sequenza casuale, questi piegamenti si compensano, mantenendo il
DNA quasi dritto. Tuttavia, se una sequenza contiene A-T ripetuti ogni 10
basi (cioè a ogni giro di elica), le curvature si sommano, creando un DNA
curvo.
Queste variazioni strutturali sono descritte dai parametri geometrici Tilt e
Roll. L’accumulo di modifiche in queste angolazioni può rendere il DNA
molto rigido, come nel cinetoplasto del tripanosoma.
La sequenza del DNA, quindi, influenza la forma della doppia elica e la
presenza di DNA curvo in vivo suggerisce che abbia una funzione
biologica, che verrà approfondita nello studio della cromatina.