PRINCIPI DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

Definizione di biologia molecolare

Nel 1938 Weaver definisce la biologia molecolare come la scienza che permette di spiegare
le manifestazioni della vita in termini fisico-chimici a livello delle molecole.
Tra questa definizione e la prossima (quella del 1975) sono subentrate nuove scoperte.
Nel 1975 Baltimore definisce la biologia molecolare lo studio di come il DNA, l’RNA e le
proteine sono intercorrelate.
Oggi viene definita come la scienza che studia le interazioni tra le macromolecole ad alto
contenuto informazionale: acidi nucleici e proteine.

Le fasi dello sviluppo della biologia molecolare

➔ 1° FASE: anni ‘40/’60
Riguarda la caratterizzazione del DNA e la sua funzione nell’eredità.

L'informazione contenuta nel DNA viene trasmessa alle proteine sotto forma di
codice genetico, passa attraverso gli RNA per poi arrivare alle proteine.
Le informazioni che sono contenute nel codice genetico sono le informazioni presenti
nei geni. I geni sono costituiti da delle regioni codificanti e non codificanti. Le regioni
codificanti prendono il nome di esoni, le seconde di introni.
Queste informazioni vengono trasferite alle proteine mediante la replicazione o
duplicazione del dna (informazioni dalla cellula madre alla cellula figlia), ogni singola
cellula riporta questa informazione tramite il processo di trascrizione sulla molecola di
RNA messaggero; a questo punto avendo trascritto l’informazione sull’RNA
messaggero, questa viene trasferita alle proteine con la traduzione. Il sinonimo di
traduzione è sintesi proteica (si passa dagli acidi nucleici del RNA agli amminoacidi
delle proteine).

Negli anni ‘40/’60 avviene la conoscenza della struttura del DNA: intesa come
molecola della vita che contiene ereditarietà delle informazioni. In questi anni viene
anche scoperto il codice genetico inteso come lettura delle basi azotate in triplette da
decodificare in amminoacidi.

➔ 2° FASE: scoperta degli enzimi di restrizione, i quali hanno permesso la

riproducibilità dei frammenti di DNA. In questa seconda fase vengono introdotti i
vettori di clonaggio in cui molecole di DNA che hanno origine da virus, plasmidi e
fagi, vengono utilizzati per studiare la funzionalità e il ruolo di altri geni. Un altro
evento molto importante in questa fase sono le tecniche di sequenziamento degli
acidi nucleici che hanno permesso di conoscere l'esatta sequenza delle basi azotate
di un gene, per tutta la molecola di DNA.

Per studiare un gene è necessario il suo isolamento, il clonaggio e l’analisi di

sequenza hanno permesso di definire delle regioni codificanti (esoni) e la presenza di
regioni con una funzione regolatoria, presenti a monte o a valle di un gene (a monte:
prima, a valle: dopo).
Queste informazioni ci permettono di parlare di open reading frame (sequenza
codificante di lettura).
 ➔ 3° FASE: definizione di unità trascrizionale
Fino agli anni ‘80 si sapeva che l’informazione passava da DNA ad RNA a proteine
(informazione unidirezionale), successivamente ci fu la scoperta dei retrovirus ovvero
di virus dotati di un enzima ovvero la trascrittasi inversa che è in grado di sintetizzare
da una molecola di RNA, una molecola di DNA.
Questo principio ha portato alla scoperta di quello che è chiamato DNA
complementare (copia di DNA che è complementare a una molecola di RNA). Oggi
questo principio della trascrittasi inversa è utilizzato quando viene fatto il test
Real-time in PCR (nel momento in cui si ha un infezione da RNA si fa questo test,
per capire se si è positivi o no per quanto riguarda i virus ad RNA).
La conoscenza della trascrittasi inversa ha aiutato a conoscere meglio le infezioni da
virus.
Nella terza fase, un’altra indagine è stata quella che i geni sono interrotti (divisi in
esoni e introni) e vi è un rimaneggiamento dell’RNA: pertanto l'idea che ci fosse 1
gene= 1 proteina non era più corretto perché il fatto di parlare di rimaneggiamento
vuol dire che il nostro DNA di partenza può non subire uno splicing di partenza ma
alternativo. Nel processo di splicing alternativo è possibile non tagliare alla giunzione
esone-introne ma un po’ più avanti (all’interno di un introne). Questo fa sì che un
gene può codificare per più proteine (cambia il frame di lettura).
Nella terza fase abbiamo anche la scoperta di elementi trasponibili ovvero sequenze
in grado di spostarsi all'interno del genoma (i geni sovrapposti sono tipici del DNA
mitocondriale.
Si sono individuate, in questa fase, anche delle sequenze ripetute all'interno del
genoma degli organismi chiamate sequenze ridondanti (pare al momento che non
abbiamo nessuna funzione).
Si è approfondito lo studio dell'attivazione e dell’inattivazione selettiva di alcuni geni:
questa è chiamata regolazione dell'espressione genica. La regolazione genica è
importante perché ogni cellula di un diverso tessuto e un diverso organo svolge una
precisa funzione tramite le proteine, quando queste non devono funzionare più
subentra un’ulteriore proteina per far cessare lo svolgimento di quella determinata
funzione (gene regolatore). Per questo motivo alcuni geni sono espressi in alcuni
tessuti e in altri no oppure altri geni sono espressi solo nelle prime fasi dello sviluppo.
Infine in questa fase vi è anche lo studio dell'evoluzione a livello molecolare
attraverso l’analisi di sequenze e una banca dati contenente tutto il genoma di un
individuo o di una specie. Questo permette di andare a studiare l’evoluzione e quindi
di andare a vedere se ci sono geni affini presenti, ad esempio tra un uomo e un
un’altra specie come un gatto.

Lo scopo attuale della biologia molecolare è quello di andare a studiare e comprendere i

geni presenti nel DNA, studiarne le funzioni al fine di prevenire o comunque aiutare a curare
determinate patologie.

Storia della biologia molecolare

Analizziamo la storia degli esperimenti che hanno portato alla conoscenza della struttura del
DNA.

1868 Miescher, biologo svizzero: isolò una sostanza contenente fosforo (chiamata nucleina)
Miescher andava negli ospedali a recuperare le garze infette e da qui estraeva i leucociti
presenti. Da queste riuscì a isolare i nuclei (chiamata da lui nucleina), ricca di azoto e
fosforo e non contiene zolfo. La quantità di nucleina aumentava quando le cellule andavano
incontro a divisione, quindi il biologo credeva che la nucleina si duplicasse passando dalla
cellula madre alle cellule figlie. Pensava non fosse coinvolta nella trasmissione dei caratteri
acquisiti (ciò che ci fa diversi da un soggetto all’altro) perché vide che la nucleina estratta da
diverse specie mostrava identiche proprietà chimiche.

1928 Griffith, medico inglese: portò avanti un esperimento sullo Streptococcus Pneumoniae
(batterio della polmonite umana)
Griffith stava studiando lo sviluppo di un vaccino contro la polmonite e vide che in realtà
esistevano due ceppi: ceppo R benigno e il ceppo S maligno. Le colonie di ceppo R sono
delle colonie con un aspetto rugoso e le colonie di ceppo S avevano un aspetto liscio.
Definì che esistevano due ceppi diversi in base all’osservazione:
● il ceppo R non avendo capsula protettiva, viene riconosciuto dal sistema immunitario
dell'ospite e viene distrutto e per questo è benigno;
● il ceppo S è costituito da una capsula polisaccaridica che previene il riconoscimento
dal sistema immunitario e lo bypassa e causa la polmonite.
Iniziò a iniettare all'interno dei topi batteri con ceppo S vivi e il topo moriva, invece quando
iniettava i batteri con ceppo R vivi il topo risultava sano. Allora iniettò batteri con ceppo S
uccisi al calore e il topo ancora risultava sano, mentre con i batteri con ceppo S uccisi al
calore iniettati insieme a batteri con ceppo R vivi portavano alla morte del topo.
Prelevando il sangue da quest’ultima cavia nota quello che è chiamato fattore di
trasformazione: qualcosa dei batteri con ceppo S che portava comunque alla morte del topo.
Quindi c'era una qualche sostanza in grado di trasformare le cellule del ceppo R provocando
un cambiamento ereditario.

1944 Avery- Mc Leod- Mc Carty: continuarono l’esperimento sullo streptococco andando a

seminare gli pneumococchi lisci sulle piastre di coltura
Eseguirono il seguente esperimento:
1. attraverso la lisi cellulare (rottura cellule), le
cellule vengono raccolte in una beuta e a questo
punto il contenuto si frammenta in diverse provette
(in una le proteine, in una l'RNA, in un'altra il DNA, in
una i lipidi e infine in un’altra i polisaccaridi);
2. a queste provette viene aggiunta una
provetta di controllo con batteri con ceppo R vivi non
virulenti;
3. ogni provetta viene versata in un nuovo disco
per vedere cosa cresce e cosa no.

Si arrivò alla conclusione che il fattore di

trasformazione è presente nel DNA. Infatti il DNA è il
materiale genetico dei batteri e dei virus e quindi le
proprietà genetiche possono essere trasferite da un ceppo batterico a un altro estraendo il
DNA dal primo ceppo e somministrando al secondo.

1949 Chargaff, chimico austriaco: andò a osservare caratteristiche chimiche che

permettevano a questa molecola (DNA) di contenere le informazioni genetiche, in particolare
analizzo il DNA di diverse specie, lo frammentò e mediante la cromatografia su carta andò a
separare questa frammentazione
Dai suoi studi chimici vennero fuori le regole di Chargaff:
1. la composizione dei nucleotidi del DNA varia tra una specie e l'altra e quindi gli
stessi nucleotidi non si ripetono nello stesso ordine,
2. in tutto il DNA (non importa da che tessuto e organismo provenga) la quantità di
adenina è simile alla quantità di timina e la quantità di guanina è simile alla quantità
di citosina.

Abbiamo 4 basi azotate per il DNA:

- adenina e guanina (purine), aventi
due anelli chimici;
- timina e citosina (pirimidine), con un
anello chimico.
L’appaiamento tra basi del DNA avviene
sempre con le stesse basi: la timina con
l’adenina (due legami idrogeno) e la
citosina con la guanina (tre legami
idrogeno).

1952 Hershey e Chase, genetisti statunitensi: il materiale genetico è il DNA o le proteine?

Utilizzarono il batteriografo T2, il quale è un virus in grado di infettare i batteri
costituito da un centro chiamato core di DNA impacchettato in un rivestimento proteico.
Il batteriografo T2 infetta il batterio e circa 2 minuti dopo l'infezione va incontro a lisi e libera
decine di particelle virali. Il quesito è: quale parte del batteriografo entra all'interno della
cellula batterica? Andarono a utilizzare due culture batteriche, una con T2 marcato con
fosforo 32 (radioisotopo che si va a sostituire al posto del fosforo presente nel DNA) e
utilizzando lo zolfo 35 (fa la stessa cosa del fosforo però per le proteine), ciò per capire cosa
entra nella cellula batterica.
Conclusione: il DNA viene ereditato e si utilizza quello per replicarsi (soltanto il DNA è
ereditato dai fagi discendenti).

1952 Franklin, chimica inglese: si occupò dello studio della struttura del DNA con una
tecnica chiamata diffrazione ai raggi X
Arrivò alla conclusione che l’unica struttura che il DNA potesse avere è quella di una doppia
elica.

1953 Watson e Crick: modello della struttura del DNA

Dalle ricerche della Franklin, i due pubblicarono i dati ottenuti del modello della struttura del
DNA (vincendo il premio Nobel). Individuarono le seguenti caratteristiche:
- forma di doppia elica,
- diametro 2 nm,
- distanza delle basi ⅓ di nm,
- un giro intero (10 basi azotate) 3,4 nm,
- lo zucchero e i fosfati si trovano all'esterno della struttura,
- una purina lega una pirimidina (adenina con timina e guanina con citosina),
- le basi azotate idrofobiche,
- le due strutture esterne antiparallele (5’ - 3’, 3’ - 5’),
- queste catene polinucleotidiche vedono le basi azotate unite ad uno scheletro di
zuccheri e fosfati,
- lo zucchero si lega al gruppo fosfato mediante legami fosfodiesterici.

Quando si attorcigliano i due filamenti antiparalleli formando la doppia elica, si vengono a

formare due solchi (minore 12 A/1,2 nm e maggiore 22 A/2,2 nm).

Nucleoside: lo zucchero si lega alla

base azotata.
Nucleoside monofosfato, difosfato,
trifosfato: l'aggiunta del gruppo
fosfato permette di parlare di
nucleotide.

Come avviene il legame

fosfodiestere? Avviene
tra lo zucchero 3 primo
OH che compie un
attacco nucleofilo sul
gruppo fosfato in alfa (gruppo fosfato può essere alfa beta e gamma, alfa interno) e vengono
liberati due gruppi fosfati (pirofosfato) e acqua.

- Legame tra base azotata e zucchero.

- Carbonio in posizione 1 e azoto in posizione 3 (basi pirimidiniche) per le basi
puriniche azoto in posizione 9.
- I gruppi fosfato si legano al carbonio in posizione 5.

Differenze tra DNA ed RNA: l’uracile (pirimidina) nell’RNA al posto della timina e lo zucchero
ovvero desossiribosio e ribosio (un gruppo OH in più).

La carica negativa del DNA è data dall’ossigeno presente sui gruppi fosfato.

Superavvolgimenti
Questa molecola di DNA che si avvolge non forma un unico giro ma si superavvolge. I due
filamenti sono avvolti uno sull'altro e la molecola può avvolgersi su se stessa formando
superavvolgimenti. I superavvolgimenti creano delle estremità libere che vengono legate da
delle proteine (nel cromosoma eucariotico queste strutture prendono il nome di istoni).
L’avvolgimento su se stesso aumenta l’avvolgimento del DNA (avvolgimento positivo).
L’avvolgimento nel senso opposto porta ad un superavvolgimento negativo (svolgimento
della molecola di DNA).
Questo permette alla cromatina di passare dall’eucromatica (decondensata) alla
eterocromatica (condensata).
Intervengono enzimi topoisomerasi nell’avvolgimento e nello srotolamento della molecola di
DNA (ciò serve nel momento della copiatura dell’informazione).

Il DNA può assumere tre conformazioni: A-B-Z

Il DNA possiede una struttura dinamica e può quindi
assumere diverse forme ad elica, queste tipologie sono A, B
e Z. Le prime due tipologie sono legate a differenze dei
ripiegamenti dell’anello dello zucchero a 5 atomi di carbonio
(Watson e Crick descrissero una struttura di tipo B).
Generalmente la forma di tipo B si presenta quando vi è un
alto grado di umidità o una bassa forza ionica; contiene 10
paia di basi per giro d'elica e un solco maggiore più ampio e
un solco minore più chiuso.
La forma A è presente in condizioni non fisiologiche nel
momento in cui il DNA viene disidratato (basso contenuto di
acqua) e quindi fa sì che la struttura del DNA sia più compatta e anche in ogni giro vi sarà la
presenza di 11 paia di basi; il suo solco maggiore è più stretto rispetto alla forma B, mentre il
solco minore è più largo (dipende da meno molecole d’acqua).
A seconda delle interazioni assume una forma o l’altra cambiando le sue caratteristiche.
La forma Z viene assunta dal DNA nel momento in cui avvengono delle metilazioni (reazione
chimica che vede l'aggiunta di un gruppo metile CH3 a livello della base) o tratti di DNA
ricchi di basi C e G.
Il DNA-Z assume una configurazione sinistrorsa anziché destrorsa.
La forma B è statica, la forma A metastabile e quella Z compare solo in alcune circostanze.
Possiamo quindi dire che il DNA è soggetto a fluttuazioni indotte dagli avvolgimenti o dagli
allungamenti a cui esso può andare incontro.

Questo permette al DNA di incorporare sostanze che ne permettono la marcatura: un

esempio è l’etidio bromuro. In particolare quest'ultimo ha una struttura planare simile a
quella delle basi azotate, idrofobico e la sua caratteristica è quella che se è irradiato da un
fascio di luce ultravioletta emette una radiazione nel rosso permettendo di fare ricerche in
laboratorio sul DNA. Il fatto che l’etidio si inserisce aumenta lo spazio tra le basi, quindi
andrà a cambiare quella che è la conformazione del DNA. Questa capacità si chiama
metastabilità ovvero capacità di assumere configurazioni instabili che in condizioni normali
revertono alla configurazione B.

Replicazione del DNA

Attraverso questo processo si formano due repliche identiche di DNA da una molecola di
DNA genitore (accade durante la mitosi).
Si devono aprire avvolgimenti e superavvolgimenti e si devono rompere i legami tra le basi
azotate. Partendo da una molecola di DNA parenterale entrambi i filamenti possono fungere
da stampo, pertanto ciascuna doppia elica figlia è identica alla sequenza duplex parenterale
ed è formato da un filamento di vecchia sintesi e uno di nuova sintesi. Questo meccanismo
di replicazione sarà detto semiconservativo.
Come sono giunti a questa conclusione? Esperimento condotto da Meselson e Stahl, i quali
utilizzarono una marcatura con isotopi pesanti (azoto 15). L’utilizzo dell’azoto 15 ha
permesso di seguire la replicazione di queste molecole (azoto presente nelle basi azotate).

Il dna contiene i geni ovvero le nostre sequenze nucleotidiche. Il DNA è coinvolto nel
processo di trascrizione (viene copiato un filamento di DNA su un filamento di RNA
mantenendo la sequenza nucleotidica per poi essere tradotto in una sequenza
amminoacidica che poi darà origine alle proteine).
 Dogma centrale della biologia
molecolare: l'informazione
genetica può essere contenuta
nel DNA o dell'RNA?
I geni cellulari sono costituiti da
DNA ma i genomi virali
possono essere costituiti da
RNA. Il DNA è convertito in
RNA dalla trascrizione mentre
la trascrizione inversa può
convertire l'RNA in DNA. In
questo caso il genoma RNA
presenta un enzima, trascrittasi
inversa, che permette di
retrotrascrivere da una
molecola di RNA a una
molecola di DNA
complementare.

La traduzione dell'RNA in proteine è unidirezionale.

Agli inizi degli anni ‘60 i biologi molecolari sono riusciti a decriptare il codice genetico. Sono
riusciti a capire che le 4 basi azotate presenti nel DNA, venivano tradotte con soli 20
amminoacidi (venivano scritte 20 parole con solo 4 lettere ovvero le basi azotate). Sono
dunque arrivati alla conclusione che il codice genetico viene letto in triplette ovvero i codoni.
Questa scoperta è stata ottenuta utilizzando un fago T4: se andiamo a dividere un codice a
due basi avremmo ottenuto solo 16 amminoacidi, nel caso in cui i gruppi fossero stati di 3
basi avremmo ottenuto 64 amminoacidi. Dunque tre basi codificano per uno stesso
amminoacido.
61/64 gruppi codificano per gli amminoacidi.

I primi tentativi di decodificazione del codice genetico

 Il ribosoma si lega
leggendo la tripletta
dell’mRNA, il tRNA.

Il codice genetico
 ● 3 triplette non codificano alcun amminoacido ovvero UAA, UGA e UAG (codoni di
stop) e sono coinvolti nella terminazione della sintesi proteica
● AUG codifica per la metionina (tutte le proteine iniziano con una metionina)
● UGG codifica solo per il triptofano
● tutti gli altri amminoacidi vengono codificati da due o più codoni sinonimi
Il codice genetico è SEMICONSERVATIVO e DEGENERATO (perché più codoni codificano
per uno stesso amminoacido).

Il codone AUG:
● è la tripletta che codifica per
la metionina,
● rappresenta anche il
codone di inizio di tutte le catene
proteiche nei procarioti e negli
eucarioti,
● il suo corretto
posizionamento sul ribosoma è
indispensabile per determinare la
corretta fase di lettura (il reading
frame), cioè il punto di inizio della
lettura della sequenza dell’mRNA
da parte degli aminoacil-tRNA, per
la sintesi proteica. Se non viene
correttamente letta la metionina si
va incontro a mutazioni, ad errori
nella lettura ottenendo così
proteine mutate che non svolgono
correttamente la loro funzione.

Il codice genetico è quindi degenerato, non sovrapposto e senza spaziature ed è inoltre

praticamente universale.
Il sistema di trasmissione dell’informazione genetica dal DNA alle proteine avviene
attraverso specifiche triplette che codificano in tutti gli organismi procarioti ed eucarioti gli
stessi amminoacidi.
Esistono rare eccezioni specie-specifiche a questa universalità, in particolare nei mitocondri,
dove per esempio UGA è il codone per il triptofano anziché essere una tripletta di
terminazione e AUA quello per la metionina.
Rimane comunque valida l’universalità del codice genetico in tutti gli organismi viventi come
espressione di una sofisticata e intelligente macchia di trasmissione dell'informazione
genetica.

La trascrittasi inversa
Nel 1970 il virologo Temin, in virioni di virus respiratorio sinciziale (VRS):
- vennero isolati in modo indipendente da Baltimore da due virus ad RNA tumorali
- vinse il premio Nobel nel 1975 per la Medicina (con Renato Dulbecco).
Retrovirus:
- nei retrovirus (HIV) non viene rispettata l'unidirezionalità dell'informazione essi hanno
un genoma costituito da molecole di RNA a singolo filamento nel ciclo di infezione;
- la molecola di RNA è convertito in DNA a singolo filamento dal processo della
trascrittasi inversa, grazie una DNA POLIMERASI RNA DIPENDENTE,
- il DNA a singolo filamento ottenuto viene poi convertito in DNA a doppio filamento.

Questo DNA duplex diventa parte del genoma della cellula ospite e viene ereditato come
qualunque altro gene quindi la trascrittasi inversa permette a una sequenza di RNA di
può essere recuperata e usata come DNA in una cellula.

RNA rappresenta molecola genetica di alcuni virus

Dunque questo è un enzima utilizzato per generare DNA complementare (cDNA) da una
molecola di RNA stampo, un processo associato:
● a retrovirus (inibitori di RT sono ampiamente utilizzati come farmaci antiretrovirus)
● a telomerasi, un enzima adibito alla replicazione delle estremità dei cromosomi e di
alcuni elementi genetici mobili (retrotrasposoni, particolarmente abbondanti nelle
piante, di cui costituiscono una frazione consistente dell'intero genoma, e nei
mammiferi, compresi gli esseri umani, esempio le sequenze LTR).

Ha tre attività biochimiche sequenziali:

- DNA polimerasi RNA-dipendente,
- ribonucleasi H (enzima che degrada l’RNA ibrido),
- DNA polimerasi DNA-dipendente.
Queste attività sono tipiche dei retrovirus per convertire I'RNA genomico a singolo filamento
in DNA a doppio filamento per la successiva integrazione nel genoma dell'ospite.

La reazione di RT è ampiamente utilizzata in laboratorio per convertire molecole di RNA in

DNA con applicazioni per il clonaggio molecolare, RNA-sequencing, la PCR, e l'analisi
dell'espressione genica in genere.
Le transcriptasi inverse includono:
1. telomerase reverse transcriptase che mantiene la lunghezza corretta dei telomeri nei
cromosomi eucariotici,
2. HIV-1 reverse transcriptase del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (PPB 1
HMV) formata da due subunità, del peso molecolare di 66 e 51 kDa,
3. AMV reverse transcriptase del virus della mieloblastosi aviaria, come I'HIV è
costituito da due subunità, una 63 kDa e una di 95 kDa
4. M-MLV reverse transcriptase del I virus della leucemia murina di Moloney, un singolo
monomero di 75 kDa.

Il campo della biologia molecolare si concentra sullo studio dei meccanismi molecolari
coinvolti nei diversi processi cellulari. In particolar modo fa sì che si avvalga dei processi di
clonaggio e degli enzimi di restrizione.

Gli enzimi di restrizione sono delle nucleasi che sono in grado di tagliare all’interno di un
legame fosfodiesterico (legame tra i nucleotidi adiacenti in una catena polinucleotidica come
il DNA).
Abbiamo due tipi di nucleasi:
● ENDONUCLEASI, ovvero gli enzimi che tagliano dentro la nostra sequenza
polinucleotidica;
● ESONUCLEASI, ovvero gli enzimi che tagliano alle estremità.
In particolare tra le nucleasi possiamo ricordare:
- le DNAsi, cioè degli enzimi che tagliano solo il DNA;
- l’RNAsi, cioè enzimi che tagliano solo l’RNA;
- RNasiH, ovvero l’enzima che degrada l’RNA che è legato al DNA quando si forma
l'heteroduplex (quando un virus per infettare la cellula ospite per replicare il proprio
genoma attiva la trascrittasi inversa).

Le esonucleasi
Sono delle fosfodiesterasi perchè tagliano il legame fosfodiesterico. Abbiamo due tipi di
esonucleasi:
● di tipo a, come il veleno di serpente;
 ● di tipo b, presente nella milza di bovino.
Gli enzimi di tipo a tagliano il legame tra il carbonio in 3’ (zucchero) con il gruppo fosfato
(ovvero il legame estere). Gli enzimi del gruppo b idrolizzano il legame tra il carbonio in 5’ e
il gruppo fosforico.
Pertanto entrambe utilizzano le estremità libere.

Le endonucleasi
Sono enzimi che tagliano all’interno della molecola e pertanto non richiedono un gruppo
idrossilico libero.
Prima degli anni ‘80 la frammentazione del DNA era definita et random (casuale). Con la
scoperta degli enzimi di restrizione e in particolare delle endonucleasi, questa casualità delle
frammentazioni è venuta meno poiché vi era una riproducibilità dell’esperimento.
Quello che si è visto è che esistono tra i 300 e i 400 enzimi di restrizione che sono stati
purificati da specie diverse di procarioti.
Tra le caratteristiche degli enzimi di restrizione troviamo:
- presentano una simmetria binaria rispetto all’asse centrale (sono uguali se
consideriamo un asse centrale dato che gli enzimi di restrizione riconoscono
particolari sequenze presenti sul DNA che prendono il nome di siti di restrizione),
- sono caratterizzate palindromiche (si legge uguale da una parte e dall’altra,
sequenze ripetute e invertite),
- tagliano solo il duplex (DNA a doppio filamento),
- i tagli in 5’ o in 3’ producono delle estremità sfalsate, i tagli al centro delle estremità
nette.

Esistono due tipi di tagli: NETTE e SFALSATE (o APPICCICOSE)

I diversi nomi degli enzimi di restrizione derivano dal microrganismo in cui sono stati isolati.
ESEMPIO: EcoR1 che sta per Escherichia Coli Restrizione 1 ed in base a quanto sono stati
purificati vengono indicati con il numero 1,2 ecc. (R sta per restrizione).

Applicazione degli enzimi di restrizione

Serve come produzione di frammenti di DNA per clonaggio o per l’identificazione dei siti di
restrizione per la costruzione di mappe fisiche di restrizione.
Il clonaggio è una tecnica di amplificazione; i primi clonaggi usavano come vettori i plasmidi,
che è una molecola di DNA circolare in grado di autoreplicarsi. I plasmidi trasformano i
batteri e gli conferiscono resistenza agli antibiotici grazie alla presenza di particolari geni nel
loro DNA.
Diverse endonucleasi di restrizione possono tagliare un frammento di DNA e creare
sporgenze diverse.
Un vettore di clonaggio (come un plasmide) è una molecola circolare di DNA, che può
essere linearizzato in seguito al taglio con gli stessi enzimi di restrizione che abbiamo
utilizzato per ottenere il frammento di DNA. In questo modo andiamo anche a tagliare il
genoma che vogliamo studiare. Grazie a un altro enzima ovvero una ligasi potranno unirsi
con dei legami idrogeno. In questo modo otteniamo un vettore ricombinante e possiamo
effettuare un clonaggio molecolare.

Clonaggio molecolare in vettore plasmidico

Un esempio di clonaggio molecolare attraverso il vettore plasmidico pBR322.
Questo vettore plasmidico ha due siti: in un sito ci sono dei geni che forniscono resistenza
all’ampicillina, l’altro alla
tetraciclina (sono due
antibiotici).
A livello del sito che
conferisce resistenza alla
tetraciclina è presenta un
sito di restrizione che è
riconosciuto da un enzima
di restrizione particolare,
BamH1. Questo enzima di
restrizione utilizzato per
tagliare il DNA, interviene
la ligasi per legarsi avendo
come prodotto il vettore
ricombinante.

Nel momento in cui un plasmide e in particolare un vettore ricombinante va’ a infettare una
cellula batterica parliamo di trasformazione. Se invece il vettore entra in una cellula
eucariotica parliamo di trasfezione.

Il vettore circolare o ricombinante utilizzato in laboratorio per infettare delle cellule batteriche,
una volta fatta avvenire l’infezione e quindi quella che è chiamata trasformazione, si andrà a
seminare su una piastra in cui avverrà la crescita dei cloni.
 Un altro tipo di
plasmide utilizzato
come vettore è il
PUC, questo
contiene il gene
che gli conferisce
resistenza
all’ampicillina e
anche il gene
LacZ. Questo è un
gene di
Escherichia Coli
che codifica per la
beta galattosidasi
che è un enzima
che idrolizza il
legame beta 1-4
glicosidico del
lattosio e dei suoi
analoghi, questo vettore contenente il gene LacZ. Questo gene è stato ingegnerizzato in
modo da contenere un polilinker che è una sequenza nucleotidica di 100 pb, che contiene
20 siti di restrizione per 20 enzimi di restrizione differenti.
Per capire qual è il vettore ricircolarizzato e il ricombinante si utilizza l’enzima X-Gal.
Screening banche di Escherichia Coli
Dobbiamo prelevare i cloni positivi che contengono il vettore ricombinante, vanno messi a
crescere per una notte a 37 gradi in un terreno liquido. Qui si troveranno molti cloni identici
perché si replicano senza agar poiché solidifica. Questo terreno liquido può essere sfruttato
per estrarre il plasmide ricombinante dai cloni positivi (miniprep).
Analisi restrizione: taglio del plasmide con enzimi di restrizione e separazione dei frammenti
mediante gel elettroforesi.

Analisi dei frammenti di DNA con Gel elettroforesi

L'elettroforesi è una tecnica di separazione basata sul movimento delle molecole cariche in
un campo elettrico. Sotto l’influenza di un campo elettrico, molecole aventi pesi molecolari
differenti si muovono a velocità diverse, quando vengono fatte migrare all’interno di un
supporto solido.
Le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie del
supporto solido.
Una molecola carica posta all’interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di
carica opposta.

La mobilità elettroforetica di una molecola carica dipende da:

● carica netta, gli anioni (-) migrano verso l’anodo (+) mentre i cationi (+) migrano
verso il catodo (-);
● dimensioni, la resistenza esercitata sulle molecole è proporzionale alla complessità
molecolare (le molecole più grandi si muovono meno velocemente rispetto alle
molecole più piccole);
● forma, a causa delle forze di attrito, la forma della molecola influenza la mobilità, le
proteine globulari migrano più velocemente rispetto alle proteine fibrose, oppure il
plasmide superavvolto migra più velocemente rispetto al plasmide rilassato;
 ● forza del campo elettrico, maggiore è il campo elettrico applicato (voltaggio)
maggiore è la mobilità, tuttavia si ha anche un aumento del surriscaldamento.

Etidio Bromuro
E’ un colorante specifico per gli acidi nucleici, agente intercalante, si intercala tra le basi
azotate delle molecole di DNA grazie alla sua struttura planare.
Le molecole intercalate di Etidio Bromuro emettono luce fluorescente quando vengono
irradiate con luce ultravioletta. La lunghezza d’onda alla quale si ha il massimo della
fluorescenza è 300 nm.
Particolare attenzione viene prestata per la manipolazione di Etidio Bromuro, soprattutto se
è in polvere: SOSPETTO CANCEROGENO.

La strumentazione dell’elettroforesi

Il caricamento del gel

Visualizzazione agli UV

Animazione della corsa elettroforetica

Acquisizione gel di agarosio esercitazione

Blotting
Permette di riconoscere specifici frammenti di DNA mediante ibridazione con sonde
marcate.
Vantaggi:
- sensibilità elevata della tecnica,
- rivelazione specifica delle sequenze,
- metodo quantitativo.

Southern Blotting: DNA

Northern Blotting: RNA
Western Blotting: proteine

La replicazione del DNA

L’intero genoma deve essere replicato al fine che venga tramandato da una generazione
parenterale ad una figlia. Questa divisione avviene esattamente una sola volta per ogni
divisione cellulare, sia che sia un cromosoma procariote o eucariote; la replicazione avviene
sempre in ugual modo.
Qualunque sequenza di DNA è dotata di un'origine di replicazione e di una regione di
terminazione.
L’origine di replicazione e il sito di terminazione, ci permettono di parlare di unità di
replicazione. Le attività enzimatiche che controllano la frequenza di replicazione, sono
codificate da unità differenti da quelle di replicazione e per questo sono dette unità di
segregazione. Nei batteri le unità di replicazione e quelle di segregazione coincidono, negli
eucarioti invece sono distinte, questo perché nei cromosomi eucarioti si hanno più origini di
replicazione.
Come ricordiamo dall’esperimento di Meselson e Stahl si può vedere l’ appaiamento delle
basi che fornisce il meccanismo per la replicazione del DNA e in particolar modo anche i
genomi virali a doppio filamento si replicano utilizzando i singoli filamento di DNA duplex,
come stampo per la sintesi di filamenti complementari.
Invece i virus con genoma a singolo filamento usano quel filamento come stampo per
generare un filamento complementare il quale viene a sua volta sintetizzato ed utilizzato
come stampo, perciò passano da una fase intermedia, creando un doppio filamento, in
quanto questo (il doppio filamento) è una molecola più stabile.
L’inizio della replicazione del DNA impegna la cellula sia procariote che eucariote ad un
ulteriore divisione. Nel momento in cui la replicazione inizia non si ferma fino a che l'intero
genoma non è stato replicato.

Nel 1963, definirono quello che è il

modello del replicone; e cioè la
replicazione parte da un punto definito
origine di replicazione, al livello del
quale il DNA si denatura e forma la
forcella di replicazione.
La formazione della forcella, permette
l’accesso agli enzimi e alle proteine
coinvolte nella replicazione.

Il replicone
Il replicone è l’unità di replicazione.
Ciascun replicone viene acceso una e
una sola volta per ciclo cellulare.
Il replicone è costituito da quelli che sono definiti gli elementi di controllo della replicazione
nonché origine di replicazione e termine della replicazione.
L’origine di replicazione e definito come un sito operante in cis perché funziona allo stesso
modo del suo filamento. All'inizio della replicazione intervengono dei fattori proteici che
intervengono in trans, con il DNA, controllando la sua frequenza di reazione.
Le differenze dei plasmidi
I plasmidi sono dotati di molecole di DNA circolari autonome, un replicone indipendente.
Il genoma, invece, di una cellula batterica contiene una sola origine di replicazione ed è
perciò costituita da un solo replicone; di conseguenza l’unità di replicazione e quella di
segregazione coincidono. I batteri contengono un solo cromosoma, perciò hanno un corredo
apolide, e per tanto il loro sistema replicativo è definito a copia singola.
Altri organismi procarioti sono gli archaea che possono avere un origine di replicazione
singola oppure a siti multipli su uno stesso cromosoma.

Il cromosoma degli eucarioti contiene un numero elevato di repliconi, che sono distribuiti in
maniera non uniforme lungo il cromosoma, perciò presentano dei siti di replicazione multipli;
nel momento in cui avviene la replicazione tutti i repliconi lungo il cromosoma vengono
accesi contemporaneamente.

A livello mitocondriale abbiamo la presenza di un DNA circolare a doppia elica e in questo

caso abbiamo un controllo a singola copia e il loro sistema di replicazione è simile a quello
dei plasmidi.
Una regione di replicazione appare come una bolla, all’interno di una regione di DNA non
ancora replicata. Il punto in cui avviene la replicazione viene chiamato forcella replicativa, la
quale si muove in maniera sequenziale lungo il DNA.

Quando l’origine di replicazione forma un'unica

forcella, parliamo di una replicazione unidirezionale,
quando invece si formano due forcelle replicative,
parliamo di una replicazione bidirezionale.
Le attività enzimatiche coinvolte nei tre stadi sono:

​ ● Inizio: si forma il complesso proteico

primosoma;
​ ● Allungamento: si forma il complesso
proteico replisoma;
​ ● Terminazione: si formano processi poco
noti.

Esperimento condotto con una timidina marcata con

trizio.
Con una timidina, marcata con trizio, una volta
incorporata nel DNA e sottoposta ad una
autoradiografia si è potuto osservare il processo di
replicazione.
Con ciò si è potuto osservare che la replicazione
inizia a livello di un'origine di replicazione con la separazione data dalla denaturazione dei
due filamenti di DNA duplex. Si rompono pertanto i legami idrogeno tra le basi azotate e
ciascuno dei due filamenti parentali serve da stampo per la sintesi di un filamento figlio,
complementare.
Quando la replicazione è bidirezionale si formerà una struttura chiamata THETA invece la
replicazione unidirezionale formerà una struttura chiamata D-LOOP.
 Replicazione nei procarioti
I repliconi procariotici sono generalmente
circolari, questo è tipico dei cromosomi
batterici dei plasmidi e di numerosi
batteriofagi, ma anche del DNA dei
cloroplasti e dei mitocondri.
Nei batteri la replicazione è bidirezionale e
simmetrica, una forcella va in direzione
oraria, l’altra va in senso antiorario; nel sito
opposto rispetto l’origine le due forcelle si
incontrano. Perciò a monte e a valle ci sono
dei siti, chiamati, TER, di terminazione,
dove nel momento in cui arriva la forcella di
deve stoppare; ma entrambe le forcelle
devono arrivare contemporaneamente,
motivo per il quale esistono dei siti che
rallentano e sincronizzano la replicazione
nelle due direzioni. I siti TER oltre a far
terminare la propria replicazione, regolano
quella dell’altro filamento affinché terminino
insieme.
I siti TER sono delle sequenze di circa 23
paia di basi unidirezionali e sono riconosciuti da enzimi contro elicasi o TUS, questo
impedisce che la replicazione vada oltre, agendo a livello dei siti TER.

Formazione del complesso di pre-innesco

A livello del sito di origine dell'Escherichia Coli,
definito Ori C, si viene a formare il complesso di
pre-innesco. La replicazione di Escherichia Coli,
avviene in maniera bidirezionale, si formano due
forcelle replicazione a livello di Ori c che si
muovono sino ad arrivare al sito di terminazione.
L’inizio della replicazione è strettamente collegato
al ciclo cellulare, perciò alla sintesi di una copia
completa del cromosoma (40min).

Il primo stadio del processo replicativo è lo

svolgimento della doppia elica di DNA, in Ori C, il
quale avviene grazie all'elicasi DNA-B. La DNA-B
permette lo svolgimento del DNA che avviene
grazie all’intervento della DNA-A che denatura i
legami a idrogeno, legandosi su alcune sequenze
ripetute e ricche di AT (adenina e timina). A questo
punto interviene la DNA-C che si lega alla DNA-B
e indirizza la replicazione, l’origine. Infine dopo
che il DNA è svolto si vanno a legare quelle che
sono definite SSB (single strand binding protein) proteine che si legano al singolo filamento,
che permettono al DNA di rimanere svolto e si forma così il complesso di pre-innesco
formato da DNA-C+DNA-B. Nessuna di tutte e tre le DNA presenti è in grado di iniziare la
sintesi ex novo, ma ha bisogno di un innesco, dato da una sequenza di RNA, RNA
polimerasi o primasi DNAG, che è una RNA polimerasi DNA dipendente.

Si è formato così il pre innesco, quindi per continuare la replicazione si deve legare la DNA
polimerasi III.
Nei procarioti esistono tre forme la dna polimerasi I, II e III tutte dotate di attività
polimerizzante, cioè sono tutte capaci di allungare la catena pre-formata (data dall’innesco),
che presenterà un estremità 3’ OH libera.

Sull’estremità 3’ OH libero si
formerà un attacco nucleofilo,
sul fosfato in alfa. Questo
porta alla liberazione di
pirofosfato e al legame di una
nuova base.
A questo punto si forma il
primer o pre innesco e ogni
volta che viene aggiunta una
base per allungare la catena
avviene un attacco nucleofilo
con liberazione di tipo fosfato
(2 fosfato=pirofosfato).

Allungamento
Questo processo avviene su entrambi i filamenti di DNA che faranno da stampo:

1. il filamento 5’- 3’ è il filamento guida, dove la replicazione è veloce e continua e

parliamo di filamento leader, il quale originerà un filamento continuo;
2. il filamento stampo 3’ - 5’ sarà un filamento ritardato, detto lagging in quanto non si
formerà un filamento di nuova sintesi; darà origine a un filamento non continuo che
darà formerà i frammenti di Okazaki.
Questo accade perché ogni volta la DNA elicasi II, sul filamento lagging si svolge in
maniera discontinua e ciò fa sì che l’azione DNA polimerasi III non sia continua; nel
momento in cui la DNA polimerasi III si attacca e stacca, non è in grado di attaccare
il primo nucleotide al secondo e perciò interviene la DNA polimerasi I , la quale ha
un'attività esonucleasica e cioè per rimuovere l’innesco ad RNA di partenza
interviene la DNA polimerasi I che con la sua attività esonucleasica lo rimuove e con
la sua attività polimerizzante, forma la sequenza a DNA. Infine interviene la DNA
ligasi che lega i frammenti di Okazaki.
Tutte le proteine coinvolte nell’allungamento, legate alla polimerasi III prendono il nome di
replisoma.

Struttura RNA polimerasi III

La DNA polimerasi III è un enzima eteromultifimerico asimmetrico formato perciò da più
dimeri diversi e asimmetrici tra loro.
E’ costituita da un primo nucleo enzimatico, formato da tre subunità:

​ ● Subunità alfa: ha attività polimerizzante;

​ ● Subunità epsilon: ha attività esonucleasica 3’- 5’
 ​ ● Subunità teta: ha attività di stabilizzazione del complesso
Questo primo nucleo enzimatico ha una scarsa processività, cioè non funziona bene
da solo; per essere stabile interviene quella che è la subunità TAU di dimerizzazione,
che fa sì che due nuclei enzimatici si leghino tra loro. Si hanno così due subunità
alfa, due subunità epsilon e due subunità teta.

A questo punto intervengono le due subunità beta con funzione di pinza, le quali servono a
legare strettamente il DNA stampo (che deve essere replicato).
Si trova poi l’enzima dimerico, a buona processività; è necessario allora che si leghino tra
loro le subunità upsilon e sigma. Successivamente il complesso upsilon e sigma si lega a
uno dei due complessi enzimatici, ciò serve a far staccare l’enzima (DNA polimerasi III) dal
filamento ritardato, ogni 1000 e 2000 paio di basi.

DNA polimerasi I
Venne scoperta nel 1958, nel batterio di Escherichia
Coli e si chiama così perché è stata la prima ad
essere scoperta. È costituita da una catena
polipeptidica di circa 100 kilodalton. Dallo studio di
mutanti, nei quali la DNA polimerasi I era stata
alterata, si è potuto vedere che vi era una vitalità dei
mutanti stessi. Perciò la DNA polimerasi I non era
quella deputata alla replicazione vera e propria.

È costituita da:

​ ● un frammento grande, di 68 kilodalton, con

attività polimerizzante 5’- 3’ e attività esonucleasica
3’- 5’, che prende il nome di frammento di clarimonde;
​ ● un frammento piccolo di circa 30 kilodalton,
che ha solo attività esonucleasica 5’- 3’.
​

Il frammento grande, si occupa di un processo

chiamato correzione di bozze, e cioè è in grado di
rimuovere i nucleotidi non corretti che possono essere
inseriti nella catena di DNA nascente.
Nel momento in cui viene rimosso il primer, ovvero l’innesco, viene sintetizzata la sequenza;
questa poi una volta inserita genera un’attività definita nick translation, cioè si ha uno
spostamento dell’incisione più avanti (perché viene inserito il nuovo nucleotide, si scala).

Le attività tipiche della DNA polimerasi I permettono di aumentare la velocità di sintesi di

DNA, riducendo la frequenza di errore.
La DNA ligasi
La DNA ligasi, utilizza una molecola
energetica, che può essere o l’ATP o il
NAD+ (la DNA ligasi di Escherichia Coli
utilizza il NAD+, mentre la DNA ligasi del
fago T4 utilizza l’ATP). L’enzima forma
un intermedio covalente con l’AMP,
liberano il mono fosfato, NMN nel caso
del NAD e nel caso dell’ATP il
pirofosfato.
Perciò l’enzima va a trasferire l’AMP
(formatosi dall’ATP) sul fosfato
all’estremità 5’ formando un legame
fosfoanidridico. Il gruppo ossidrile
all’estremità 3’ invece compie l'attacco
nucleofilo sul fosfato 5’ liberando
adenilato e formando un legame
fosfodiestere.
In seguito alla denaturazione dei due
filamenti, affinché possa avvenire la
replicazione, si possono formare dei
superavvolgimenti, creando così delle
costrizioni sul filamento; si bloccano così
la replicazione e la denaturazione perché
le molecole di DNA non sono libere. A
questo punto interviene la topoisomerasi, degli enzimi che servono a sciogliere i
superavvolgimenti. Questi sono presenti in procarioti ed eucarioti.
Topoisomerasi nei procarioti
Nei procarioti esiste la topoisomerasi I, che crea dei superavvolgimenti positivi, nella stessa
direzione degli avvolgimenti e la topoisomerasi II anche chiamata girasi che crea dei
superavvolgimenti negativi.
Se a causa della sua denaturazione si creano dei superavvolgimenti positivi deve intervenire
la girasi che compensa creando dei superavvolgimento negativi, cioè se all'avvolgimento
serve una mano per svolgersi ancora di più perché deve avvenire la replicazione, subentra
la topoisomerasi I che crea un superavvolgimento positivo nella stessa direzione e lo facilita,
ma poi comunque si aggroviglia e allora interviene la girasi che crea un superavvolgimento
negativo opposto e ristabilisce l’equilibrio.

Le topoisomerasi quindi rimuovono i superavvolgimenti positivi.

Nel caso della topoisomerasi I umana,

questa effettua un'incisione su un filamento
del DNA, che lascia passare il secondo
filamento attraverso l’incisione e sarà poi lo
stesso enzima a sigillare le estremità.
Topoisomerasi batterica
Invece la topoisomerasi II batterica effettua
un taglio su entrambi i filamenti del DNA,
passa la doppia elica, attraverso le
estremità tagliate e ciò fa sì che il
superavvolgimento positivo diventi negativo
e infine sarà la stessa topoisomerasi II
batterica a sigillare il tutto.

Il replicone quanto è grande?

​ ● Negli eucarioti è grande 100-200 chilo paia di basi;

​ ● Nel genoma aploide e nei mammiferi è intorno ai 20.000-30.000 repliconi;
​ ● Negli acrisofila parliamo invece di circa 3.500 repliconi x 10^6.
In base alle dimensioni del replicone avremo una diversa velocità di replicazione.

La replicazione negli eucarioti

Negli eucarioti la replicazione richiede:

​ ● due DNA polimerasi e altri fattori proteici;

​ ● il replicone all’interno di un singolo cromosoma
La replicazione nella cellula eucariotica avviene con la formazione di un innesco in
prossimità della forcella, grazie alla primasi; perciò si ha un tratto di DNA allungato. La DNA
polimerasi alfa a questo punto crea un breve tratto di DNA chiamato DNA iniziatore.
Successivamente interviene la PCNA che aumenta la processività; il fattore di replicazione C
(che corrisponde al complesso teta-teta per la replicazione del filamento lagging); il fattore di
replicazione A (che corrisponde alle proteine ssb); il fattore MD1 che si occupa della
rimozione degli inneschi e perciò ha attività esonucleasica 5’- 3’; la DNA polimerasi epsilon
riempie le interruzioni, perciò è coinvolta nei processi riparativi; la DNA ligasi salda i legami e
crea quelli nuovi; la DNA polimerasi beta coinvolta nella riparazione; le topoisomerasi I e II
con le stesse funzioni.

La replicazione nei mitocondri

Si forma il d-loop. La replicazione del genoma mitocondriale è stata studiata nel topo, nel
ratto e nell’uomo. È una replicazione bidirezionale e asimmetrica.
Il genoma mitocondriale si presenta circolare e duplex; a livello del genoma è presente una
struttura parenterale chiamata ansa di Hilli, altamente conservata.
Quando arriva il segnale di replicazione del genoma interviene la DNA polimerasi gamma, si
forma un filamento H sull’informazione di quello L (stampo). I due filamenti non sono replicati
in maniera sincrona ma al termine di tutto la ligasi sigilla tutto.
La trascrizione
Il processo cellulare mediante il quale l’informazione genetica va dal DNA, all’RNA
messaggero.

L’RNA polimerasi è
l'enzima coinvolto nel
processo di trascrizione;
questo enzima si lega al
dna duplex e in seguito lo
svolge creando una
regione di denaturazione
chiamata bolla di
trascrizione.
Nel momento in cui il DNA
viene denaturato funge da stampo per la successiva sintesi di RNA.
Anche la trascrizione come la replicazione è costituita da tre fasi: inizio, allungamento e
terminazione.

Si parla di unità di trascrizione per definire la regione del promotore e del terminatore.
Le sequenze precedenti all’inizio della trascrizione sono dette a monte mentre quelle dopo la
trascrizione sono dette a valle. La trascrizione avviene da 5’ a 3’ su uno stampo che va da 3’
a 5’.
La base azotata dove inizia la trascrizione ha il nome di nucleotide +1. Nel momento in cui
avviene la trascrizione, si forma RNA messaggero, si ha la formazione di quello che è
definito trascritto primario; questo trascritto viene processato, ovvero subisce delle
modificazioni, che porteranno alla formazione di RNA messaggero maturo.

La bolla di trascrizione
Anche la trascrizione si avvale
dell’appaiamento tra le basi complementari tra
loro. La sintesi dell’RNA avviene all’interno di
una bolla di trascrizione, all’interno della quale
il DNA è temporaneamente denaturato (i singoli
filamenti sono separati); pertanto avremo un
filamento che farà da stampo che è usato per
dirigere la sintesi del filamento di RNA e il
filamento codificante. Essendo che la
trascrizione avviene da 5’ a 3’, verranno
aggiunti nuovi nucleotidi all’estremità 3 ‘ del filamento in crescita.
La bolla di trascrizione si forma quando l’RNA polimerasi si lega alla regione promotore,
l’RNA polimerasi si sposta lungo il filamento di DNA e insieme all'enzima scorre la bolla di
trascrizione.
Man mano che avviene questo movimento, la bolla di trascrizione svolge il DNA. Questo
avviene a valle, quello che succede a monte è che il dna si riavvolge.
La lunghezza della bolla di trascrizione va da 12 a 14 baia di basi.
Si distinguono tre fasi di trascrizione:

​ ● inizio, viene creata la bolla di trascrizione e l’RNA polimerasi inizia la sintesi della
molecola di RNA legandosi a una regione d’inizio detta promotore;
​ ● allungamento, a bolla di trascrizione si sposta. L’RNA viene allungato dalla RNA
polimerasi;
​ ● terminazione, in cui l’RNA polimerasi completa la sintesi dell’RNA messaggero, in
quanto giunge nella regione definita terminatore e la bolla si richiude.

La struttura dell’RNA polimerasi nei procarioti

L’RNA polimerasi è un enzima costituito da più subunità proteiche, si parla perciò di
eteromultimero. L'enzima completo, costituito da tutte le unità, prende il nome di oloenzima;
il suo peso molecolare è di circa 460 kilodalton.
È costituito da un core enzimatico costituito da: due subunità alfa, la subunità beta e beta
primo e la subunità omega. Al core si lega il fattore sigma.

La velocità di reazione per l’RNA polimerasi può essere di 40-50 nucleotidi al secondo e
agisce ad una temperatura di 37 gradi. In un organismo possono esistere più RNA
polimerasi (escherichia coli 3000 RNA polimerasi).

Le diverse subunità dell’ RNA procariotica, le funzioni e i geni

L'oloenzima è costituito da 5 subunità con complessivo peso molecolare di circa 460
kilodalton.
La subunità beta primo è codificata dal gene RPOC, è una sola quantità e la sua funzione è
quella di legame con il DNA stampo.
La subunità beta è codificata dal gene RPOB, è una sola quantità e la sua funzione è quella
di svolgere da sito catalitico che lega i nucleotidi.
La subunità sigma, codificata dal gene RPOD, è una sola quantità e si occupa del
riconoscimento del promotore, della fase di inizio.
La subunità alfa, codificata dal gene RPA, sono due quantità, si presentano come dimero, e
sono si occupano di legare il promotore.
La subunità omega, codificata dal gene RPOZ, è una sola quantità ed ha funzione
regolatrice.
Quando si forma l’enzima completo aumenta l’affinità tra enzima e DNA, il loro legame
diventa forte e si parla allora di questa sotto fase definita come complesso binario chiuso.
Inoltre intervengono dei fattori di trascrizione, come il fattore RO che si occupa della
terminazione e il fattore NUS-A che invece si occupa dell’ allungamento e della
terminazione.
Il legame coperto dal l’enzima è di circa 70 nucleotidi e si estende da una regione che va da
-50 a +20 paia di basi (nucleotide +1: ogni base presente sul filamento di DNA è indicata con
un numero positivo o negativo a seconda del nucleotide +1).
La bolla di trascrizione è di circa 14 coppie di basi; nella bolla è presente il nucleotide+1 ed
uno dei due filamenti di DNA denaturato funge da stampo e prende il nome di filamento
stampo sul quale viene sintetizzato l’RNA, il quale sarà poi complementare al DNA stampo.
Pertanto la sintesi avviene in direzione antisenso. L’altro filamento sarà quello codificante
perché sarà simile alla sequenza dell'RNA.
Nei procarioti l’unità di trascrizione comprende più geni, mentre negli eucarioti comprende
un solo gene.

Nella fase di inizio della trascrizione il fattore sigma legato all’enzima e deputato al
riconoscimento del promotore, si va a posizionare correttamente sul sito d’inizio.
Inizialmente il legame tra l’enzima e il DNA è debole, fino a quando non si lega
precisamente sulla regione promotore. Una volta riconosciuta la regione promotore si forma
il complesso binario chiuso. Successivamente si ha la denaturazione del DNA, l’enzima
occupa la regione che va da -50 a +20 e si forma così il complesso binario aperto (fase
successiva), costituito dallo svolgimento della doppia elica (12-17 basi della bolla).
Oloenzima+ filamento = regione promotore = complesso binario chiuso
Denaturazione dei legami idrogeno dei doppi filamento di DNA = formazione bolla =
complesso binario aperto
A questo punto si ha l’inizio della sintesi dell’RNA con formazione del primo legame
fosfodiestereo tra le basi; questo porta alla formazione del complesso ternario. La regione
che viene coperta dall’RNA polimerasi è di circa 50 basi e va da -30 a +20.
Infine si ha il rilascio del fattore sigma, che è la regione occupata dall'enzima quindi si riduce
a 30 basi, da -10 a +20.
L’enzima allora può continuare con la trascrizione.

Meccanismo di trascrizione
Il meccanismo di trascrizione è simile a quello della replicazione, perciò il gruppo ossidrilico
in 3’ presente sull’RNA crescente compie un attacco nucleofilo al gruppo fosfato in alfa del
nucleotide che deve essere aggiunto.
In questo processo intervengono anche gli ioni magnesio che legano rispettivamente i siti
beta e beta primo dell’RNA. Questo permette una migliore affinità con il DNA, permettendo
al sito catalitico dell’enzima di funzionare.
L’appaiamento del nucleotide trifosfato sul precursore è sotto la sorveglianza dell’enzima. Se
il nucleotide non è quello corretto l’RNA polimerasi se ne accorge e lo elimina. L’RNA
polimerasi infatti si occupa anche della correzione dei nucleotidi sbagliati che possono
essere aggiunti. Poiché l’RNA polimerasi deve svolgere la regione del promotore, si viene a
creare quello che è definito stress torsionale (avvolgimenti e superavvolgimenti).
Lo stress torsionale ha la funzione di regolare l’enzima girasi, che a sua volta si occupa dei
superavvolgimenti negativi; perciò favorisce lo scorrimento del DNA. Un esempio è l’alto
nalidixico che è un antisettico delle vie urinarie: questo farmaco è un inibitore della girasi,
perciò inibisce l’espressione di alcuni geni; ovvero se la girasi durante un infezione, perciò si
ha bisogno di trascrivere maggiori proteine, la somministrazione di questo farmaco blocca la
girasi, non avviene la codifica di proteine infiammatorie, ciò riduce l’ infiammazione (es.
infezioni vie urinarie).
Le funzioni delle subunità core dell’enzima sono state studiate mediante la somministrazione
di antibiotici; in particolar modo (domanda) le rifamicine (rifampicina) per esempio, inibiscono
l’inizio della trascrizione, quindi agiscono prima della formazione del primo legame
fosfodiestereo. Anche in questo caso quando avviene un infezione di un batterio sensibile
alla rifampicina, per bloccare la progressione dell'infezione si può optare per la
somministrazione dell’ antibiotico che va a bloccare l’inizio della trascrizione, quindi non
permette che avvenga la sintesi di proteine batteriche all’interno dell’organismo.
Se è invece già avvenuta la formazione del primo legame, va a bloccare il complesso
successivo (quello ternario) e in particolar modo le rifampicine hanno come target la
subunità beta che lega i nucleotidi.
Le streptolidigine, inibiscono l’allineamento, anche queste hanno come target la subunità
beta.
L’eparina, inibisce l’inizio della trascrizione in vitro ed ha come target la subunità beta prima;
in particolar modo l'eparina agisce mediante una azione agonista (compete) con il legame
con il DNA.
Il promotore è la regione che comprende le sequenze in cui interagisce l’RNA polimerasi; in
alcuni casi affinché l’RNA polimerasi si leghi a questa regione è necessario l’intervento di
alcune proteine chiamate sussidiarie. Il tipo di sequenze presenti all’interno della regione
promotore possono influenzare la capacità dell’RNA polimerasi di funzionare. Il promotore
quindi è necessario per la trascrizione di una regione di DNA ed esso si dice che è un
elemento cis agente. L’RNA polimerasi riconosce delle sequenze specifiche all’interno della
regione promotore. Ciò che è risultato dal confronto di diversi promotori è l’identificazione di
due tipi di sequenze comuni, molto conservate, costituite da 6 nucleotidi e localizzate a -35 e
-10, queste sequenze prendono il nome di sequenze consenso o canoniche.

La sequenza localizzata a -10 controlla l’esatto punto d’inizio della trascrizione; la sequenza
a -35 controlla invece il numero di volte che l’RNA polimerasi si lega al promotore.
Grazie all’analisi di sequenza è stato osservato che esistono dei promotori interni, cioè dei
promotori posti all’interno dell’unità di trascrizione, questi sono riconosciuti dall’RNA
polimerasi III.
L’RNA polimerasi si lega al DNA e inizia la trascrizione dell’RNA messaggero che avviene in
direzione 5’-3’; la polimerasi si muove a circa 40 nucleotidi al secondo (a 37 gradi).

Nel caso di un trascritto dei procarioti, succede che mentre avviene la trascrizione in un
verso, dall’altro si andranno a legare man mano i ribosomi; ai ribosomi segue la
degradazione del trascritto, questo perché nei procarioti non esiste la compartimentazione
citosol-nucleica perché sono tutti nello stesso ambiente.

Invece negli eucarioti esistendo un nucleo con la sua membrana nucleare che lo delimita e
un citoplasma si ha che la trascrizione avviene nel nucleo, dal quale poi l’RNA messaggero
esce per spostarsi nel citoplasma dove avviene la traduzione. La degradazione dell’RNA
messaggero avviene nel momento in cui non è più necessario e deve essere perciò
eliminata.

La degradazione del trascritto ci permette di parlare di emivita del trascritto.

L'emivita di un trascritto è il tempo di dimezzamento di un trascritto (circa la metà della sua
produzione).
Si distingue in:

● emivita funzionale è la capacità di servire come stampo per la sintesi della proteina,
● emivita chimica si determina misurando la diminuzione della quantità di RNA
messaggero capace di ibridare con il DNA stampo.

Nei procarioti la velocità di trascrizione è uguale alla velocità di traduzione, perché

avvengono in simultanea. La trascrizione avviene con 2500 nucleotidi al minuto, la
traduzione è di circa 15 amminoacidi al secondo.
La degradazione inizia subito dopo la fine della traduzione l’estremità 5’ potrebbe perciò
degradare prima dell'estremità 3’, ma la degradazione rimane comunque più lenta della
trascrizione, inoltre la degradazione è definita casuale in quanto può attaccare sia gli RNA
messaggeri neo sintetizzati che RNA messaggeri sintetizzati già da tempo. Questo perché
alcuni messaggeri possono essere tradotti più volte quindi è necessario che rimanga per più
tempo all’interno della cellula rispetto ad un altro RNA messaggero che non è necessario sia
tradotto più volte. Se un RNA messaggero debba essere tradotto più o meno volte dipende
dalle esigenze della cellula. In questa traduzione vengono tradotte proteine differenti: la
proteina A per esempio è necessario che venga prodotta più volte perché ha azione
antiossidante, antinfiammatoria, immunosoppressiva.
La trascrizione avviene in direzione 5’-3’ perciò il 5’ sede del codone di inizio della
traduzione è già libero non più occupato dalla bolla di trascrizione.

Il trascritto procariotico

Nella maggior parte dei casi il trascritto procarioti o è policistronico (porta l’informazione per
più geni) e in minima parte monocistronico (porta l’informazione per un solo gene).
Il fatto che all’interno di un unità trascrizionale ci sia la presenza di più geni, vuol dire che
possono essere tradotte più proteine.
Il cistrone perciò è una sequenza di basi nucleotidiche compresa tra una tripletta di inizio
AUG e una di stop, nonché l'unità genetica più piccola che codifica un solo peptide.
Domanda: com’è il trascritto procariotico? Policistronico

La sequenza guida leader è la sequenza all’estremità 5’ che precede il codone d’inizio; a

seguire troviamo il codone di inizio AUG può essere anche GUG; successivamente troviamo
la regione codificate definita cistrone; poi la regione di terminazione che può essere UAA,
UAG e UGA; poi vi è uno spazio rappresentato dallo spazio tra le regioni codificanti, questa
distanza può essere variabile; dopo troviamo di nuovo una regione di inizio, un nuovo
cistrone, terminate tutte le regioni cistrone che presenti sul trascritto eucariotico vi è poi la
presenza della regione o sequenza rimorchio all’estremità 3’ e quindi segue l’ultimo codone
di terminazione.

La regione intercistronica può essere variabile:

​ ● maggiore di 30-40 basi

​ ● minore di 30-40 basi

La distanza che varia tra un cistrone e l’altro in realtà varia la base del legame con la
subunità minore del ribosoma.
Il numero di ribosomi impegnati nel tradurre un RNA messaggero dipende dall’efficienza con
cui sono riconosciuti i siti di legame. Mediante un singolo RNA messaggero vengono tradotti
contemporaneamente generalmente da 30 ribosomi e da uno stesso trascritto la velocità di
trascrizione ad esempio se avvengono 5- 20 di inizio per trascrizione in un minuto si formano
150 molecole proteiche.

Come avviene l’identificazione del ribosoma sul sito dell’RNA messaggero?

Vi è un complesso
stabile dell’RNA
messaggero con il
ribosoma, l’RNA
messaggero protetto
occupa 35-40 basi e
include il codone di
inizio AUG o GUG + ribosoma.
Una caratteristica comune degli RNA messaggeri proteici è la presenza di una vera
sequenza, nota come la sequenza di shine dalgarno. L’aggiunta di RNAsi per degradare
RNA messaggero non protetto in laboratorio ha permesso di isolare un frammento di RNA
messaggero. Si è fatto un esperimento per vedere come RNA messaggero e ribosoma
legavano: si è preso dell’RNA messaggero, un ribosoma, si è aggiunta la RNAsi (degli
enzimi che vanno a degradare); questo ha permesso di vedere che il ribosoma si lega
all’RNA messaggero grazie alla sequenza di shine dalgarno che si va a legare a livello del
codone di inizio AUG.

Sequenza di Shine-Dalgarno
La regione guida leader, nei
batteri contiene la sequenza
di shine dalgarno. L’analisi di
sequenza delle regioni
protette dal ribosoma
durante l’inizio della
traduzione ha messo in
evidenza queste sequenze
ricorrenti e conservate che
sono le sequenze presenti
nella regione di
Shine-Dalgarno. Queste
sequenze sono circa a 5-9
nucleotidi a monte del
codone AUG e presentano
complementarietà con l’estremità 3’ dell’RNA 16s del ribosoma ( è costituito da proteine ed
RNA ribosomiale).
Il ribosoma dei procarioti è costituito da due
subunità una maggiore di 50s ed una minore
30s. L’unità 16s si trova nella subunità minore,
ha complementarietà con shine dalgarno e
perciò fa legare lì la subunità minore.
L’estremità 3’ dell’RNA ribosomiale 16s
batterico è conservata, possiede perciò una
sequenza capace di auto complimentarsi
(rilevarsi su se stessa), formando una
struttura a forcina costituita dal 3’ al 5’ come
UCC UCC. Tutti i siti noti degli RNA
messaggeri, ad esempio di escherichia coli,
sono complementari per almeno una tripletta
(il riconoscimento è almeno di una tripletta su
tutta la sequenza). Quando il ribosoma non è
legato, l’RNA ribosomiale 16s forma la forcina;
nel momento in cui deve avvenire la sintesi
proteica la forcina si svolge e ciò permette alla
sequenza di interagire con la sequenza di shine dalgarno. Nel momento in cui questo
riconoscimento non serve più la forcina si riforma.

L'appaiamento tra la sequenza shine dalgarno e l’estremità 3’ dell’RNA ribosomiale 16s

permette la corretta collocazione del codone d'inizio AUG nel sito peptidico del ribosoma
della subunità minore 30s. Avvenuto ciò vi è il richiamo della subunità maggiore 50s e la
formazione completa del ribosoma 70s.

Nel trascritto policistronico ogni sequenza codificante è preceduta dalle RBS, ovvero il sito di
legame del ribosoma, nonché sequenza di Shine-Dalgarno.

La trascrizione negli eucarioti

La trascrizione negli eucarioti avviene su uno stampo di cromatina. L’RNA polimerasi
eucariote, a differenza di quella procariote, non lega direttamente il DNA. La trascrizione
avviene grazie alla presenza di quelli che sono i fattori di trascrizione basale; la trascrizione
avviene nel nucleo e vi è un riconoscimento con la regione promotore. L’RNA polimerasi
eucariotiche sono tre polimerasi, ciascuna contiene: due subunità grandi tra i 140 e i 200
kilodalton e fino a 10 subunità piccole che vanno dai 10 ai 90 kilodalton.
L’RNA polimerasi I si trova nel nucleolo, trascrive l’RNA ribosomiale 18s e 28s e svolge il
50-70% dell’attività dell’RNA cellulare.
L’RNA polimerasi II si trova nel nucleoplasma (nucleo+nucleolo), trascrive per l’HR RNA che
permette il passaggio all’RNA messaggero maturo; svolge il 20-40% dell'attività degli RNA
cellulari e si lega e riconosce le regioni enhancer.
L’RNA polimerasi III, risiede nel nucleoplasma e trascrive per gli tRNA (RNA transfer), gli
rRNA (RNA ribosomiale 5s) e anche per i piccoli RNA nucleari; svolge solo il 10%
dell’attività.

Inibitori delle RNA polimerasi

Esistono degli inibitori dell’RNA polimerasi che possono essere estratti da piante, animali e
insetti. È stato osservato in particolar modo che l’alfa amanitina, una molecola isolata da un
fungo velenoso:

1. a basse concentrazioni, inibisce l’RNA polimerasi II;

2. ad alte concentrazioni inibisce l’RNA polimerasi III negli animali, mentre non lo fa in
lieviti ed insetti;
3. in concentrazioni di più di 500 mg/ml non inibisce l’RNA polimerasi I in nessuna
cellula.

Apparato basale della trascrizione eucariotica

I promotori degli eucarioti sono più grandi e ricchi di sequenze consenso a cui si andranno a
legare specifici fattori di trascrizione. Queste regioni ricche sono chiamate tata box,
localizzata -25 e cat box localizzata a -75.
Negli eucarioti ogni promotore è diverso da un altro e questo varia per:

​ ● il numero di sequenze consenso;

​ ● la posizione;
​ ● in alcuni casi anche l'orientamento del promotore.

Il promotore è definito :

​ ● modulare (può cambiare orientamento, in quanto è costituito da molte sequenze

consenso);
​ ● plastico (perché il numero, la posizione e il tipo di sequenza può variare);
​ ● versatile (in quanto se si costruisce un promotore ibrido, ovvero si prendono
sequenze consenso di diversi promotori e si mettono insieme, esso funziona
ugualmente).

Il promotore è perciò legato ad una serie di fattori di trascrizione ubiquitari e comuni in tutte
le cellule. Nel momento in cui questi fattori si vanno ad assemblare a livello della regione del
promotore si viene a formare l’apparato basale della trascrizione.
Tra questi fattori di trascrizione vi è la proteina TBP (tata binding) protein, la proteina che
interagisce con la TATA BOX permettendo il corretto posizionamento dell’RNA polimerasi II.

Negli eucarioti la trascrizione viene regolata anche da delle sequenze chiamate enhancer, le
quali si possono trovare a monte o a valle della regione promotore; la loro funzione è quella
di aumentare l’efficienza di trascrizione.
Le regioni enhancer sono costituite da una ripetizione definita in tandem di una sequenza di
72 paia di basi.

Nel momento in cui si attiva l’enhancer, l’efficienza di trascrizione aumenta.

Un altro sito regolatore prende il nome di silencer, la cui funzione è quella di regolare il
silenziamento della trascrizione; si può trovare a monte o a valle della regione del promotore
e riduce la sua efficienza di trascrizione.
Inizio della trascrizione
I fattori richiesti per dare inizio al processo di trascrizione sono classificati in:

​ ● fattori generali, sono necessari a livello di tutti i promotori, si legano al l’RNA

polimerasi a livello del sito d’inizio per formare l’apparato basale della trascrizione;
​ ● fattori a monte, sono delle proteine che riconoscono delle brevi sequenze
consenso a monte rispetto al sito d’inizio; sono spesso ubiquitari e agiscono su
qualsiasi promotore che abbia la sequenza consenso specifica. Hanno il ruolo di
aumentare notevolmente l’efficienza dell’inizio del processo di trascrizione;
​ ● fattori inducibili, hanno ruolo regolatore, vengono sintetizzati in momenti o tessuto
specifici. Le sequenze a cui si legano sono chiamate elementi di risposta.

La regione promotore degli eucarioti è costituita da circa duecento paia di basi a monte del
punto di inizio, nucleotide+1, sito d’inizio del processo di trascrizione.
Questa regione contiene una serie di sequenze consenso, anche definite canoniche,
costituite da una decina di paia di basi, ricorrenti per almeno nel 50% di casi in tutte le
regioni promotore.
Le sequenze consenso sono riconosciute dai fattori di trascrizione.
Solitamente i promotori con elementi riconosciuti solo da fattori generali e da fattori a monte
sono costitutivi e vengono chiamati geni housekeeping, naturalmente espressi in tutte le
cellule.
I geni invece che hanno delle regioni promotore in cui vi sono delle sequenze consenso
riconosciute a monte o da fattori inducibili sono geni sottoposti a regolazione, espressi solo
quando la cellula lo ritiene opportuno.

Struttura del trascritto eucariotico

Il trascritto eucariotico è monocistronico; la maggior parte dei trascritti eucariotici ha una
lunghezza tra i 1000 e i
2000 nucleotidi.
È costituito dalle due estremità 5’ e 3’, da una sequenza guida chiamata 5’ UTR delle regioni
non tradotte, da un codone di inizio AUG, la regione codificante e il codone di stop.
Successivamente troviamo delle sequenze rimorchio posizionate in 3’ e definite UTR 3’. Due
altre importanti caratteristiche che rientrano nelle modificazioni post trascrizionali che un
trascritto subisce sono quelle in 5’ con l’aggiunta del cappuccio, chiamata 5’ CUP e l’altra è
su 3’ con l’aggiunta di una coda di poli-A, una serie di circa 200 adenosine che conferiscono
stabilità al trascritto; la degradazione di questa coda toglie stabilità al trascritto che viene
considerato da degradare perché inutile per la cellula.
Oltre a queste due modificazioni post trascrizionali affinché il trascritto sia maturo avviene
un’altra modificazione definita splicing, grazie alla quale si ha la rimozione delle sequenze
non codificanti e l’unione delle sequenze codificanti. All’estremità 5’ non c’è il gruppo
trifosfato, come nei procarioti,
ma vi è la presenza di un
residuo di 7 metil guanilato,
chiamato anche cappuccio o
cap, essenziale per il
riconoscimento da parte del
ribosoma. Quando il codone
AUG è situato entro 40
nucleotidi dal cappuccio,
entrambi si trovano nello
spazio coperto dal
ribosoma;nel momento in cui
questo spazio è maggiore, il
ribosoma si lega al cappuccio
e successivamente si sposta
verso il codone AUG, questo
prende il nome di modello
della scansione.
Con la trascrizione si forma il
trascritto primario chiamato
3mRNA o HRNA, il quale subisce delle trascrizioni post trascrizionali che riguardano
l’eliminazione degli introni non codificati e l’aggiunzione degli esimi, va successivamente
incontro a maturazione con le altre modificazioni post trascrizionali che porteranno alla
formazione di un trascritto maturo che sarà legato a delle proteine trasportatrici e verrà
portato fuori dal nucleo nel citoplasma dove verrà tradotto.

Struttura 7 metil-guanilato
Il cappuccio si forma in due tappe:

​ ● nella prima l'enzima, catalizza la formazione del cap, guanilil transferasi reagisce
con il GTP formando l'enzima guanilato GMP e il pirofosfato che viene idrolizzato
dalla pirofosfatasi inorganica;
​ ● nella seconda fase a questo punto l'enzima guanilato GMP più il pirofosfato
reagiscono all’estremità 5’ e trasferisce il GMP sul fosfato in beta liberando il fosfato
 in gamma; si forma così una struttura definita cap 0 (trasferimento del gruppo GMP
sul fosfato in beta del nucleotide in 5’ da parte dell’enzima guanilato GMP).

Il cap 0 può poi subire

delle modificazioni, delle
metil-azioni che
avvengono sul guanilato
del primo o del secondo
nucleotide, formando il
cap 1. Possono avvenire
anche altre modificazioni
sul terzo nucleotide, e si
parla allora di cap 2.
La reazione di capping
non riguarda gli RNA
messaggeri dei mitocondri
e dei cloroplasti. La
sequenza di shine
dalgarno non è presente a
livello del trascritto
eucariotico ma vi è la
sequenza di kozak.

Negli eucarioti l’interazione della subunità

ribosomiale minore di 40s, codone
d’inizio AUG, porta alla protezione di un
tratto dell’RNA messaggero. Nel
momento in cui si aggiunge la subunità
maggiore di 60s, le dimensioni del
frammento protetto tendono a ridursi.
La sequenza di shine dalgarno nei
procarioti, permette di riconoscere e
legare ad AUG la subunità minore del
ribosoma; la sequenza di kozak ha la
medesima funzione, l’unica differenza
consiste nell’ immersione all’interno della
sequenza di AUG.
Riconoscimento e aggiunta di coda di
poli-A (modificazione post trascrizionale
in 3’)
Avviene che vi è una particolare sequenza, definita sequenza segnale, presente all’estremità
3’; questa viene riconosciuta da una RNA polimerasi che aggiunge la coda di poli-A.
Come avvengono e quali sono le frazioni polisomiali?
Per frazione polisomiale si intende quel trascritto che presenta i ribosomi attaccati; in
laboratorio la presenza della coda di poli-A permette l’isolamento degli RNA messaggeri dal
resto dell’RNA.
La coda di Poli-A è tipica degli RNA messaggeri, non è presente negli tRNA o negli rRNA.
CHE COSA E’ IL GENOMA ?

Il genoma è l'insieme delle componenti codificanti e non codificanti dell’ organismo (introni
ed esoni). Parlando di genoma quindi parliamo di PATRIMONIO GENETICO e quindi di tutte
le informazioni che lo caratterizzano.

il genoma è costituito da GENI o UNITÀ DI TRASCRIZIONE che contiene:

● esoni (sequenze codificanti),
● introni (sequenze non codificanti),
● UTR (regioni che non vengono tradotte).

Affinché la cromatina passi dallo stato inattivo (ETEROCROMATINA) allo stato attivo
(EUCROMATINA), sono necessarie delle modificazioni:

- ACETILAZIONE DEGLI ISTONI cioè viene aggiunto un gruppo acetile sulla

molecola proteica dell'istone, cioè la molecola su cui si attorciglia la
cromatina;
- RIMOZIONE DELL'ISTONE H1;
- DEMETILAZIONE DEL DNA ovvero la rimozione del gruppo metile;
- DECONDENSAZIONE DELLA CROMATINA.

Una volta avvenute queste fasi la cromatina passa in uno stato di potenziale attivazione e,
solo l'addizione o la rimozione di specifiche proteine regolatrici, permette il passaggio ad uno
stato attivo o, il ritorno allo stato inattivo.
Quando si attiva la cromatina , avviene il processo di trascrizione che termina quando i geni
trascritti non sono più necessari. A questo punto la cromatina torna nel suo stato inattivo e le
proteine regolatrici aggiunte per far avvenire il passaggio vengono rimosse, così come
avviene la DEACETILAZIONE DEGLI ISTONI o la METILAZIONE DEL DNA. Per far tornare
la cromatina nello stato inattivo deve essere rimosso tutto ciò che è stato aggiunto per farla
attivare.

Nel momento in cui il gene diventa potenzialmente trascrivibile, si hanno diverse tappe di
regolazione che avvengono al livello del nucleo o del citosol.

AL LIVELLO DEL NUCLEO

​ ● ABORTO DEL TRASCRITTO DI RNA cioè viene scansionato il trascritto e se si

nota la presenza di alcuni codoni di stop o di errori, viene degradato coiscchè non
possa uscire dal nucleo per andare incontro alla traduzione.
​ ● AGGIUNTA DI CAPPUCCIO (CAPPING) all'estremità 5’ viene aggiunta la 7 metil
guanosina, serve per far riconoscere il trascritto dall’apparato di traduzione
(ribosomi).
​ ● POLIADENILAZIONE cioè all'estremità 3’ viene aggiunta una coda di poli-A. Cioè
una coda formata da 200 adenine che ha lo scopo di conferire stabilità al trascritto.
​ ● SPLICING cioè la rimozione di sequenze non codificanti chiamate introni. Si forma
il trascritto maturo.
​ ● EDITING DELL’RNA cioè l'RNA, può essere corretto e modificato. Una volta
terminate queste modificazioni, il trascritto viene fatto uscire dal nucleo legato a
proteine trasportatrici e finisce nel citosol. Li subisce ulteriori step di controllo.

AL LIVELLO DEL CITOSOL

​ ● LOCALIZZAZIONE SPAZIALE cioè bisogna controllare che il trascritto maturo, sia

stato posizionato correttamente nel citoplasma dalle proteine trasportatrici.
​ ● TRADUZIONE avviene la traduzione del trascritto in proteina, è un processo
controllato perché alcuni trascritti devono essere tradotti in modo molto efficiente per
 proteine prodotte in grandi quantità e altri trascritti che vengono tradotti con meno
efficienza perché si devono produrre meno proteine.
​ ● TURNOVER cioè produzione e eliminazione del trascritto. Il turnover cambia in
base al tempo di dimezzamento del trascritto chiamato HALF LIFE, è il tempo
necessario affinché il trascritto venga rimpiazzato con uno nuovo. Più alto è il
turnover, più piccola è la vita media del trascritto.

Per regolare l’espressione genica degli eucarioti è importante conoscere i seguenti punti.

1. La struttura di un gene ovvero:

● da quanti introni ed esoni è costituito il trascritto primario,
● come avviene lo splicing (alternativo,normale),
● se sono presenti codoni abortivi.
2. L’efficienza del promotore cioè:
● se sono promotori forti o deboli,
● se sono presenti regioni consenso o canoniche ,quanto più simili sono le
regioni del promotore, tanto più forte sarà il promotore. Le regioni del
promotore devono avvicinarsi alla sequenza “ migliore” detta sequenza
canonica ideale per far sì che il promotore sia forte.
3. Velocità dei ribosomi sul trascritto cioè i ribosomi possono muoversi con una velocità
maggiore o minore in base ai codoni presenti sul trascritto.
4. Uso dei codoni: si parla quindi del tipo di codoni presenti sul trascritto. Se sono
presenti molti codoni con lo stesso tRNA la velocità è maggiore.
5. Efficienza della traduzione se il CAP interagisce in modo corretto con i fattori di
traduzione.
6. Turnover dei messaggeri che inviano il messaggio per degradare il trascritto ,
dipendono dal CAP e dalla coda poli-A che viene degradata per far partire il segnale.
7. Riarrangiamenti genomici sono tipici dei geni che codificano per immunoglobuline e
anticorpi. Esempio: linfociti che espongono l'antigene solo nel momento in cui serve l’
esposizione , attuano dei riarrangiamenti al loro genoma.
8. Splicing differenziale cioè gli introni vengono rimossi parzialmente , quindi una
porzione degli introni rimane nel trascritto maturo. Questo avviene perché alcune
proteine possono avere due ruoli differenti, quindi avviene lo splicing differenziale per
conferire un duplice ruolo alla proteina.
9. Enhancer e silencer: i silencer servono per regolare negativamente l'espressione di
un gene mentre gli enhancer servono per aumentare la trascrizione. Entrambi
agiscono al livello del promotore.
10. Metilazione e ipometilazione: sono l'aggiunta o la rimozione del gruppo metile per
attivare e inattivare la cromatina.
11. Impacchettamento dell’eterocromatina.
12. Fattori di trascrizione: possono regolare l'espressione di un gene perché presentano
dei domini legati al DNA.

Sintesi proteica

Il trascritto una volta superato il nucleo, può essere tradotto in una sequenza di amminoacidi
e quindi una PROTEINA. Affinché avvenga la sintesi proteica, ci sono 3 elementi
fondamentali:
 1. mRNA maturo,
2. ribosomi,
3. tRNA.

RIBOSOMI

Sono formati da 2 subunità (sia procarioti che eucarioti). Una PICCOLA composta da RNA
ribosomiale e catena polipeptidica e una GRANDE composta da RNA ribosomiale e catena
polipeptidica. Tuttavia ci sono delle differenze tra eucarioti e procarioti, ovvero:

​ ● COEFFICIENTE DI SEDIMENTAZIONE,
​ ● GRANDEZZA SUBUNITÀ PICCOLA con annesse differenze tra il numero di rRNA
e catene polipeptidiche,
​ ● GRANDEZZA SUBUNITA’ GRANDE con annesse differenze tra il
numero di rRNA e catene polipeptidiche.

tRNA
I tRNA sono molecole più grandi formate da pre-tRNA che vengono processate tramite
(processing del tRNA) e formano da 1 fino a 7 tRNA diversi. I tRNA per essere pronti devono
essere regolati da 3 molecole:

​ ● RNasi P taglia l'estremità 5’del tRNA. È un complesso formato da una molecola di

RNA e una proteina, l’attività catalitica è svolta dall RNA e non dalla proteina;
​ ● RNasi D taglia i nucleotidi in eccesso all’ estremità 3’ e si ferma quando raggiunge
la tripletta CCA. Interviene poi l’ enzima nucleotidil CCA trasferasi che sistema la
sequenza nel caso in cui sia stata tagliata erroneamente l'estremità 3’ CCA. La
tripletta CCA è importante perché il legame tra amminoacido e tRNA avviene
all'estremità 3’ del tRNA.
Caratteristiche tRNA

Il tRNA viene definito come una molecola adattatrice per la sintesi proteica perché legano
l'amminoacido e interagiscono con il trascritto, quindi si adatta a fare due azioni. Esistono
tRNA chiamati ISOAFFINI o ISOACCETTORI che riconoscono lo stesso amminoacido pur
avendo codoni differenti. Possono avere una lunghezza variabile da 75 a 95 nucleotidi che
sono complementari tra di loro. La complementarietà gli permette di formare delle strutture
secondarie come quella a QUADRIFOGLIO o la struttura terziaria a L. La struttura del tRNA
gli permette di stare nei siti A e P del ribosoma.

Esistono dei fattori che riconoscono il tRNA, fattore di allungamento EF-Tu che riconosce
tutti i tRNA ad eccezione del tRNA iniziatore, che invece viene riconosciuto dal fattore IF2.
La molecola del tRNA ha solo 2 estremità libere, cioèl'estremità 3’ e 5’, anche se l’estremità
5’ non è davvero libera perché è legata all’ estremità 3’ che corrisponde alla tripletta CCA.
Le altre estremità del tRNA formano delle anse chiamate braccio.

● Braccio ACCETTORE: si forma

unendo le due estremità libere ( 3’ e
5’).
● Braccio TψC: viene chiamato così
per la presenza di due basi insolite,
ovvero TIMINA al posto dell’ uracile
(tipica del DNA e non degli RNA) e
la PSEUDOURIDINA.
● Braccio D: presenta una base
modificata che è la DIIDROURIDINA.
● Braccio dell’anticodone: che contiene la
tripletta che riconosce la tripletta
dell'mRNA, quindi l’ anticodone
riconosce il codone del mRNA.
● Braccio EXTRA: si trova tra il braccio
TψC ( T PSI C) e il braccio che
corrisponde all’ anticodone e può
cambiare le dimensioni del tRNA da 74
a 95 nucleotidi.

L’ amminoacido si lega all’ accettore, il codone si lega all’anticodone.

Nei tRNA sono presenti delle basi modificate che sono state scoperte confrontando la
sequenza del tRNA con le triplette presenti sul trascritto del suo gene. Le modifiche non
avvengono sul gene che serve per trascrivere il tRNA ma, sono post trascrizionali e
avvengono sulla molecola di tRNA già trascritta che viene modificata ad esempio
aggiungendo dei gruppi.
Una base insolita presente sul tRNA è la quenosina (Q) che viene scambiata da un enzima
con un residuo di G (guanina).

Per capire la struttura dei tRNA è stata effettuata un analisi di cristallografia a raggi X che ha
permesso, di capire che:
 - i bracci del tRNA sono complementari tra loro,
- la complementarietà delle basi azotate che si ha grazie ai legami idrogeno, stabilizza
la struttura secondaria e terziaria. Questi legami infatti sono chiamati legami idrogeno
rispettivamente secondari e terziari.

Tutti i tRNA che vengono riconosciuti dalla stessa aminoacil tRNA sintetasi, vengono
chiamati tRNA affini e possono avere lo stesso anticodone e differire in altre parti o
viceversa. Se sono presenti mutazioni nel braccio accettore o dell’ anticodone, il tRNA non
può più essere riconosciuto dall’ enzima e viene degradato.
L’ enzima aminoacil tRNA sintetasi è specifico per ogni amminoacido o per un solo gruppo di
tRNA isoaccettore, lega 3 substrati :amminoacido, tRNA e ATP che ha un ruolo energetico,
cioè attivare il tRNA e caricare sul tRNA l'amminoacido.
Il legame tra tRNA e amminoacido è un legame estere che si instaura tra il gruppo
carbossilico dell’ amminoacido (COOH) e il gruppo ossidrilico dell'adenosina terminare del
tRNA (CCA).

Esistono classi differenti dell’ enzima che hanno strutture diverse:

- monomeri, cioè costituiti da una subunità alfa,oppure da due,tre subunità uguali

(dimeri tetrameri);
- multimeri, cioè costituiti da più subunità.

Il codice genetico comprende 61 codoni di senso e in teoria dovrebbero esserci 61

anticodoni con 61 tRNA diversi, in realtà esistono solo 32 tRNA e il tutto si spiega grazie
all'ipotesi del vacillamento secondo la quale: più tRNA possono trasportare uno stesso
amminoacido.
ESEMPIO: la base 5’ dell’ anticodone può legare in modo meno specifico la base 3’ del
codone , quindi se in posizione 5’ si ha una G, essa si può legare con le basi che si trovano
in 3’ che possono essere U o C. Non è detto che una base si leghi solo con un'altra base ma
può legarsi anche con basi differenti.

SINTESI PROTEICA

La sintesi proteica è il sinonimo di traduzione. Tramite esperimenti in vitro è stato possibile

decodificare il codice genetico e ottenere in vitro un sistema di traduzione formato da
ribosomi e code di basi azotate del RNA. Si è visto che la coda di:

- poliU codificava per la proteina poli fenilalanina (UUU),

- poliC codificava per la proteina poli prolina (CCC),
- poliA codificava per la proteina poli lisina (AAA).
Grazie a questi esperimenti in vitro si è riusciti ad identificare la presenza di 61 codoni per i
20 amminoacidi. Il codice genetico è formato da 64 codoni, 61 codoni di senso e 3 di stop .
Esistono codoni sinonimi che hanno le prime due basi uguali e la terza diversa. Ne esistono
altri che hanno delle mutazioni e in base alla loro posizione si classificano le mutazioni:

1. prima posizione, la mutazione può essere SILENTE (non incide si continua a

codificare per lo stesso amminoacido), NEUTRA (si codificano amminoacidi simili);
2. seconda posizione, la base può essere una PURINA che codifica per amminoacidi
idrofobici o PIRIMIDINA che codifica per amminoacidi polari e una mutazione genera
in entrambi i casi amminoacidi simili;
3. terza posizione, la mutazione può generare codoni dello stesso amminoacido o può
cambiare la base e si ha quindi il cambio dell’ amminoacido.

RIBOSOMI

PROCARIOTI (70S): i ribosomi non si trovano in un punto preciso perché non esiste la
compartimentazione della cellula. L’rRNA ha la funzione di interagire con mRNA e tRNA, ha
anche un ruolo strutturale perché alcune proteine (proteine R) si legano ad esso con uno
specifico ordine.

EUCARIOTI (80S): i ribosomi eucariotici si trovano nel citosol, sono di dimensioni maggiori
rispetto ai procarioti e hanno un contenuto totale di rRNA e proteine è maggiore.

Il modello della struttura del

ribosoma è stato ottenuto
tramite tecniche di
cristallografia a raggi X e
marcatura di singole
proteine . Si è visto che l’
RNA ribosomiale costituisce
la maggior parte del
ribosoma e funge da
impalcatura per le proteine
(ruolo strutturale).

I ribosomi sono costituiti da

una subunità maggiore e una minore. La subunità maggiore contiene 3 siti:

● SITO A dove entra l'amminoacil tRNA,

● SITO P si forma il peptidil tRNA ( catena polipeptidica),
● SITO E esce il tRNA senza l'amminoacido.
La proteina che si sta formando nel sito P ha una direzione ammino carbossi terminale
Tra la subunità maggiore e minore si posiziona l'mRNA, si lega prima alla subunità minore e
traccia un percorso per far legare poi quella maggiore.

- SITO A (aminoacilico o accettore) ospita l’ amminoacil tRNA che è in ingresso.

- SITO P (peptidilico) porta il peptidil tRNA che ha legato la catena polipeptidica in

allungamento.
- SITO E (exit) da cui esce il tRNA scarico.

Entrambe le subunità concorrono a formare il sito A e P, dove i tRNA sono disposti a L cioè
con il braccio o gambo accettore rivolto verso la subunità grande nel sito dove si formano i
legami peptidici, il braccio dell’ anticodone verso quella piccola.

Nei procarioti la sintesi della catena polipeptidica inizia sempre a partire da uno stesso
amminoacido, cioè la METIONINA codificata dal codone di inizio AUG o GUG. Esistono però
due tipi di tRNA che portano la metionina:

1. il tRNA che porta la metionina come primo amminoacido (tRNA iniziatore) ed è

chiamato tRNA fmet ,la F indica l’ N-formil-metionil-tRNA,
2. il tRNA che porta la metionina all'interno della catena polipeptidica ed è chiamato
tRNA met.

C'è una differenza tra AUG e GUG perché quando AUG si trova all'inizio o in mezzo alla
catena viene sempre codificato come aminoacido la metionina, quando invece il codone
GUG si trova all'inizio viene codificata la metionina mentre se si trova in mezzo, viene
codificato l'amminoacido valina (perché GUG viene riconosciuto dal tRNA val e non tRNA
met).
Tra tRNA met e fmet ci sono diverse differenze:

​ ● formil met ha sul braccio accettore delle basi non appaiate, sul braccio T PSI C
una adenina, e nell’anticodone si ha un’ adenosina non alchilata e tre coppie di GC
che permettono di distinguere il tRNA iniziatore da quello normale,
​ ● met ha sul braccio accettore un accoppiamento di basi anomalo (CA), sul braccio
T PSI C si trova una guanina al posto dell'adenina dell’ fmet, e infine nell’ anticodone
si ha un’ adenosina alchilata.

Negli eucarioti non c'è formilazione, cioè ci sono 2 tRNA diversi ma nessuno dei due è un
tRNA fmet.
Un eccezione degli eucarioti sta nei mitocondri che nonostante siano eucarioti utilizzano il
codone AUA per iniziare la sintesi proteica e il codone viene riconosciuto dal
formil-metionil-tRNA, quindi avviene la formilazione solo nei mitocondri.

La sintesi proteica è un processo suddiviso in varie fasi, viene diretta dallo stampo di mRNA
e richiede le varie componenti che abbiamo analizzato in precedenza.

FASEDI INIZIO: fase lenta nella quale si assemblano le subunità dei ribosomi e si ha la
formazione del primo legame peptidico.

FASE DI ALLUNGAMENTO: fase in cui si forma tutta la catena polipeptidica.

FASE DI TERMINAZIONE: si è formata la catena che viene rilasciata e le subunità dei

ribosomi si separano.

Tra procarioti ed eucarioti ci sono delle differenze durante il processo :

FASE DI INIZIO

PROCARIOTI: sono coinvolti 3 fattori

(IF1,IF2,IF3). I fattori IF1 e IF3 si associano alla
subunità minora del ribosoma che grazie al
fattore IF3 (detto anche fattore di
anti-associazione) rimane staccata da quella
maggiore. Quando arriva l'mRNA, si forma un
complesso, chiamato complesso di inizio 30S,
formato da: 1) IF2 è una GTPasi che rompe la
GTP e crea GDP + Pi (fosfato inorganico), questa rottura permette al tRNA iniziatore di
posizionarsi nel sito P del ribosoma e iniziare la sintesi proteica 2) GTP 3) tRNA iniziatore
(fmet).
Una volta avvenuto il legame complesso di inizio, mRNA e tRNA f met , tutti i fattori si
allontanano e le subunità si uniscono formando il ribosoma completo 70S.

EUCARIOTI: sono coinvolti 3 fattori: eIF1,

eIF2, eIF3 che interagiscono con la subunità
piccola 40S.
Il fattore eIF3 è il fattore di anti-associazione
perché tiene separate la subunità piccola è la
subunità grande.
Il Fattore eIF2 forma il complesso ternario
formato da : eIF2, GTP e il tRNA iniziatore
(tRNAfmet).
Sono coinvolti anche altri fattori come: eIF4: ha
la funzione di riconoscere il CAP (all'estremità
5’) e richiama la subunità minore quando si
deve formare il complesso di inizio. Serve un
fattore di riconoscimento del CAP perché negli
eucarioti manca la sequenza di Shine-Dalgarno
che ha il compito nei procarioti, di posizionare il
complesso sull'mRNA. eIF5: posiziona il
complesso ternario nel sito P del ribosoma
grazie all’attività GTPasica che scinde la GTP
in GDP+Pi. Forma il complesso di pre-inizio
sulla subunità minore del ribosoma. Grazie al fattore eIF4, il complesso di pre-inizio si
associa al CAP dell'mRNA e inizia la scansione per trovare il codone d'inizio AUG che si
trova all'interno della sequenza di kozak. Una volta trovato il codone d'inizio, alla subunità
minore si associa la subunità maggiore e si staccano tutti i fattori precedenti, si crea quindi il
complesso di inizio 80S.

FASE DI ALLUNGAMENTO
PROCARIOTI: sono coinvolti 3 fattori di allungamento: EF-Tu, EF-Ts e Ef-G. All'inizio il sito
P é occupato dal tRNA iniziatore mentre il sito A é vuoto. Il fattore EF-Tu è una GTPasi e
forma un nuovo complesso ternario formato da: GTP, aminoacil-tRNA ( con un tRNA
specifico per ogni amminoacido) e fattore EF-Tu. Il complesso si posiziona nel sito A. Viene
idrolizzata la GTP e si forma un complesso binario (EF-Tu / GDP). Il fattore EF-Ts è il fattore
di scambio che permette il ripristino del complesso ternario staccando dal complesso binario
il GDP. Questi processi hanno permesso la reazione di transpeptidazione dove avviene il
legame tra l'amminoacido che si trova nel sito P e quello che si trova legato al complesso
ternario nel sito A. L'amminoacido passa dal secondo tRNA al tRNA iniziatore grazie
all'entità peptidiltransferasi o ribozima . Una volta che il tRNA lascia l'amminoacido, viene
traslocato dal sito A al sito P al sito E dal terzo fattore (EF-G).
Esistono diversi antibiotici che possono agire sulla fase di allungamento come per esempio:

● Chirromicina, interagisce con il fattore EF-Tu e impedisce al complesso ternario di

entrare nel sito A;
● Acido fusidico, lega il fattore EF-G e blocca il rilascio del ribosoma, nella fase
post-traslocazione.
● EUCARIOTI: il processo è uguale ai procarioti ma cambiano i fattori che sono:
- eEF1-a —> equivale al fattore EF-Tu,
- eEF1-b —> equivale al fattore EF-Ts,
- eEF2 —> equivale al fattore EF-G ed è sensibile alla tossina difterica.

FASE DI TERMINAZIONE

È uguale sia negli eucarioti che procarioti.

Ha inizio quando scorrendo l'mRNA, si incontra un codone di stop. Anche qui sono presenti
alcuni fattori di terminazione:
- RF-1 interviene quando ci sono i codoni UAA,UAG;
- RF-2 interviene quando ci sono i codoni UAA,UGA.

Si ha anche la presenza di un altro fattore detto RRF che serve a separare le due subunità
una volta che è stata sintetizzata la catena polipeptidica.

Il rilascio della catena è dato da molecole energetiche. Quando viene rilasciata la catena
polipeptidica, i fattori nominati nella fase di inizio si uniscono alle due subunità che ritornano
nuovamente separate.

Inibitori traduzione

Ad inibire la traduzione intervengono varie molecole:

​ ● PUROMICINA che blocca precocemente la traduzione,

​ ● CLORAMFENICOLO che agisce sulla peptidiltransferasi,
​ ● ERITROMICINA che agisce sulla traslocasi,
​ ● TETRACICLINA interviene sul legame con l'amminoacil trna sintetasi,
​ ● CHIRROMICINA blocca il rilascio del fattore EF-Tu,
​ ● ACIDO FUSIDICO blocca il fattore di allungamento EF-G.
AMPLIFICAZIONE DNA

Si amplifica tramite 2 tecniche: clonazione e PCR.

Clonazione

Il DNA viene clonato tramite il suo inserimento in un vettore. Per far ciò si devono seguire
varie fasi.

1. Scelta e preparazione del vettore di clonaggio (plasmidi, fagi, cosmidi, cromosomi

artificiali, BAC,YAC).
2. Preparazione dei frammenti di DNA (da clonare) tagliati con l’enzima di restrizione.
3. Unione del DNA da clonare e vettore di clonaggio che viene tagliato con lo stesso
enzima di restrizione del DNA per unire le estremità appiccicose con l'enzima ligasi.
4. Introduzione nella cellula ospite del DNA ibrido ,che può essere una cellula batterica
( procariote ) e si parlerà di trasformazione ,o una cellula di lievito (eucariote) e si
parlerà di traspezione.
5. Analisi dei prodotti.
In base ai vettori si dividono in diverse classi e ognuna ha un contenuto massimo di DNA.

Kb sono le kilobasi

VETTORE FAGICO

Un esempio di vettore è il
batteriofago lambda.
Dopo aver ottenuto il frammento di
DNA con l'enzima di restrizione
SAU3 , si deve tagliare il vettore
fagico con l'enzima di restrizione
BAMH1 e si ottengono 3 frammenti:
braccio sinistro, porzione centrale
che viene eliminata, braccio destro.

Quindi rimangono solo braccio

destro e sinistro. Con l'enzima
LIGASI, si uniscono i frammenti di
DNA genomico con quel vettore fagico.
La ligazione porta alla formazione di concatenameri,cioè il braccio sinistro del vettore , si
unisce ad un frammento del dna genomico, il frammento a sua volta è unito con il braccio
destro che lega il braccio sinistro.

Successivamente avviene l'impacchettamento nelle particelle fagiche che infettano i batteri.

Sulla piastra dove queste sono seminate , si vedranno delle placche chiamate placche di
lisi,che corrispondono a un clone , cioè un raggruppamento di particelle fagiche. L'insieme di
tutte le placche prende il nome di genoteca.

COSMIDI

Sono dei vettori fagici e plasmidici.

Sono dei plasmidi che contengono il sito COS che è una regione del fago ed è costituito
dalla giunzione delle estremità destra e sinistra dei due bracci. Il procedimento è identico a
quello precedente, con la differenza che nei plasmidi il vettore rimaneva circolare, qui invece
si linearizza.
Avviene la ligazione, l'impacchettamento, il fago inietta la cellula e si formano colonie e non
placche.

SCREENING GENOTECA

Sopra una piastra di placche fagiche applichiamo filtro di nitrocellulosa o nylon, quindi le
placche vengono assorbite sul filtro che ,viene messo in incubazione con alcune sonde
marcate es. Fosforo 32 (radioattivo). Grazie alla sonda, siamo riusciti a sviluppare la lastra
autoradiografica x osservare se il frammento amplificato e la sonda legano. Questo si usa
per vedere la funzione della sonda.

CROMOSOMI ARTIFICIALI DI LIEVITO

È indicato anche come YAC, e presenta delle caratteristiche

- UMANE (degli eucarioti) che sono la sequenza CEN (è la sequenza del centromero)
e due sequenze TEL (sono le sequenze dei telomeri),
- PLASMIDE come l'origine di replicazione ORI e il gene pBR322 che conferisce la
resistenza all'ampicillina.
​
​ Presenta quindi:
​ ● il sito di origine di replicazione del lievito ARS1(caratteristica plasmide),
 ​ ● il gene Sup4 è un gene soppressore e origina un tRNA mutato che ha l'anticodone
mutato. L'anticodone si combina con il codone di stop che si trova sul gene ADE2 e
si forma YAC ricombinante (è un'eccezione perché i tRNA non riconoscono codoni di
stop),
​ Il gene ADE2 è coinvolto nel metabolismo dell'adenina infatti: se YAC è normale, si
esprime come gene soppressore e il lievito è di colore bianco; se è YAC
ricombinante, il lievito sarà di colore rosso perché si accumulano i prodotti del
metabolismo.

Svantaggi :
● instabilità perché è un vettore molto grande e può esserci un ricircolo invece della
ricombinazione,
● chimerismo cioè si formano vettori con parti differenti di vettori diversi.

Lo screening della banca dati YAC si effettua tramite la PCR. Si usa la piastra di TERASAKI
che è formata da 96 pozzetti e ognuno contiene il DNA genomico. Questa piastra è formata
da 8 righe e 12 colonne, la combinazione tra esse ci darà 20 campioni e una reazione di
PCR.