Nama : Salsha Khairunnisa Nilai :

Kelas : 13 – 3

NIS : 18.64.09092
Tanggal : 9 November 2021

JUDUL PENETAPAN:
PENETAPAN UJI KESESUAIAN SISTEM PADA PENETAPAN KAFEIN DALAM SAMPEL
CAIR DENGAN HPLC

I. PRINSIP ANALISIS (20):

Kafein sebagai 1,3,7-trimethylxanthine, merupakan senyawa organik
golongan alkaloid yang memiliki sifat kebasaan lemah. Kafein biasa terdapat
dalam kopi, teh (camellia sinensis), minuman suplemen dan obat. Kafein
dapat larut sebanyak 22 mg/mL air. Untuk penetapan secara HPLC, sampel
dilarutkan dalam air, diencerkan sehingga masuk kisaran kerja li near dan
dibaca pada panjang gelombang 272 nm menggunakan kolom pemisah C18
dan fasa gerak campuran air dan methanol = 60:40. Puncak kafein biasanya
memiliki waktu retensi di kisaran 5,5 sampai 6 menit untuk kecepatan alir
fasa gerak 1 mL/menit.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah pemisahan analit
berdasarkan kepolarannya yang berlangsung di dalam fasa diam yaitu
kolom. Ketepatan dalam pemilihan kolom sangat berpengaruh terhadap
kromatogram yang dihasilkan. Kolom yang digunakan yaitu reversed phase
C18 yang mempunyai fasa diam bersifat non polar dan kafein merupakan
senyawa yang bersifat polar. Senyawa-senyawa non polar yang terkandung
dalam minuman kopi kemasan akan melekat lebih lama pada kolom yang
sama-sama bersifat non polar, oleh karena itu senyawa kafein yang
bersifat polar akan keluar lebih cepat melewati kolom yang kemudian akan
dibaca oleh detektor. Komponen penentuan uji kesesuaian sistem meliputi
presisi, faktor tailing, resolusi dan jumlah plat teoritis (Gandjar dan Rohman,
2007).
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan
kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan
 kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah (Ardianingsih, 2009).

Sistem HPLC dapat dilihat pada gambar diatas, teknik pemisahan

KCKT dilakukan dengan cara menginjeksi sampel yang berbentuk cairan ke
dalam fase gerak yang dialirkan melalui kolom yang berisi partikel dari suatu
fase diam. Komponen yang keluar dari kolom, kemudian dideteksi oleh
detektor. Sinyal yang dihasilkan direkam dalam bentuk suatu kromatogram
(Anastasia, 2011).
Metode uji kafein dalam minuman kopi ini perlu untuk dilakukan
validasi karena merupakan metode baku yang dimodifikasi, validasi
dilakukan untuk mengetahui hasil analisis yang didapatkan sesuai dengan
tujuan dalam penggunaannya dan dapat dipertanggung jawabkan. Validasi
uji kafein dalam minuman kopi mengacu kepada SNI 2983:2004.

II. PERSIAPAN SAMPEL (20):

a. Identifikasi sampel : Kafein
Tgl. Pembuatan :-
Sifat fisik sampel
- Wujud padat/cair/gas : Padat

- Warna : Putih

- Bau : Normal
 b. Bagan Kerja Praktikum Sst/Uji Kesesuaian Kafein:

 Persiapan Standar Induk

LU 500 mL
kafein dimasukkan ke dalam LU dan
dihimpitkan Aquabidest (1000
Padatan kafein diambil Kafein ditimbang ± mg/L)
0,5000 gram

Diinjeksikan ke HPLC sebanyak

10 kali Disaring dan Dimasukkan ke LU
diberikan filter 100 mL (100 mg/L)
holder
Dipipet
sebanyak 10 mL

 Program HPLC

Parameter Value
Instrumen HPLC Agilent 1100
Kolom Shimadzu GIS C18 partikel 5 mikrometer 4.6 x 250 mm
Fase Gerak Air : Metanol (60:40)
Kecepatan Alir 1.0 mL/menit
Waktu Pemisahan 8 menit
Detektor UV – VIS (VMD) ʎ = 272 nm
Volume Injektor 100 ɥL
III. Data Hasil Pengamatan (30):

1. Data Penimbangan

Bobot Kaca Arloji + Bobot Kafein 19,7981 g

Bobot Kaca Arloji 19,2987 g
Bobot Kafein 0,4994 g

2. Data Pengamatan
Ulangan tR (min) peak height Area Tf K’ N Rs

1 5.589 833.27 6167.59 1 1.11 9382.4572 >2

2 5.559 835.22 6160.01 1 1.10 9282.0034 >2
3 5.554 832.40 6130.48 1 1.10 9265.3000 >2
4 5.552 837.35 6160.08 1 1.10 9258.6419 >2
5 5.553 837.59 6159.86 1 1.10 9261.9774 >2
6 5.546 819.58 6043.39 1 1.10 9238.6413 >2
7 - - - - - - -
8 - - - - - - -
9 - - - - - - -
10 - - - - - - -
Rata-rata 5.5588 832.57 6136.40 1 1.10 9275 >2
SD 0.0153 6.6982 47.32 - - - -
RSD (%) 0.2752 0.8045 0.711 - - - -
Kriteria RSD ≤ 1% RSD ≤ 1% RSD ≤ 1% Tf ≤ 2.0 K ≥ 2.0 N≥ 2000 Rs ≥ 2
Asesmen Lulus Lulus Lulus Lulus Tidak Lulus Lulus Lulus
(Lulus/ Tidak
 Lulus)

3. Cara perhitungan

System Suitability Kriteria Cara Perhitungan

Parameter
x 1+ x 2+ x 3+ x 4+ x 5+ x 6 5,589+5,559+5,554 +5,552+ 5,553+ 5,546
x́= = =5,5588
6 6
n
Injection Precision for
Retention time
RSD ≤ 1% SD= √∑ i=1
¿¿¿¿

SD 0,0153
RSD= x 100 %= x 100 %=0,2752 %
x́ 5,5588
x 1+ x 2+ x 3+ x 4+ x 5+ x 6 6167,59+6160,01+6130,48+ 6160,08+ 6159,86+6143,39
x́= = =6136,40
6 6
n
Injection Precision for
Peak area
RSD ≤ 1% SD= √∑ i=1
¿¿¿¿

SD 47,32
RSD= x 100 %= x 100 %=0,711 %
x́ 6136,40
x 1+ x 2+ x 3+ x 4+ x 5+ x 6 833,27+ 835,22+ 832,40+837,35+837,59+ 819,58
x́= = =832,57
6 6
n
Injection precision for
peak height
RSD ≤ 1% SD= √ ∑ ¿¿¿¿
i=1
SD 6,6982
RSD= x 100 %= x 100 %=0,8045%
x́ 832,57
Resolution Rs ≥ 2.0 >2

Tailing Factor at 5% Tf ≤ 2.0 A +B

height Tf =
2A
 0,3+0,3
Tf 1 = =1
2 x 0,3
0,3+0,3
Tf 2 = =1
2 x 0,3
0,3+0,3
Tf 3 = =1
2 x 0,3
A +B
Tf = 0,3+0,3
2A Tf 4 = =1
2 x 0,3
0,3+0,3
Tf 5 = =1
2 x 0,3
0,3+0,3
Tf 6 = =1
2 x 0,3
Tf 1+Tf 2+ Tf 3+Tf 4 +Tf 5+ Tf 6 1+1+1+1+1+1
Tf rata-rata = = =1
6 6
Capacity Factor K’ ≥ 2.0 t R−t 0
t R−t 0 K’ =
K’ = t0
t0 5,589−( 5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
-4
t0 ≈ 5 x 10 x L x d 2 K’ 1 = =1,11
L = Column lenght (mm)
(5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
d = inner diameter of 5,559−( 5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
K’ 2 = =1,10
T R−T D (5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
column (mm)
TD 5,554−(5 x 10−4 x 250 x 4,62)
K’ 3 = =1,10
(5 x 10−4 x 250 x 4,62)
5,522−(5 x 10−4 x 250 x 4,62 )
K’ 4 = =1,10
(5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
5,553−( 5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
K’ 5 = =1,10
(5 x 10−4 x 250 x 4,6 2)
 −4 2
5,546−(5 x 10 x 250 x 4,6 )
K’ 6 = =1,10
(5 x 10−4 x 250 x 4,62)

K’ rata - rata =
' ' ' ' ' '
K 1+ K 2+ K 3+ K 4+ K 5+ K 6 1 , 11+1,10+1,10+1,10+ 1,10+ 1,10
= =1,10
6 6

Theoritical Plate (N) N≥2000 tR 2

N=16 x ( )
W
1 min
W 1= x 0,6 cm=0,2308 min
2,6 cm
1min
W 2= x 0,6 cm=0,2308 min
2,6 cm
1min
W 3= x 0,6 cm=0,2308 min
2,6 cm
1min
W 4= x 0,6 cm=0,2308 min
2,6 cm
1min
W 5= x 0,6 cm=0,2308 min
2,6 cm
1 min
W 6= x 0,6 cm=0,2308min
2,6 cm

5,589 2
N 1=16 x ( ) =9382,4572
0,2308
5,559 2
N 2=16 x ( ) =9282,0034
0,2308
5,554 2
N 3=16 x ( ) =9265,3
0,2308
 2
5,552
N 4=16 x ( ) =9258,6419
0,2308
5,553 2
N 5=16 x ( ) =9261,9774
0,2308
5,546 2
N 6=16 x ( ) =9238,6413
0,2308
N 1+ N 2+ N 3+ N 4 + N 5+ N 6 9382,4572+ 9282,0034+9265,3+ 9258,6419+9261,9774+ 9
N rata−rata= =
6 6
IV. Pembahasan (25):
Pada praktikum ini dilakukan uji kesesuaian system (UKS) HPLC dengan
menngunakan kafein. High performance liquid chromatography (HPLC) atau yang
sering disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi yang
penggunaannya paling luas.
Uji Kesesuaian Sistem (UKS) pada instrumen HPLC penting dilakukan dalam
proses validasi metode sebelum pengujian sampel uji. Tujuannya untuk memastikan
sistem kromatografi atau instrumen sudah berjalan dengan baik, efektif, serta
memberikan hasil analisis yang valid untuk pengujian. Komponen penentuan uji
kesesuain sistem meliputi presisi, faktor tailing, resolusi, dan jumlah plat teoritis
(Gandjar dan Rohman, 2007).
a. Presisi
Presisi adalah parameter uji yang digunakan untuk mengetahui kedekatan hasil
dari keterulangan pengujian. Presisi dinyatakan sebagai Presentase Relative
Standar Deviation (% RSD), semakin kecil nilai % RSD yang diperoleh maka
semakin tinggi tingkat ketelitiannya. % RSD dapat diterima dan dikatakan
memiliki presisi yang baik jika lebih rendah dari 2/3 % CV Horwitz (AOAC, 2012).
2.6.2.
b. Faktor tailing
Faktor tailing adalah pengukuran asimetri puncak. Peningkatan dari puncak
asimetri menyebabkan penurunan resolusi, batas deteksi, presisi dan mengalami
pemisahan yang memburuk. Batas keberterimaan faktor tailing yaitu T ≤ 2
(Mukhejee dan Bera, 2012). Bentuk kromatogram yang normal yaitu jika faktor
tailling berada pada rentang yang diizinkan, T ≤ 2 .
c. Resolusi (daya pisah)
Resolusi adalah jarak antara waktu retensi dari dua puncak yang saling
berdekatan. Nilai resolusi yang baik yaitu ˃ 1,5 menunjukkan bahwa kedua
kromatogram tersebut dapat terpisah dengan baik (Snyder dkk,2010). Resolusi
yang diperoleh semakin besar, maka pemisahannya semakin sempurna yang
menandakan sistem layak untuk digunakan. Resolusi yang baik dapat dilihat dari
kromatogram yang diperoleh. Kromatogram yang baik yaitu jika peak tidak
tumpang tindih antara kromatogram satu dengan yang lain.
d. Jumlah plat teoritis
Jumlah plat teoritis (N) adalah banyaknya distribusi keseimbangan yang terjadi
pada suatu kolom. Plat teoritis (Theoritical Plate) digunakan untuk menunjukkan
 efisiensi kolom (Susanti dan Dachriyanus, 2017). Efisiansi kolom berhubungan
dengan pelebaran puncak dari pita awal ketika melewati kolom. Efisiensi kolom
dikatakan baik jika didapatkan nilai N ˃ 2000. Semakin besar nilai N maka
semakin baik pemisahannya (Rubiyanto, 2016).
e. Faktor Kapasitas (K’)
Menurut (Kumia, Dewi. 2019) Faktor kapasitas (k') adalah nilai retensi suatu
komponen dalam kolom. Jika nilai k' kecil, maka komponen tertahan sebentar
dalam kolom dan menunjukkan bahwa analit terlalu cepat melewati kolom
sehingga tidak terjadi interaksi antara analit dengan fase diam. Jika nilai k' lebih
besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih
Iama dan puncaknya melebar. Dari hasil praktikum didapatkan nilai K sebesar
1.10 yang berarti kurang dari uji kesesuain sistem yaitu harus lebih dari 2. Bila
harga k' kecil berarti analit ditahan sedikit oleh kolom dan terelusi dekat dengan
puncak fase gerak. Ini menghasilkan pemisahan yang kurang bagus (Meri'
Susanti, Dachriyanusus. 2017). Nilai factor kapasitas dari analit yang lebih kecil
dari 1 dan juga lebih besar dari 20 akan menjadi masalah dalam analisis
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (Ornaf dan Dong,2005).
Perbaikan sistem HPLC untuk memperbaiki nilai faktor kapasitas dapat
dilakukan dengan mengubah fase gerak untuk memperbesar polaritas, lalu
mengubah temperature, karena pada umumnya kenaikan temperatur akan
memperkecil waktu retensi; dan mengubah bentuk komponen.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase diam keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu tertak pada suhu tinggi.
Dalam melakukan analisis menggunakan instrument KCKT, terdapat beberapa
sistem yang dapat diatur yang dapat disesuaikan agar diperoleh hasil analisis yang
baik, seperti laju alir, penyesuaian tipe dan komponen dari fase gerak, dan
penyesuaian kolom yang digunakan. Sistem yang digunakan haruslah tepat dan
sesuai pada kondisi optimum agar dapat memberikan hasil yang baik dan valid. Oleh
karena itu, sebelum melakukan analisis sampel kualitatif maupun kuantitatif dengan
HPLC perlu dilakukan uji kesesuaian sistem terlebih dahulu. Untuk mengetahui
apakah sistem yang digunakan telah sesuai dapat diketahui berdasarkan beberapa
parameter, seperti resolusi, waktu retensi, luas puncak, tailing factor, faktor kapasitas
dan nilai lempeng teoritis. Tiap parameter pengujian ini memiliki batas syarat yang
harus dipenuhi agar sistem dapat dikatakan sesuai untuk analisis sampel tertentu.
Sebelum dilakukan uij kesesuaian sistem kafein dengan metode HPLC,
pertama-tama dilakukan pengkondisian kolom. Pengkondisian kolom HPLC meliputi
 pengaturan tekanan kolom, laju alir fase gerak, serta pencucian kolom dengan
menggunakan metanol:air. Proses ini dilakukan untuk meningkatkan kepekaan
kolom dan menghindari pengotor atau sisa analit yang masih tertahan pada kolom
pada analisis sebelumnya agar tidak mengganggu analisis dan tidak merusak kolom.
Selanjutnya dilakukan analisis sampel. Fase diam (kolom) yang digunakan
pada kolom reverse phase (fase terbalik) HPLC pada praktikum ini adalah Shimadzu
GIS C18 partikel 5 ɥm 4,6 x 250 mm yang mempunyai fasa diam bersifat non polar
dan kafein merupakan senyawa yang bersifat polar. Senyawa-senyawa non polar
yang terkandung dalam minuman kopi kemasan akan melekat lebih lama pada
kolom yang sama-sama bersifat non polar, oleh karena itu senyawa kafein yang
bersifat polar akan keluar lebih cepat melewati kolom yang kemudian akan dibaca
oleh detektor. Komponen penentuan uji kesesuaian sistem meliputi presisi, faktor
tailing, resolusi dan jumlah plat teoritis. Digunakan air dan methanol sebagai fase
gerak dengan perbandingan air:methanol adalah 60:40 dan digunakan detektor UV-
VIS Variable Wavelength Detector (VWD) dengan panjang gelombang 272 nm.
Cara kerja HPLC adalah pertama, fasa gerak (Air : Methanol 60 : 40).
Dialirkan melalui kolom ke detector dengan bantuan pompa kemudian cuplikan
dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom
terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan
interaksi antara solutesolut terhadap fase diam. Solute-solut yang kurang kuat
interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Setiap
komponen yang keluar kolom deteksi oleh detector kemudian di rekam dalam bentuk
kromatogram.
Dari seluruh hasil parameter pengujian ini menunjukkan bahwa sistem yang
digunakan belum dalam kondisi optimum yang efisien karena capacity factor belum
memenuhi syarat dimana syarat keberterimaan capacity factor, yaitu K’ ≥ 2.0 karena
kurangnya presisi saat melakukan injeksi (analis lebih dari satu orang). Ketika dari
hasil parameter uji kesesuaian sistem yang dilakukan ini tidak memenuhi syarat.
Pengubahan sistem yang dapat dilakukan diantaranya pengubahan fase gerak,
kolom, maupun laju alir.

V. Kesimpulan (10):
Berdasarkan Uji Kesesuaian Sistem (UKS) pada penetapan kadar kafein
dalam sampel cair dengan HPLC Agilent 1100 yang telah dilakukan, diperoleh nilai
%RSD untuk retention time, peak area, dan peak height secara berturut-turut,
sebesar 0,2752%, 0,711%, dan 0,8045%. Nilai %RSD untuk retention time, peak
area, dan peak height telah memenuhi syarat keberterimaan presisi, yaitu % RSD ≤
 1 %. Nilai resolusi tidak diperoleh karena hanya standar kafein yang diukur pada
parameter UKS, sehingga tidak diperoleh data jarak antar kromatogram. Diperoleh
nilai rata-rata tailing factor pada 10% height, sebesar 1, angka tersebut telah
memenuhi syarat keberterimaan tailing factor, yaitu Tf ≤ 2.0. Diperoleh nilai rata-rata
capacity factor, sebesar 1.40, angka tersebut belum memenuhi syarat keberterimaan
capacity factor, yaitu K’ ≥ 2.0 karena kurangnya presisi saat melakukan injeksi
(analis lebih dari satu orang). Diperoleh nilai rata-rata theoretical plate, sebesar
9275, angka tersebut telah memenuhi syarat keberterimaan theoretical plate, yaitu N
≥ 2000.

VI. Daftar Pustaka (5):

• Anastasia, Y. 2011. Teknik Analisis Residu Golongan Tetrasiklin Dalam
Daging Ayam Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Bogor: Balai Besar
Penelitian Veteriner.
• Arifin, Z. & Krisnadi Ismail. 2009. Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
Bogor: SMK-SMAK Bogor.
• Fitri et al., 2020. Laporan Praktikum Analisis Fisiko-Kimia Uji Kesesuaian
Sistem KCKT. Bandung: Universitas Bhakti Kencana.
• Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka
Pelajar, Yogyakarta.
• Listyaningrum, S. 2020. VALIDASI METODE UJI KAFEIN DALAM MINUMAN
KOPI MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
DI PT SARASWANTI INDO GENETECH BOGOR. Yogyakarta: Universitas
Islam Indonesia.
• Ornaf, R.M., & Dong, M.W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by
HPLC, Vol. 6, Amsterdam: Elsevier Academic Press.

Bogor, 9 November 2021

Guru Praktik Siswa

(...................................) ( Salsha Khairunnisa )