Faculté de Médecine de Constantine

Département de Pharmacie
Laboratoire de Chimie Analytique

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE

PERFORMANCE HPLC

Dr F. TITEL
3e année Pharmacie 1
 PLAN
1. Introduction
2. Principe
3. Principaux modes de séparation en HPLC
4. Chromatographie de partage
5. Appareillage
 Réservoir et dégazeur
 Pompe et gradient d’élution
 Système d’injection
 Colonnes
 Détecteurs
6. Chromatographie liquide ultra performante UPLC
7. Applications

2
1. INTRODUCTION

La chromatographie liquide à haute performance ( HPLC) est devenue un outil

analytique performant utilisée dans des domaines variés.

C’est une technique analytique et/ou préparatrice utiliser pour la séparation des analytes
en mélange homogène.

Dans cette technique:

• La phase mobile est un liquide

• La phase stationnaire est conditionnée dans une colonne

3
1. INTRODUCTION

La chaine HPLC dérive de la forme la plus ancienne de chromatographie : la

chromatographie sur colonne ouverte.

Cette dernière a été sujette à de nombreuses

améliorations particulièrement la nature et de la
granulométrie de la phase stationnaire qui
nécessitent de fortes pressions pour obtenir des
débits convenables.

4
1. INTRODUCTION

5
2. PRINCIPE

La chromatographie liquide est basée sur la distribution différentielle des espèces à analyser
entre deux phases non miscibles :
• Une phase stationnaire
• Une phase mobile liquide

Chaque soluté se répartit entre les deux phases citées selon un coefficient de distribution
de Nernst K:

6
2. PRINCIPE

Soit deux substances A1 (de coefficient de distribution K1) et A2 (de coefficient de

distribution K2) , la séparation chromatographique donne trois cas suivants:

La rétention L’élution
A1 est plus retenue A2 est éluée en premier
A2 est plus retenue A1 est éluée en premier
Pas de séparation chromatographique

7
3. PRINCIPAUX MODES DE SÉPARATION EN HPLC

Types d’interactions en chromatographie liquide

8
3. PRINCIPAUX MODES DE SÉPARATION EN HPLC

Chromatographie liquide
solide Type d’interaction :
Adsorption
Phase stationnaire : Solide adsorbant Phase mobile : Liquide solvant
Kieselguhr, Gel de silice et Alumine Mélange de solvants d’une série
éluotropique:
Éther de
pétroletétrachlorométhane 
toluèneéther
diéthyliqueméthanoleau
3. PRINCIPAUX MODES DE SÉPARATION EN HPLC

 Chromatographie ionique
Type d’interaction : Echange d’ions

Phase stationnaire Phase mobile :

Liquide
Résines échangeuses d’ions solutions aqueuses qui contiennent des ions échangeables
avec les groupements fonctionnels

10
10
3. PRINCIPAUX MODES DE SÉPARATION EN HPLC

Chromatographie d’exclusion
stérique Type d’interaction : Exclusion
stérique
Phase stationnaire Phase mobile : Liquide
Phase solide poreuse Organique (chromatographie de perméation de gel)
Aqueux (chromatographie d’exclusion de gel)
3. PRINCIPAUX MODES DE SÉPARATION EN HPLC

Chromatographie de
partage Type d’interaction :
Partage
Phase stationnaire Phase mobile : Liquide
Liquide Liquide non miscible

La chromatographie liquide de partage est le mode le plus utilisé.

12
Dans le reste du cours, on va s’intéresser uniquement à ce type de chromatographie

12
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

 Phase stationnaire:

La phase stationnaire est greffée sur un support par une réaction appelée :

greffage Le support le plus utilisé est le gel de silice SiO2(H2O)n

Avantages du gel de silice:

• Grande surface spécifique (matériaux poreux)
• Grande résistance mécanique
• Faible taille des particules (1.5 à 10 μm ) → bonne efficacité
• Répartition granulométrique très étroite
• Particules sphériques → reproductibilité de remplissage
• Réactivité des groupements silanol Ξ Si - OH
(Possiblité de greffage)
13
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

Inconvénients du gel de silice:

• Solubilisation de la silice en milieu alcalin > 8

Le greffage: ou appelée aussi la réaction de silanisation du gel de silice

Réaction d’une organosilane à fonction réactive X sur les groupements silanols du support
de silice par formation de liaison chimique covalente → pont siloxane

OH CH3 OH CH3
H-X
Si - OH + X – Si – R Si – O – Si – R +
O CH3
O CH3

X = ( Cl, OCH3 , OC2H5 )

réaction de silanisation du gel de silice 14

4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

Selon la polarité des greffons R, on distingue:

• Chromatographie en phase normale (NPLC)
• La phase stationnaire est polaire
• La phase mobile est apolaire
• Chromatographie en phase inversée (RPLC)
• La phase stationnaire est apolaire
• La phase mobile est polaire

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4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

Exemples de phase stationnaires greffées

NB : La colonne C18 est utilisée dans plus 80 % des analyses en chromatographie liquide
de partage
16
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

 Phase mobile

Phase mobile est constituée d’un ou de plusieurs solvants miscibles , qui doit avoir
les qualités suivantes:
• Pouvoir solvant et inertie vis-à-vis des solutés à analyser
• Non miscibilité vis-à-vis de la phase stationnaire
• Compatibilité avec le système de détection

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4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

 Choix de la phase mobile:

Généralement, le mélange de solvants miscibles constituants la phase mobile est composé de:
• Solvant de base de polarité inverse à celle de la phase stationnaire => sert à favoriser la
rétention des solutés retenus par la phase stationnaire, il est appelé Solvant faible ou
Peu élutif
• Modificateur qui a une polarité proche de celle de la phase stationnaire => sert à
favoriser
l’élution des solutés retenus par la phase stationnaire, il est appelé Solvant fort ou
fortement élutif

18
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
 Choix de la phase mobile

Solvants classés
Phase normale Phase inversée
NPLC par polarité RPLC
PS: polaire croissante PS: apolaire
Hexan
e
Toluèn
e
Trichlorométha
ne
Dichlorométha
ne Éther
Acétate
19
d’éthyle
Acétonitrile
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
 Choix de la phase mobile

Phase stationnaire Phase mobile

Solvant de base Modificateur
= Solvant faible = Solvant fort
= Peu élutif = Fortement élutif
Chromatographie liquide Polaire : Plus polaire:
en phase normale Apolaire:
Aminopropyl,
NPLC Cyanopropyl,… Hexane , Toluène Éther, Acétate d’éthyle

Chromatographie liquide Moins polaire:

en phase inversée Apolaire: Polaire:
Acétonitrile, Méthanol
RPLC Actyl, octadécyl,… eau et THF

20
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

21
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
 Contrôle de pH phase mobile : cas de RPLC

En RPLC, si coexistence des deux formes moléculaire et ionisée d’un soluté:

• Forte rétention de la forme moléculaire du soluté par la phase stationnaire.
•Faible rétention pour la forme ionisée par la phase
stationnaire. Cas d’un acide faible:
Diminution du pH augmentation du pourcentage de la forme
moléculaire augmentation de la rétention

Augmentation du pH diminution du pourcentage de la forme

moléculaire Diminution de la rétention

Quand les solutés sont de nature acide ou base faible, il devient nécessaire de
contrôler le pH
de la phase mobile. 22
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

23
4. CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE
 Ordre d’élution des solutés en HPLC de partage

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5. APPAREILLAGE

Colonn
e Logici
el

Systèm
e
d’injecti
on

Réservoir
Phase Echantill
mobile on
Pompe Détecte
s ur

Efflue
Schéma des différents composants d’une chaine HPLC nt
(Déche
t)
25
5. APPAREILLAGE

 Réservoirs de phase mobile

Bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une extrémité filtrante
en téflon ou en acier inoxydable

Ces réservoirs sont étanches pour éviter l'évaporation des solvants et

la contamination par l'eau atmosphérique.

Tous les solvants doivent être filtrés sur filtre de 0,45µm et ultrasonnés à
l’aide d’un bain à ultrason avant utilisation en HPLC.

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5. APPAREILLAGE

 Dégazeur:

Dans le dégazeur, la phase mobile passe

dans un tube poreux semi-perméable
placé dans une enceinte où on fait le
vide.
Seuls les gaz peuvent s’échapper par les
pores du tube.

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5. APPAREILLAGE

 Pompe

Une pompe idéale doit réunir les qualités suivantes :

• Obtention de grandes pressions (jusqu'à 400 bars).

• Débit constant, reproductible et sans pulsation.
• Grandes gammes de débit ( de 0.1 à 10 ml/mn ).
• Résistance à la corrosion.
• Faible volume de la chambre de la pompe.
• Délivrance non limitée du solvant.

28
5. APPAREILLAGE
 Pompe

Le système de pompage le plus utilisé en HPLC. est les pompes à piston

a. moteur
b. transmission
c. joint d’étanchéité
d. piston
e. entrée solvant
[Link] d’entrée et
de sortie
g. sortie solvant

Schéma de principe d’une pompe à piston

29
5. APPAREILLAGE
 Pompe

le fonctionnement de ces pompe nécessite deux phases: aspiration et

refoulement

Aspiration à partir du réservoir Refoulement vers colonne

Inconvénient: débit pulsé

Refoulement

Aspiration
30
5. APPAREILLAGE

 Pompe

Pour corriger le problème de pulsation

du débit, on utilise:
• deux pompes fonctionnant en
tandem (en opposition de phase)
• un amortisseur de pulsation

Principe de fonctionnement d’une pompe

HPL3C1
5. APPAREILLAGE

 gradient d’élution

Si la phase mobile garde la même composition au cours de toute la durée de l’analyse,

on parle de mode isocratique

Si la phase mobile change de composition au cours de la même analyse, on parle de

mode gradient

Le mode gradient peut être obtenu de deux manières:

• Gradient à basse pression
• Gradient à haute pression
32
5. APPAREILLAGE

 gradient d’élution

Fig: Intérêt du mode gradient

33
5. APPAREILLAGE

 Gradient à basse pression

• il utilise une seule pompe couplée avec une vanne proportionnante commandée
par microprocesseur
• la vanne détermine la proportion de chaque solvant introduit dans la pompe

34
5. APPAREILLAGE

 Gradient à haute pression

• il utilise deux pompes couplées à une seule sortie où les deux débits sont mélangés
• le gradient est obtenu en modifiant, à débit total constant, le rapport des débits des
deux pompes

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5. APPAREILLAGE

 Système d’injection

Il s’agit de vannes d’injection à six voies avec

boucle d’échantillonnage d’une capacité fixe .
Les volumes injectés varient de 1 à 100 μL.

Possède 2 positions. La première permet le remplissage

de la boucle d’injection de volume fixe (load), la seconde
permet la mise en circulation de l’échantillon dans le
système chromatographique (inject).
36
5. APPAREILLAGE

 Système d’injection

Figure : Vanne d'injection à six voies avec boucle d'échantillonnage.

A gauche : Position remplissage de la boucle - A droite: Position injection dans la
colonne
37
5. APPAREILLAGE
 Système d’injection

38
5. APPAREILLAGE

 Colonnes

• Tube en acier inoxydable contenant la phase stationnaire.

• De longueur (5 à 30 cm) et de diamètre interne (3 à
5 mm) définis.
• Précédée d’une précolonne (0.4 à 1 cm) de même nature
de phase stationnaire.
• pour améliorer la reproductibilité des résultats, il faut
placer la colonne dans une enceinte thermorégulée:
le
four 39
5. APPAREILLAGE

 Colonnes

Figure : Vue éclatée d’un montage de colonnes

40
5. APPAREILLAGE
 Détecteurs
• La détection se fait par un instrument placé immédiatement à la sortie de la colonne.
• Permet de suivre en continu la séparation et la mesure de la concentration des
solutés.

Critères de choix du système de détection:

- Fournir une réponse stable, rapide et reproductible.
- Garantir une bonne sensibilité de détection.
- Ne pas altérer la qualité de la séparation.
- Linéarité : réponse proportionnelle à la concentration à chaque instant.
- Minimiser le bruit de fond (réponse aléatoire de la ligne de base).
-Limite de détection faible compatible avec les résultats attendus.
-Non destructif 41
5. APPAREILLAGE
 Classification des détecteurs HPLC

Détecteurs universels Détecteurs spécifiques

• Donnent une réponse à la • Mesurent des propriétés physico-

quasi totalité des analytes à doser. chimiques particulières de certains
• Intéressants dans le cas de mélange analytes à doser.
de composition inconnue. • Avantageux pour doser des traces
détectables parmi d’autres produits
non détectables.

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5. APPAREILLAGE
 Principaux détecteurs utilisés en HPLC Partage

Universels Spécifiques

Réfractomètre différentiel Spectrophotomètre UV – Visible

Détecteur évaporatif à diffusion Spectrofluorimètre

de lumière

Spectromètre de masse Détecteurs électrochimiques

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5. APPAREILLAGE
 Réfractomètre différentiel

Mesure en continu de la différence d’indice de

réfraction entre la phase mobile et l’effluent
de la colonne chromatographique.

R: Réponse du réfractomètre.
Z: Constante caractéristique de l’appareil.
n: Indice de réfraction de l’effluent.
n0: Indice de réfraction de la phase
mobile.
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5. APPAREILLAGE
 Réfractomètre différentiel

Avantages:
• Universel: La réponse dépend à la fois de la nature du soluté et de la phase mobile.
•Non
destructif.
Inconvénients:
• Quantité
minimale
détectable : 100 à
200 ng.
• Grande sensibilité aux variations de la température et de la pression (réfractomètre ultra-
45
thermostaté).
• Ne peut être utilisé en mode gradient.
5. APPAREILLAGE
 Détecteur évaporatif a diffusion de lumière (ELSD)

• Le principe est fondé sur l’évaporation

partielle de l’effluent de la colonne de façon
à obtenir un brouillard de particules solides
ou liquides du soluté qui traverse un faisceau
lumineux.
• La lumière diffusée sous un angle déterminé
est détectable par un photomultiplicateur.

46
5. APPAREILLAGE
 Détecteur évaporatif a diffusion de lumière

1- Nébulisation 2- Evaporation 3- Détection

La phase mobile passe Les gouttelettes passent Un laser heurte les

à travers à travers un tube chauffé, particules.
l’aiguille du se mélange
nébuliseur, la mobile la lumière diffusée
avec l’azote et forme des est est détectée par une
phase
gouttelettes. seules les photodiode
évaporée restent.
particules
47
5. APPAREILLAGE
 Détecteur évaporatif a diffusion de lumière

Avantages :
• Universel
• Non destructif
•Compatible avec le gradient
d’élution Inconvénients:
• Sa sensibilité varie peu en fonction
de la nature des solutés.
• La mise en oeuvre de ce détecteur est limitée à l’emploie de phases mobiles volatiles et
de solutés non volatils.
48
5. APPAREILLAGE
 Détecteur UV-Visible
• Mesure l’absorbance de la lumière UV - Visible lors du passage à travers une solution.
• La sensibilité optimale est obtenue en utilisant le détecteur à la longueur d’onde
où l’absorbance du composé d’intérêt est la plus grande : λmax

A = log (I0/I)
A = - log T
A=εLC
A: Absorbance
T: Transmittance
ε: Absorptivité molaire du soluté à la longueur d’onde λ. I0 I
I0: Intensité du rayonnement incident.
I: Intensité du rayonnement transmis.
L: Longueur du chemin optique.
C: Concentration du soluté dans 49
l’effluent.
5. APPAREILLAGE
On distingue deux type de détecteur UV-Visible:

Détecteur monochromatique:
• l’effluent est irradié par une lumière monochromatique (une seule λ)
• Le chromatogramme est en deux dimensions : Absorbance = f(temps).

50
5. APPAREILLAGE
Détecteur polychromatique:
• l’effluent est irradié par une lumière polychromatique (plusieurs λ)
• Le chromatogramme est en trois dimensions : Absorbance = f(temps, longueur d’onde
λ).

51
5. APPAREILLAGE
 Détecteur UV-Visible

Avantages :
• Sélectivité : bon choix des longueurs d'ondes
• Non destructif.
• Facilité d’utilisation.
• Compatible avec les gradients (cut off des solvants organiques).
•Grande
sensibilité.
Inconvénients:
• les substances
52
doivent être
chromophores;
5. APPAREILLAGE
 Spectrofluorimètre

Principe basé sur la particularité de certaines substances organiques fluorescentes qui

absorbent des radiations dans l’UV et réémettent la lumière absorbée

If =
KC
If: Intensité de la fluorescence
K: facteur de proportionnalité
C: Concentration de l’analyte
5. APPAREILLAGE
 Spectrofluorimètre

Avantages:
• Non destructif.
• Très sélectif.
• Linéarité pour les faibles concentrations.
• Sensibilité :encore plus sensible que le détecteur
UV.
•Compatible avec les
gradients Inconvénients:
• les substances doivent être
fluorescentes (dérivation) 54
5. APPAREILLAGE
 Détecteur électrochimique

• Mesure le changement de courant entre deux électrodes.

• Ce courant résulte des réactions d'oxydo-réduction sur des électrodes implantées dans
des cellules et ajustées à des potentiels spécifiques.

Avantages:
• très spécifique - pour - ions métalliques, anions inorganiques, composés nitrés,
acides aminés et alcaloïdes;
• très sensible.

55
5. APPAREILLAGE
 Détecteur électrochimique

Inconvénients:
• Destructif
• Sensible à la phase mobile (pH);
• Sensible à la présence d'oxygène dissous;
• Sensible au débit et à la température;
• Entretien constant des cellules.

56
5. APPAREILLAGE
 Spectromètre de masse (SM)

Après leurs sortie de la colonne chromatographique, les solutés introduit dans

le spectromètre de masse subissent:
1. Une fragmentation et une ionisation par bombardement électronique
2. Ces ions fragments sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse/charge par
un analyseur (l'application d'un champ magnétique et/ou électronique)
3. Ils sont ensuite collectés par un détecteur.

L'ensemble des ces ions fragments constitue le spectre de masse

57
5. APPAREILLAGE
 Spectromètre de masse (SM)

Le chromatogramme est en trois dimensions : intensité = f(temps de rétention, rapport

masse/charge ).

le spectre de masse permet

l'identification de la structure
moléculaire par comparaison à une
spectrothèque.

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6. Chromatographie liquide ultra performante UPLC

Paramètre HPLC UPLC

Diamètre des particules 3-10 µm Moins de 2µm

Longueur des colonnes 5-30 cm 3-5 cm

Diamètre interne des
3-5 mm 2,1 mm
colonnes

Pression max 35-40 MPa 100 MPa

Débit de la phase mobile +++ +

Volume d’injection 5-20 µl 2µl

59
6. Chromatographie liquide ultra performante UPLC

Avantages de la UPLC:
• Temps d’analyses très réduits moins de 5 minutes.
• Moins de consommations de solvants.
• Meilleur résolution
• Meilleur efficacité
• Utile lorsque la quantité d’échantillon est
minimal

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7. APPLICATIONS

Analyse qualitative:
Le temps de rétention (tR en min) est une caractéristique de chaque soluté dans les mêmes
conditions opératoires.
Comme test d’identification, c’est une méthode insuffisante.
Intérêt d’un couplage avec un détecteur donnant des informations structurales comme le
spectromètre de masse

Analyse quantitative;
Cette analyse est basée sur le fait que l'aire ou la hauteur des pics chromatographiques sont
proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.

61
7. APPLICATIONS
Domaines d’application

Pharmaceutique:
L’analyse par HPLC dans ce domaine permet:
•Identification des constituants des médicaments (HPLC-DAD, HPLC-MS)
Contrôler les impuretés organiques dans les substances et produits pharmaceutiques
• Dosage des principes actifs

Environnement:
L’analyse par HPLC dans ce domaine permet:
• L’identification de quelques composés dans les extraits de plantes.
• Analyse des contaminants dans les eaux résiduaires.
62
7. APPLICATIONS
Agroalimentaire:
L’analyse par HPLC dans ce domaine permet de:
• Contrôler les contaminants et les additifs dans une matrice alimentaire
• Contrôler la qualité et la sécurité alimentaire
• Analyse qualitative et quantitative des éléments dans les aliments

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