Qu’elles sont

les principales
techniques
Qu’est ce d’immobilisatio
qu’une n?
enzyme
immobilisé Qu’elles
e? sont les

domaines
d’applicatio
n
d’enzymes
immobilisée
s?
 Les enzymes immobilisées

Enzyme immobilisée: Une enzyme immobilisée est une enzyme liée

par des moyens physico-chimiques en surface ou à l’intérieur d’un
support solide

On cherche généralement à conserver son activité enzymatique, qui a

tendance:

 à diminuer après immobilisation du fait de possibles

gênes stériques et de limitations dans l’accessibilité au site
actif .
 à augmenter sa stabilité dans le temps.
 Méthodes d'immobilisation des
enzymes
principales méthodes d'immobilisation des enzymes sont:
 l'adsorption sur support inerte
 le piégeage physique dans des gels ou dans des microencapsulation
 la réticulation avec des réactifs bi ou multivalents la liaison covalente
entre un porteur et des groupes fonctionnels de l'enzyme.

Méthodes d'immobilisation des enzymes

Encapsulation ou Liaisons
Adsorption
inclusion covalentes

[Link] support [Link]

 Méthodes d'immobilisation des enzymes
1
a) adsorption 2
E
b) Liaison covalente E
[Link] support
[Link] E

c) Inclusion

d) Encapsulation
 Immobilisation par adsorption

C’est la méthode la plus simple et la plus rentable. Il s'agit de retenir

l'enzyme à la surface d'un support insoluble, par interaction faible
(intermédiaire ou secondaire) entre les groupes fonctionnels de l’enzyme
et du support.
L’interaction enzyme-support pourra impliquer l’ensemble des liaisons
non covalentes ou secondaires de bas niveau énergétique tel que les
liaisons de Vander Waals, les liaisons hydrogène, ...)

Les matières utilisées sont organiques (collagène, échangeurs d'ions:

cellulose, albumine, chitine, dextrane, amidon) ou minérales (argiles,
verre et silice poreux…).
 Immobilisation par adsorption
Les supports utilisés

Les supports organiques

Comprennent les polyosides comme l’acétate de cellulose, nitrate de cellulose,

dextrane, agarose, alginate et les polymères comme le polystyrène, le
polyéthylène

Les supports inorganiques (support minéraux)

sont généralement plus stables, résistent agents chimiques et

aux bactéries . les matériaux actifs peuvent être aux
des :
* Les argiles
* Verre poreux et silice poreuse

Autres supports : le nylon, oxyde céramique.

 Immobilisation par adsorption
Les paramètres qui influencent
l’adsorption

1. La concentration de l’enzyme

2. Le temps de contacte

3. Composition du milieu

4. La température
 Avantages

 L'adsorption est facile à mettre en œuvre, il suffit de mettre en

contacte l'enzyme et le support.
 Possibilité de régénérer les complexes enzyme-support (si l’enzyme
perd son activité en cours de son fonctionnement, il est possible de
la remplacer par une préparation active)
 Fixation rapide du support et immobilisation simple et non
dénaturante.

Inconvénients
 La fragilité de la fixation (les enzymes
peuvent facilement se
désorber sous l’action de variation de pH,
température…
 L’orientation de l’enzyme et mauvaise
accessibilité au site actif.
 Immobilisation par adsorption

Les possibilités
d’orientation
 Immobilisation d’enzyme par inclusion

Les molécules d’enzyme sont retenues dans le réseau

tridimensionnel d’un polymère insoluble dans l’eau « réseau
d’une matrice », ou emprisonnées dans des
tridimensionnel délimité par une membrane semi perméable dont
microcapsules
les pores sont suffisamment larges pour permettre le passage des
molécules du substrat ou des produits de la réaction.

Inclusion dans un réseau de polymère insoluble.

 Immobilisation d’enzyme par inclusion

Inclusion dans un gel

L'inclusion: il s'agit de retenir l'enzyme à l'intérieur du réseau

tridimensionnel d'une matrice, schématisé comme suit:

Enzyme

Matrice soluble

Phase homogène

traitement

Réseau
 Immobilisation d’enzyme par inclusion

 L’enzyme est incorporée dans un gel insoluble. Ce gel peut être

constitué d’une matrice organique (polymère) ou inorganique.
 La maille de la matrice assure de manière purement physique la
rétention de l’enzyme tout en permettant la diffusion du substrat
jusqu’au site actif de l’enzyme grâce à une porosité du gel suffisante.

Les matières les plus utilisées sont les gels: de

polyacrylamide, d'alginates, d'amidon et les fibresde polyacétate de
cellulose

Le choix du type de polymères va être dépend de :

 Propriétés mécaniques du gel : compression, forces de cisaillement
 Propriétés chimiques : toxicité, condition de stabilité en fonction de
pH
Immobilisation d’enzyme par inclusion

Inclusion dans un gel

inclusion dans le gel de polyacrilamide

 Immobilisation d’enzyme par inclusion

Inclusion dans fibres de polyacétate de cellulose

 On réalise une solution de triacétate de cellulose dans le chlorure

de méthylène.
 On ajoute sous agitation une solution d’enzyme dans l’eau froide ou
dans un tampon contenant de glycérol
 Emulsion obtenue est ensuite extrudée sous pression d’azote dans
un bain de coagulation contenant de toluène.
 Les fibres obtenue est séchée sous vide pour éliminer les solvants et
conserver à 5°C.
 Immobilisation d’enzyme par inclusion
Microcapsulation

La méthode consiste à inclure l’enzyme à l’intérieur de la membrane

semi-perméable
Le diamètre des micro-capsules peut varier de quelques microns à une
centaine de microns.

Membranes semi- perméables

 Assurent la rétention des molécule d’enzyme dans un volume
déterminé en vue d’une utilisation continue (les hydrolase).
 Sont utilisées dans la dégradation des macromolécules (amidon,
protéine).
 Les produits obtenus après l’hydrolyse peuvent franchir les
membranes, ce que permet de les récupérer dans l’effluent selon la
figure suivante :
 Avantages
 Réaction de polymérisation et de gélification bien connues.
 Réaction chimiques avec l’enzyme limitée (inclusion dans des
gels naturels).
 Application à toutes les enzymes (utilisation de mélanges).
 Obtention de supports de forma adaptables (films, billes,
fibre…)
 Elle permet en une seule étape d'immobiliser la totalité de
l'enzyme
 Elle ne présente aucun caractère de spécificité et est applicable à
n'importe quelle enzyme.
 Elle ne met pas en jeu les groupements actifs de l'enzyme.
 Inconvénients
 La localisation de l'enzyme à l'intérieur du polymère pose des
problèmes stériques (efficacité limitée par accès délicat du substrat
vers l'enzyme et du produit en dehors du polymère).
 Les conditions de polymérisation (ex.: pH élevé) peuvent s'avérer
dénaturantes pour l'enzyme.
 Certaines polymérisations font appel à des agents dénaturants ou à
des radicaux.
 Immobilisation par liaison covalente

L'immobilisation par liaison covalente: Il s'agit d'établir des liaisons

covalentes entre l'enzyme et le support utilisé ou entre les molécules d
enzymes, tout en préservant l'activité catalytique de l'enzyme.
On peut diviser les méthodes d’immobilisation d’enzymes par liaison
covalente en deux groupes :
Immobilisation par
liaisons covalentes sur
support

 Elle est réalisée par l’intermédiaire de liaisons irréversibles et covalentes

entre les groupements fonctionnels de l’enzyme et les groupes réactifs du
support
 Ces groupes, en général insuffisamment réactif, nécessiteront une activation
préalable. A priori, il faut activer soit l’enzyme, soit le support.
 l’activation des groupes fonctionnels de l’enzyme peut conduire à la
dénaturation de l’enzyme.
 Immobilisation par liaisons covalentes sur support

immobilisation par liaison covalente

étap1: activation du support , étape 2: fixation
 Immobilisation par liaisons covalentes sur support

immobilisation au bromure de cyanogène BrCN

étap1: activation du support , étape 2: fixation
de l’enzyme
 Immobilisation par liaison covalente
Immobilisation par réticulation
( sans support)

 c'est un procédé d'association des

différentes unités biocatalytiques
ou de
protéines à l'aide d'un agent
réticulant

IImmmmoobbiilliissaattiioonnppaarr
Immobilisation par liaison covalente

Réticulation au glutaraldéhyde
.
 Avantages
 Stabilité accrue à cause de la liaison covalente
 Grand choix de méthodes différentes
 Grande variété de support minéraux (verre, silice, céramique…) et
organiques (cellulose, polymère synthétiques…)
 Possibilité d’effectuer l’immobilisation en présence de substrat pour
éviter l’inactivation (protection du site actif).
 Solidité de la liaison enzyme-substrat.
Inconvénients
 Mise en œuvre de réactions chimiques souvent complexes
 Longueur des expériences (étape de l’activation du support)
 Risques de modifications chimiques de l’enzyme (perte d’activité)
 Nécessite de purifier l’enzyme préalablement
 L'immobilisation est plus complexe à réaliser (choix
des groupements à activer...).
 Les quantités d'enzymes immobilisées sont inférieures par rapport
aux deux précédentes méthodes. Rendements de fixation inferieurs à 100%
 Propriétés des enzymes immobilisées

Propriétés physico-chimiques

Une des propriétés importantes et caractéristiques de l’immobilisation

est :
 l’amélioration de la stabilité dans le temps.
 la résistance vis-à-vis de la dénaturation.
La stabilité de l’enzyme immobilisée dépend
beaucoup du microenvironnement imposé par le support.
 Propriétés des enzymes immobilisées

Propriétés cinétiques
Les propriétés cinétiques d'une enzyme immobilisée ne sont pas
parfaitement corrélées à celles de l'enzyme libre.
La diminution du transfert de masse du substrat dans le support résultant
de l'immobilisation, augmente la valeur du KM de l'enzyme. De plus,
l'orientation stérique de l'enzyme fait que le site actif ne peut être que
partiellement accessible, voire inaccessible au substrat: en d'autres
termes, l'enzyme est maintenue dans une conformation telle que la
fonction catalytique est partiellement ou totalement bloquée.

L’immobilisation des enzymes affecte beaucoup leurs propriétés

cinétiques. Ainsi, les phénomènes de diffusion limitent l’accès du substrat
au niveau du site enzymatique

Dans toutes ces méthodes, l'activité biologique de l'enzyme est affectée

par le procédé d'immobilisation.
Chapitre 1: Propriétés des enzymes immobilisées:

stabilité et résistance aux conditions du milieu (pH, t°,

acidité, …).

activité catalytique préservée (site actif bien orienté).

fixation solide au support, permettant des lavages

répétitifs sans perte de l'enzyme.
 Domaines d'applications des
enzymes immobilisées

Grâce à leur grande spécificité d'action (biospécificité), les enzymes

immobilisées constituent un outil de fabrication et d'analyse important
dans de nombreux secteurs, médical, la recherche et contrôle et de la
production industrielle de métabolites.
Analytique

 En médecine, des papiers imprégnés de solutions enzymatiques sont

utilisés dans certains tests cliniques (dosage du cholestérol, de l'acide
urique, des hormones…).
 Les techniques ELISA utilisent également des enzymes fixées (liées à
des anticorps eux-mêmes fixés par adsorption sur les parois de
petites cuvettes en plastiques), destinées à des dosages cliniques.
 Domaines d'applications

Thérapeutique

Le traitement de certains troubles pathologiques (dus à une déficience

enzymatique) par l'administration d'enzymes se heurte à des difficultés:
destruction par les protéases ou hydrolyse par les macrophages. Dans
ce cas l'enzyme est associée à une molécule protectrice (albumine,
dextrane, polyéthylène glycol), ou alors incluse dans des microcapsules
.
Agro-alimentaire

 Amélioration des propriétés de boissons alimentaires:

viscosité, clarification, digestibilité, goût, etc
 Amélioration de la production de produits lactés.
Les biocapteurs
enzymatiques
 Biocapteur

Le terme « biocapteur » est abréviation « le senseur biologique»

Biosensors en anglais. Le dispositif se compose d'un transducteur et
d'un élément biologique qui peuvent être une enzyme, un anticorps
ou un acide nucléique. Le bioelement agit l'un sur l'autre avec de
l'analyte étant testée et la réaction biologique est convertie en signe
électrique par le transducteur. Une définition généralement citée d'un
biocapteur est :
« Un dispositif se sentant chimique en lequel une reconnaissance
biologiquement dérivée est accouplée à un transducteur, pour
permettre le développement quantitatif d'un certain paramètre
biochimique complexe. »
 Biocapteur

D'une manière générale, un Biocapteur est constitué d'un détecteur

d'origine biologique: enzyme, anticorps, récepteur... et d'un transducteur
chargé de convertir le signal biologique (qui par exemple sera la
fixation de l'antigène à détecter sur l'anticorps) en un signal
généralement électrique ou lumineux.

Parties d'un biocapteur

Un composant Une composante

biologique qui agit en électronique qui
tant que senseur trouve et transmet le
signal
 Biosensors

BIOELEMENT RECEPTOR and TRANSDUCER

Electroactive electrode
Enzyme
substance
Cell
pH change pH electrode
Micro

READ-OUT
Heat thermistor
organism
Light photon
Antibody
counter
Nucleic
Mass piezoelectrical
acids
change device
 Biocapteurs
enzymatiques

Les enzymes

Enzymes REDOX s (reductases, oxidases, oxydo-

réductases). Electrons produits/consommés.
Transducteur ampéromètrique.

Enzymes hydrolytiques (proteases, lipases,

esterases). Protons produits/consommés.
Transducteurs potentiomètrique ou
conductimètrique.
Réactions enzymatiques couplées : peroxidas
donne
avec la une réaction colorée ou emet e,
des photons

photons.
Transducteurs optiques.
 Biocapteurs
enzymatiques
Les
enzymes

Substance enzyme
Glucose Glucose oxidase
Urea Urease
Acide urique Uricase
Acide aminée L-amino acid oxidase
Cholestérol Cholestérol oxidase
Alcools Alcool oxidase
pénicilline pénicillinase
 Biocapteurs
enzymatiques

les
transducteurs

• Electrochimique
potentiométrique, FET, ampérométrique,
conductimètrique,
impédimètrique

• Optique
UV/visible absorption, fluorescence,
Bioluminescence, SPR

• Thermique

• Systèmes
micromécaniques
 biocapteur à glucose
(glucomètre)
 Utilise la glucose oxydase (GOD ou GOx) immobilisée
 β D Glucose + O2 => Acide gluconique + H2O2
Glucose Gluconic acid

Glucose Oxidase
Working electrode
with immobilised enzyme
(or mediator) Oxygen Hydrogen Peroxide
2H+, 2e-

ELECTRODE

Reference5.4 mM (Ag/AgCl2)
electrode
 Applications de biocapteurs
Médicales
 Analytique
Agroalimentaires
 Caractérisation des produit agroalimentaires et contrôle des
processus de fabrication
Protection de l’environnement
 Contrôle les niveaux de pollutions et les pesticides.
Militaire et défense
Merci pour
votre
attention