TECHNIQUES
D’ANALYSES
BIOLOGIQUES
3eme Année LMD BBM
TRABSA H.
Définition
La spectrophotométrie est une
méthode analytique quantitative qui
consiste à mesurer l'absorbance ou la
densité optique d'une substance
chimique donnée en solution, et donc sa
concentration.
Plus cette substance est concentrée plus
elle absorbe la lumière.
Principe du
spectrophotomètre
La spectrophotométrie est très utilisée
dans les laboratoires pour identifier ou
doser des substances.
Les mesures sont réalisées dans:
l’UV(160nm<l<400nm)
le visible(400<l<800nm)
L’Infrarouge(l>800nm)
Couleurs Longueurs d’ondes
(l)
rouge ~ 625-740
orange ~ 590-625
jaune ~ 565-590
vert ~ 520-565
bleu ~ 446-520
violet ~ 380-446
Spectre d’absorption
Si on place une solution contenant une
substance dissoute dans un solvant,
dans un spectrophotomètre, et on
mesure l’absorbance a différente
longueurs d’onde , on va obtenir un
graphique des pics à des longueurs
d’onde définies.
Le maximum d’absorbance
corresponds a (l max)
l max c’est la longueur d’onde
l max de la radiation qui provoque la
transition électronique d’un
orbite fondamentale vers un
autre orbite excité.
Absorbance
280
200 400 600 800
Longueur d’onde
l(nm)
L’absorbance dans l’UV ou
Vis
L’absorption d’un rayonnement
ultraviolet ou visible correspond a une
interaction des photons avec les
électrons des couches externes des
atomes ou des molécules.
La position du maximum d’absorption
correspond à la longueur d’onde de la
radiation qui provoque la transition
électronique
Le passage d’un électron d'une orbitale d'énergie E1 à une orbitale
d'énergie E2 plus élevée.
On dit qu’on passe dans un « état excité »
La loi d’absorbance
Un faisceau lumineux monochromatique (une
longueur d’onde fixe) de longueur l et
intensité I0 traverse une cuve à base carrée
contenant une solution d’une substance de
concentration C, à une distance
L(L=longueur de la cuve).
La loi d’absorbance
I0 I
Détecteur Enregistreur
Lumière Lumière (Afficheur)
incidente transmise
Source
lumineu monochromateur L= 1cm
se
(lampe) Cuve
(solution
a
analyser)
On définit :
La transmittance (T): qui est le
pourcentage de transmission T%=I/I0.100
Absorbance (A) ou densité optique
(DO) qui représente la valeur du
logarithme décimale de l’inverse de T:
A=log(1/T) = e . L .C
l
La loi de Beer Lambert
Al = el. L .C
Al= l’absorbance a une longueur l
el= coefficient d’absorption molaire (M-1cm-1)
L= trajet optique (cm)
C= concentration de la solution (M)
NB: l’absorbance n’a pas d’unité
La loi de Beer Lambert
d'après Beer Lambert, l'absorbance Aλ
est fonction de la concentration C de la
solution, du coefficient d'absorption
molaire et de la longueur de solution à
traverser L
Relation absorbance concentration
Loi de Beer-Lambert
Al = el. L .C = l’absorbance est en fonction de la
concentration (droite linéaire)
Al
[C]
Condition de validité de la
loi de Beer Lambert
Cette loi n’est pas valable que dans
certaines conditions:
1. le monochromatisme (une seule
longueur d’onde l )max
2. Les faibles concentrations (diluées)
3. Température stable(e dépends de la
Température)
4. pH stable
5. Clarté du milieu
Le spectrophotomètre
Un spectrophotomètre UV-visible
est un appareil qui permet de mesurer
l'absorbance d'une solution homogène
à une longueur d'onde donnée ou sur
une région spectrale donnée.
Le spectrophotomètre comprend :
Les différents éléments d’un spectrophotomètre
Une source lumineuse
Décharge dans Solide chauffé
les gaz rares
Lampes à hydrogène ou ce sont des lampes utilisant un
deutérium , elle fournissent des filament tungstène, elle
radiations lumineuses dans le fournissent des radiations
domaine du UV lumineuses dans le domaine du
visible.
Le monochromateur
un monochromateur formé d'un réseau
diffractant la lumière de la source. Il
permet de sélectionner la longueur d'onde
de la lumière qui traversera la solution à
doser.
La fente d’entrée
une fente de largeur fixe ou variable
pour régler la bande passante.
Lumière incidente lumière passante
La cuve
une cuve transparente dans laquelle on
place la solution à étudier. Suivant la
qualité et la quantité d'échantillon, il
existe différentes cuves, généralement en
plastique ou en verre (spectre visible) ou
en quartz (UV).
La cellule photoélectrique
une cellule photoélectrique, permet la
transformation de l’énergie lumineuse en
énergie électrique, le courant produit est
très faible et sera amplifié ultérieurement
L’amplificateur
un détecteur électronique amplifie le
courant fourni par la cellule
photoélectrique.
L’enregistreur
Permet de mesurer le courant fourni par
l’amplificateur , il est généralement relié a
un microordinateur qui permet d’afficher
les résultats en pic (balayage de spectre)
ou des valeurs fixes des absorbances.
Principes des dosages
dosage directe dosage indirecte
Utilisation Utilisation
d’un d’une
réactif coloré gamme
d’étalonnage
Méthode de dosage directe
Si la substance a doser possède un
pic d’absorption caractéristique,
on mesure l’absorbance à lmax et on
calcule directement la concentration
par la loi de Beer Lambert(e doit être
connue)
Exp: dosage des protéine a une
longueur de 280nm
Méthode de dosage indirecte
Ces méthodes sont utilisées dans le
cas ou la substance à doser ne
possède pas un pic d’absorbance
caractéristique (lmax):
Utilisation d’un réactif coloré
Utilisation d’une gamme d’étalonnage
Utilisation d’un réactif
coloré
L’utilisation d’un colorant chimique qui en
réagissant avec la substance a doser
développe une coloration
Exp. Le pénicilline ne possède pas un pic
caractéristique, elle forme un produit
coloré avec le substrat nitrocéfine qui
absorbe a 486nm.
péniciline+ nitrocéfine produit coloré absorbe a 486nm
Méthode de dosage avec
gamme d’etalonnage
C1 C2 C3 C4 C5 C6
Solution a doser
(concentration inconnue) Ci
Absorbance
0.324
Voir l’absorbance de cette
solution. Exp. A=0.324
C1 C2 C3 Ci C4 C5 C6
Concentrations connues
NB: Le blanc ou témoin
La lecture au niveau du
spectrophotomètre est effectué contre
une solution qu’on appelle blanc, qui
contient tout les constituants du milieu
sauf la substance a doser(échantillon),
pour que l’absorbance soit pour la
substance a doser
Application de l’absorbance
Dosage des protéines
Dosage des enzyme(Activité
enzymatique)
FIN
