Université Abdelmalek Essaâdi
Ecole Normale Supérieure Tétouan
La PCR multiplex
Réalisée par :
ELKHALDI Aya Encadrée par :
ELHBOUSSI Nawal Mr : AOUAD Othmane
MAZIAN ILham
01 Introduction
02 Le principe de la
technique
03 Le mode opératoire
Les applications dans le domaine de
04 médecine , environnement et
agroalimentaire
05 Les avantages et les
recommandations
06 Conclusion
01 : Introduction
PCR est l’abréviation de l’expression
anglaise (polymerase chain reaction) , le
terme français équivalent (amplification
en chaîne par polymérisation ou ACP ,est
rarement utilisé )
La PCR est une technique de la biologie
moléculaire utilisée pour amplifier de
petits quantités d’ADN . La PCR a
révolutionné les domaines de la recherche
biomédicale, du diagnostic médical
PCR : HISTORIQUE
. 1983 : kary Mullis a
développer la PCR
. 1985 : première
publication de la
technologie PCR par la
Cetus Corporation
. 1993 : kary mullis ,
prix Nobel de chimie
pour avoir conçu la
technologie PCR kary Mullis
La PCR multiplex
Cette variante de la PCR s’intéresse à l’amplification
d’ADN de différents origines ( issus de plusieurs
échantillons) dans un seul et même tube . Sa réalisation
exige l’utilisation des amorces spécifiques .
Campylobacter spp
Campylobacter :Signifie le nom du genre
Spp : Signifie simplement plusieurs espèces au sien de ce
genre
Campylobacter spp se sont des bacilles a gram négatif , en forme de virgule
, de S
Très mobiles
Micro aérophiles
Genre pathogènes pour l’Homme
Campylobacter il provoque des maladies
diarrhéiques et systémiques et son parmi les
causes d’infections les plus répondue
Les infections a compylobacter chez les animaux
sauvages et domestiques qui sont égalements
les réservoirs naturels de ces microorganismes
On parle toujours du genre campylobacter mais il
existe plusieurs espèces à l’intérieur de ce genre les
plus fréquent :
Campylobacter. Coli Campylobacter. Lari
Campylobacter jejunu Campylobacter. Fetus Campylobacter. Upsaliensis
02 : Le principe de la technique
La PCR multiplexe permet d’amplifier simultanément plusieurs cibles
d’ADN dans une seule réaction en utilisant plusieurs couples d’amorces
spécifiques. Cela permet de détecter plusieurs séquences génétiques en
même temps .
La PCR (réaction en chaîne par polymérase) est une succession de cycles,
généralement entre 20 et 40
Chaque cycle de la PCR comprend trois étapes qui se déroulent à des
températures différentes
La dénaturation thermique à 95 °C
L’hybridation des amorces ( 56 et 65 °C )
l’extension des amorces (ou élongation) ( 72 °C )
Les éléments nécessaires pour le protocole
Les molécules d’ADN provenant de différentes
cellules sont extraits d’un échantillon de selles .
ADN polymérase (ex. Taq polymérase) : Une
enzyme qui catalyse l'extension des amorces
et la synthèse du brin d'ADN.
Nucleotides (dNTPs) : Mélange des quatre
bases nucléiques (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
nécessaires à la synthèse de l'ADN.
L’eau ultrapure est une eau particulièrement
purifiée, dont la pureté est supérieure à celle de
l’eau déminéralisée et distillée.
Prévention des contaminants
Précision : Garantit des concentrations exactes des
réactifs.
Les amorces (ou primers en anglais) sont des courtes séquences
d'ADN qui sont essentielles pour démarrer la réaction de la PCR.
Les amorces
01 02
Amorce sens (Forward Amorce antisens (Reverse
primer) : Elle est primer) : Elle est
complémentaire à la complémentaire au brin
séquence située sur le brin d'ADN dans la direction
d'ADN qui sera lu dans le opposée (3' vers 5').
sens 5' vers 3'
Les amorces de compylobacter SPP
Nom d’amorce Taille (Pb) Gêne Bactérie
CadF-F C. Jejuni &
400 CadF
CadF-R C. Coli
Asp-F
500 Asp C. Coli
Asp- R
HipO- F HipO
735 C jejuni
hipO-R
Le MgCl₂ : est essentiel pour la stabilisation
de la Taq polymérase.
Un tampon stabilise le pH de la solution et
protège les réactifs ainsi que l'ADN contre les
variations de conditions (température, pH)
pendant le cycle de la PCR.
Le thermocycleur est un appareil utilisé pour
réaliser les cycles de température nécessaires
à la réaction de la PCR . Il permet d'effectuer
les changements de température à des
moments précis, qui sont essentiels pour le
déroulement de la réaction.
Thermocycleur
03 : le mode
opératoire
Les molécules d'ADN matrices
Les amorces spécifiques pour
Campylobacter spp.
Les nucléotides
Taq polymérase
L'eau ultra-pure
Un tampon
MgCl₂
Les étapes de la technique de PCR multiplex
La dénaturation thermique à 95 °C L’hybridation des amorces ( 56 et 65 °C )
La dénaturation thermique à 95 °C consiste à Lors de l'hybridation, les amorces se lient
séparer les brins d'ADN en détruisant les spécifiquement aux séquences cibles de l'ADN,
liaisons hydrogène entre les bases. permettant ainsi l'amplification des régions
spécifiques en même temps.
Bactéries
La dénaturation
l'hybridation
Parasites
Virus
Parasites
l’extensiondes
L’hybridation (ouamorces
élongation)
( 56( et
7265
°C°C
) )
Lors de l’élongation, l’ADN polymérase allonge les nouveaux brins d’ADN en ajoutant
des nucléotides complémentaires aux brins matrices."
Les nucleotides
Taq polymérase Les nucleotides
Une fois l'étape d'amplification par
PCR terminée, il est nécessaire de
réaliser une électrophorèse afin de
visualiser vos résultats.L'amplification
a permis d'obtenir des fragments
d'ADN de taille déterminée. Ces
fragments vont être déposés sur un
gel d’agarose et migrer selon leur
taille et leur point isoélectrique.
La présence d’une bande à 500 pb
sur le gel d’électrophorèse
confirme la présence de
Campylobacter coli dans les
selles.
04 : Les applications dans le domaine de
médecine , environnement et
agroalimentaire
Dans le domaine de
médecine :
01 ) Diagnostic des infections 02 ) Détection des maladies génétiques
identification rapide Identification de plusieurs
et précise de mutations génétiques
multiples agents associées à une maladie
pathogènes (virus, héréditaire
bactéries,
champignons, Exemple : recherche de
parasites) dans un mutations dans les gènes
seul test responsables de la
mucoviscidose
Dans le domaine
environnementale
01 ) détection des polluants 02 ) Contrôle des sols et de l’agriculture
microbiens dans l’eau
Grâce à la pcr multiplex , on Les sols peuvent être
peut tester plusieurs agents contaminés par des bactéries
pathogènes ( comme pathogénes ou des microbes
Escherichia coli ou qui affectent la croissance des
salmonella ou campylobacter cultures. Grâce à la PCR
) en même temps dans une multiplex, on peut tester
seule analyse d’eau . Cela plusieurs microorganismes
permet de savoir rapidement dans les sols agricoles ou
si l’eau est potable ou non forestiers en une seule analyse
pour évoluer la santé des sols
et leur qualité
Dans le domaine agroalimentaire
01 ) Detection des pathogènes alimentaires
02 ) identification des espèces animales
et traçabilité
Les aliments peuvent être
contaminés par des bactéries, La PCR multiplex permet de
des virus, des champignons distinguer différentes espèces
qui peuvent nuire à la santé animales ( porc , mouton,
humaine. Avec la PCR poulet …) dans les produits
multiplex on peut détecter carnés, ce qui aide à lutter
plusieurs agents pathogènes contre la fraude alimentaire et
dans un même échantillon à assurer un étiquetage précis
alimentaire en une seule
analyse
05 : Les avantages et les
recommandations
Détection simultaneé de plusirurs espèces
Gain de temps ,gain de réactifs
Les avantages
Specificité élevée
Haute sensibilité
Methode rapide
Optimisation complexe
Interaction entre amorces
Les désavantages
Analyse plus difficile
Sensibilité variable
Les recommandations de la technique
Conception rigoureuse des amorces
Choisir des amorces spécifiques pour chaque espèce
(C.jejuni,coli..)Vérifier leur compatibilité (température de fusion
proche ,longeurs similaires )
Optimisation des conditions de PCR
Ajuster la températuretester différentes concentration en
MgCL2,amorces et ADN polymérase
Utilisation de contrôles
Inclure un témoin positif (ADN connu de chaque espèce ciblée )
Ajouter un témoin négatif (san ADN) pour vérifier l'absence de
contamination
Qualité de l'ADN extrait
L' ADN doit être pur et non dégradé
Éviter les inhibiteurs ( présents parfois dans les aliment )
06 : Conclusion
La PCR multiplexe est une méthode rapide, sensible et
spécifique pour détecter simultanément plusieurs espèces
de Campylobacter spp. Elle surpasse les méthodes
classiques en réduisant le temps d’analyse et en
augmentant la fiabilité. Cette technique est idéale pour la
surveillance microbiologique en milieu clinique et
agroalimentaire.
Les resources
https://www.qiagen.com/fr-fr/applications/digital-pcr/applications?
utm_source=perplexity
https://www.vantagemarketresearch.com/fr/industry-report/pcr-polymerase-chain-reaction-in-
agrofood-market-2331?utm_source=perplexity
https://youtu.be/RpZ2I-YYw-Y?
si=LzfQpyyA5noCHE2J
https://youtu.be/LrbHPx_unDo?
si=IeoteQvqz3RnLwLm
https://fac.umc.edu.dz/snv/faculte/BA/2019/cours
%202%20%20PCR.pdf
https://fac.umc.edu.dz/snv/faculte/BA/2019/cours
%202%20%20PCR.pdf
https://fr.slideshare.net/slideshow/pcr-polymerase-chain-reaction-en-temps-reel-pptx/
270294845
https://frontlinegenomics.com/what-is-multiplex-pcr/?utm_source=perplexity
https://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/faq/classchrono.htm?utm_source=perplexity
