Chapitre VII: Techniques de
Génie génétique appliquées aux
végétaux.
Le plasmide Ti
Technologie de l’ADN recombinant permet
• De modifier le génome presque à volonté.
• L’amélioration n’est plus limitée à la sélection de variant au sein d’une espèce
par la génétique classique.
• Il est alors possible d’introduire dans le génome d’une plante de l’ADN
provenant d’autres espèces végétales, d’animaux ou même de bactéries.
Le plasmide Ti constitue l’exemple classique pour
les études des plantes transgéniques.
Définition et action du plasmide Ti dans la nature :
• Le plasmide Ti (Tumor Inducing) dérive d’une bactérie du sol appelée Agrobacterium tumefaciens.
• Cette bactérie provoque chez les plantes qu’elle infecte une maladie du nom de « gale » du collet.
• Les plantes infectées présentent des lésions constituées de cellules dont la croissance est incontrôlée
(des tumeurs ou gales), généralement localisées à la base (ou collet) de la plante.
• La production de la tumeur est déterminée par un grand plasmide circulaire de 200 kb présent dans
la bactérie, le plasmide Ti.
• Lorsque le plasmide Ti est inséré dans l’ADN chromosomique de la plante, une partie de son ADN
appelé « ADN-T » inséré dirige alors la synthèse d’hormones végétales qui perturbent la régulation
de la croissance des cellules infectées de la plante .
• Ce qui donne lieu à la formation d’une tumeur, ainsi que la synthèse de nopaline qui peut être utilisée
comme source de carbone et d’azote par la bactérie (symbiose).
• Lors de l’infection, la partie du plasmide, appelée « ADN-T », est transférée dans la plante et insérée
au hasard dans le génome cellulaire.
• La séquence ADN-T contient:
– Des gènes qui codent pour des hormones de croissance végétales: tumorisation des cellules.
– Des gènes qui codent pour des enzymes qui conduisent les cellules tumorales: synthétise des
substances appelées opines (nopaline et octopine).
• Les gènes qui contrôlent la synthèse des hormones et des opines (nos, ocs) : exprimés dans la plante à
partir de séquences régulatrices eucaryotes.
• Par contre, ceux qui contrôlent la synthèse des enzymes de dégradation des opines (noc, ocs): se
trouvent dans la bactérie sous le contrôle de séquences régulatrices procaryotiques.
Processus d’Infection
Infection par l’agrobacterium
tumefaciens.
Utilisation du plasmide Ti comme vecteur en génie génétique.
• Tout fragment d’ADN cloné au sein de l’ADN-T peut s’insérer dans le génome de la plante qui le reçoit.
• Le plasmide Ti est très grand pour les manipulations: donc construire des dérivés plus petits avec l’essentiel de
l’ADN-T et l’ADN d’intérêt.
Un vecteur intermédiaire qui contient
• Deux segments d’ADN-T qui portent les fragments L et R de la nopaline,
• Un marqueur de sélection bactérien de résistance à la spectinomycine (spcR).
• Un marqueur de sélection bactérien de résistance à la kanamycine (kanR).
Ce Vi posséder des sites de restriction pour l’étude de l’ADN cloné.
Construire un vecteur Ti désarmé:
• On retire toute la région droite de l’ADN-T, y compris les gènes inducteurs de tumeurrs: aspect gênant
de l’ADN-T.
• Ti désarmé conserve l’extrémité gauche (L) de l’ADN-T qui servira de site de recombinaison pour
l’intégration du Vi.
Les bactéries qui contiennent le plasmide co-intégrat peuvent être utilisées
Si l’infection par la bactérie réussit, son ADN-T sera transféré aux cellules végétales et tout l’ADN localisé entre
les extrémités droite et gauche de l’ADN-T s’intégrera dans un chromosome de la plante.
• Placer les disques de feuilles sur un milieu nutritif (kanamycine +): les cellules ADN-T + se multiplient.
• La croissance donne une formation d’un petit amas qui constitue la preuve que les cellules ont été
transformées.
• Ces cals peuvent donner des radicelles et fournir par la suite, des plantes transgéniques.
Expression de l’ADN intégré.
Expression de l’ADN intégré en même temps que l’ADN-T?
• Il peut s’agir de n’importe quel ADN dont on veut tester l’expression dans la plante prise comme hôte.
• Dans tous les cas, il faut utiliser un gène d’expression « gène indicateur » dans le vecteur pour suivre la
manifestation de l’ADN intégré.
Un certain nombre de ces gènes indicateurs sont utilisés actuellement avec succès :
• L’enzyme luciférase catalyse la réaction luciférine avec ATP: émission de lumière.
• Une plante de tabac transgénique qui exprime le gène de la luciférase s’illumine dans l’obscurité
• Le gène de la luciférase peut être utilisé comme indicateur: étudier la régulation de l’expression de l’un
ou l’autre gène de la plante ou de l’ADN intégré.
Le Terminator
Correspond un brevet détenu par la compagnie Monsanto, désigne une technique consistant à introduire un
transgène, un gène exogène tueur qui empêche le développement du germe du grain récolté.
• La plante se développe dans les conditions habituelles, donne une récolte normale, mais elle produit un
grain biologiquement stérile.
• La technologie fonctionne avec trois gènes et un inducteur chimique:
- Le gène I est un répresseur
- qui code pour une protéine régulatrice qui se fixe sur un site opérateur en amont des gènes de
structure et inhibe leur transcription.
- La protéine régulatrice du gène I se fixe sur le « binding site » du gène II
- Le gène II de l’enzyme recombinase est placé sous le contrôle d’un promoteur.
• Entre le Promoteur et le gène de la recombinase se trouve le « binding site ».
• Le gène II produit une enzyme de restriction qui coupe et excise l’ADN « blocker » du gène III.
- Le gène III
- Produit une toxine qui est létale pour l’embryon.
- Ce gène est sous le contrôle d’un promoteur tardif qui est activé seulement durant le développement
de la graine, lors de la croissance de l’embryon.
- Entre le promoteur tardif et le gène III se trouve l’ADN « blocker » qui favorise, s’il est excisé, la
transcription et l’expression du gène toxine, produisant la toxine qui tue l’embryon rendant ainsi stérile
les nouvelles semences pour la reproduction.
• L’inducteur chimique est répandu sur les semis par les compagnies de
semences comme Monsanto et Syngeta afin d’activer le gènes II et le gène
III.
• Une fois ces gènes activés dans ces semences, nous pouvons avoir la
production mais pas le reproduction.
Processus d’activation du Terminator
1 – Introduction de l’inducteur (par exemple
du tétracycline) dans les semences.
2 – L’inducteur bloque le « binding site » au
niveau du gène II et empêche le répresseur de
se lier.
3 – L’ARN polymérase se lie au promoteur et
entame la transcription du gène de la
recombinase (isomérase) en ARN à synthèse
de l’enzyme recombinase.
4 – La recombinase taille et excise la séquence
« blocker ».
5 – L’ARN polymérase se lie au « late
promoteur » et transcrit le gène de la toxine, à
synthèse de la toxine qui tue les embryons des
graines avant les récoltes.
En absence d’inducteur
En absence de l’inducteur, le gène codant
pour la recombinase ne transcrit pas.
Application des techniques du génie génétique à l’agriculture.
• La problématique des OGM est que le gène TERMINATOR inséré, à travers les techniques du génie
génétique, dans le génome
• de ces végétaux fait que leurs graines ont seulement une capacité de production et
• non de reproduction.
• L’agriculteur doit toujours dépendre de ces maisons de fabrication des semences qui ont le brevet. Nous
en donnons quelques exemples qui fonctionnent déjà dans ce siècle.
1. Le tabac transgénique qui exprime l’enzyme luciférase :
2. Le maïs transgénique
Chaque année les agriculteurs du monde entier perdent 1/10 de leurs récoltes de maïs à cause des insectes
nuisibles. Le maïs transgénique contient dans son génome un gène qui code pour une protéine que détestent
les insectes et qui en principe ne doit pas causer de nuisances à l’homme. Cette variété augmente donc le
rendement en éliminant le facteur insecte.
3. Les tomates « flavrsavr »
Ces tomates transgéniques contiennent un gène freinant le mûrissement du fruit, ce qui leur confère une
meilleure résistance au transport et une longue conservation.
4. La protection des plantes contre l’infection virale
Le virus de la mosaïque du tabac (TMV) infecte les plants de tabac. Une plante transgénique qui exprime
la protéine du manteau (coat
Protein : CP) du TMV résiste aux infections par ce virus.
5. Lutte contre les insectes ravageurs
Chaque année des milliards de dollars de récoltes sont perdues à cause des insectes. Les armes les plus
utilisées pour lutter contre les insectes sont « les insecticides et les pesticides » qui posent actuellement de
graves problèmes de pollution à l’environnement.
6. Eradication des mauvaises herbes et plantes transgéniques tolérantes aux herbicides.
