TP n° 2
Méthodes d’étude en cytologie
II – la microscopie électronique
Document 1
Globule rouge: Hématie
Globule blanc: Monocyte
Observation d’un frottis sanguin au microscope photonique mettant en évidence
un monocyte, technique histologique. Gx 400
Document 2
Observation de l’ultra-structure d’un monocyte au MET, technique cytologique.
Gx 20 000
Commentaires
• il y a plus de détails dans le doc.2 par rapport au
doc.1.
• le doc.1 permet d’avoir une vue générale du tissu
• le doc.2 présente une vue de détail de la cellule.
Conclusion
Microscope photonique => Observations histologiques.
Microscope électronique => Observations Cytologiques.
Le document 1 => une photographie
Le document 2 => une microphotographie
Comment l’obtient-on ?
Description du Microscope Electronique à Transmission
Un microscope électronique en transmission est
composé des principaux éléments suivants :
- Un canon à électrons, qui fournit le faisceau
électronique ;
- Des lentilles magnétiques ;
- Un système de détecteurs d'électrons.
Principe de fonctionnement du Microscope Electronique à Transmission
1. Le canon à électrons:
Les électrons sont produits par une cathode chaude à effet thermoionique, lors du
chauffage d'un filament de tungstène à ~2700K.
Les électrons sont accélérés par la forte tension d'une anode positive (jusqu'à 300 kV)
Principe de fonctionnement du Microscope Electronique à Transmission
2. Les lentilles magnétiques:
- Les lentilles 1 et 2:
Les électrons sont concentrés en un faisceau
d'électrons par le condenseur qui est une lentille
électromagnétique
- Un jeu de lentilles: en aval de l'échantillon,
forme l'image agrandie de l'objet.
- La lentille objectif: la plus proche de l’échantillon;
Dans le plan focal de la lentille objectif, se forme la
figure de diffraction, représentant les
caractéristiques géométriques de l’objet et
notamment sa périodicité.
L'image détectée est dirigée vers un ordinateur.
Principe de fonctionnement du Microscope Electronique à Transmission
L’échantillon coupé et fixé (technique cytologique) est déposé sur une grille en cuivre
recouverte d’une membrane de collodion perméable aux électrons et est monté sur
la platine porte objet du microscope pour l’observation.
Grilles en cuivre de Coupes sur grille
différent maillage
Taille de la grille
La Technique Cytologique
(Technique des coupes minces)
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
Le but:
Observation de cellules ou portion de cellules au microscope électronique à
transmission.
Le principe
Il repose sur l’obtention, à partir d’un échantillon parfaitement conservé, des
coupes ultra-fines transparentes aux électrons, et suffisamment contrasté.
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
Les étapes
1. Le prélèvement et fixation.
A. Le prélèvement.
Il peut se faire aussi bien chez un organisme animal ou végétal. Quand il s’agit d’un animal, il
peut être pratiqué sur un animal maintenu en vie (biopsie) ou sacrifié (tué). Dans ce dernier
cas la démarche méthodologique consiste à:
Anesthésier l’animal
Dissection
Prélèvement d’une partie de l’organe à étudier.
Anesthésie D i s s e c ti o n Échantillon prélevé
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
B. La fixation.
Le but de la fixation est de conserver les structures cellulaires, après prélèvement, dans un état
aussi proche que possible de leur état vivant.
Cette fixation se fait à l’aide de fixateurs physique ou chimique.
FIXATEURS PHYSIQUES FIXATEURS CHIMIQUES
- Glutaraldéhyde
- Propane liquide (-196°) c’est le plus utilisé, il permet de fixer les
- Hélium liquide (- 272) protéines, les sucres et les acides
nucléiques
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
3. La post- fixation.
C’est une étape supplémentaire qui consiste à mettre l’échantillon dans du tétraoxyde
d’osmium. Ce produit permet de fixer les lipides.
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
4. La déshydratation.
C’est une étape qui permet de préparer l’inclusion avec une résine hydrophobe. C’est la raison
pour laquelle il est indispensable d’éliminer toute trace d’eau des cellules en les plongeant dans
des bains d’alcool à degrés croissants.
Notant que le dernier bain est l’oxyde de propylène qui constitue le solvant de la de résine
d’inclusion.
A l c o o l
30° 50° 70° 95° 1O0° 100°
Oxyde de
propylène
5. L’inclusion à la résine.
Cette étape consiste à remplacer le liquide intracellulaire aqueux, par de une résine hydrophobe
qui durcira l’échantillon et par conséquent facilitera la confection des coupes très fines
perméables aux électrons.
Capsule d’inclusion à la résine
Échantillon
Automate à inclus dans
inclusion. la capsule
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
6. Réalisation des coupes.
Cette étape permet l’obtention de coupes ultra minces ou ultra fines (50 à 70 nm d’épaisseur),
ces coupes sera réalisée à l’aide d’un instrument de coupes appelé Ultramicrotome. Les
coupes semi-fines sont réalisées à l’aide d’un couteau en verre et les coupes fines sont
réalisées à l’aide d’un couteau en diamant. Les coupes sont recueillies dans un bac d’eau.
Bloc de
résine
Bac d’eau
Couteau
en verre
Couteau en verre Couteau en diamant
ultramicrotome
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
7. Récupération des coupes et Etalement sur grille porte objet.
Une fois les coupes obtenues, elles seront recueillies sur une grille métallique (en cuivre) parfois
recouverte d’un film de collodion perméable aux électrons.
Grilles en cuivre de Coupes sur grille
différent maillage
Taille de la grille
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
8. Contraste (coloration!).
C’est une étape équivalente à celle de la coloration dans la technique histologique, elle permet
d’augmenter et d’améliorer le contraste des territoires cellulaires en leurs associant des sels de
métaux lourds tels que:
l’acétate d’uranyle.
le citrate de plomb.
L a T e c h n i q u e C y t o l o g i q u e
9. Observation.
Observation au microscope électronique à transmission, les images sélectionnées sont prises
en photos d’où le nom de micrographies.
Microscope Électronique à
Transmission
Quelques Micrographies obtenues à partir de
la technique des coupes minces.
Description du Microscope Electronique à Balayage
Principe de fonctionnement du Microscope Electronique à Balayage
Dans le canon à électrons, un filament de tungstène peut
être élevé à une haute tension comprise entre 1kV à 40kV,
L’échantillon n’est pas coupé (reste massif), il subit une
métallisation par pulvérisation d’une fine couche de métaux
lourds (or, platine…) pour former une réplique,
Les bobines déflectrices assurent la déviation périodique du
faisceau d’électrons primaires dans deux directions
perpendiculaires pour que ce spot électronique balaie la
surface de l’échantillon artificiel (la réplique),
Les électrons primaires ne traversent pas la réplique et par
conséquent seront réfléchis (réémis) en électrons
secondaires,
Les électrons secondaires sont captés par un détecteur
d’électron et l’image est formée sur un écran TV en 3D.
Contrairement au MET et au microscope photonique, l'image n’est
pas formée par une lentille objectif. L'image est formée de
manière séquentielle en balayant la surface de l'échantillon par
un faisceau d'électrons.
Le MEB fournit des images de la surface en relation avec le
mode de diffusion des électrons par l'échantillon.
Tableau comparatif entre MP, MET & MEB
Microscope photonique Microscope électronique à Microscope électronique à
transmission balayage
Source d’énergie Photons électrons électrons
Lentilles Lentille en verre Lentille électromagnétique Lentille électromagnétique
Support de l’échantillon Lame de verre Grille métallique Grille métallique
Grossissement De 40 à 2000 x De 2000 à 1 000 000 x De 1000 à 150 000 x
Pouvoir séparateur 200nm 0.2nm 20nm
Epaisseur des coupes Très mince ‹ 10 um Ultra-minces 500 à 700 A° Réplique
Trajet du faisceau de bas en haut de haut en bas de haut en bas
Contraste Colorants : vert, rouge, Contrastants : métaux Contraste d'ombrage et
bleu, etc… lourd ; OSO4 contraste d'inclinaison
Image Structure Ultrastructure Image en 3D
Confection des coupes Microtome Ultra-microtome Echantillon massif (n’est pas
coupé)
Observation Tissus vitaux ou mort Cellules mortes Cellules mortes
Technique de Technique histologique ou Technique cytologique = Technique de cryodécapage
préparation des échantillon vitale (T. coupes minces)
échantillons
Fixation Chimique (les alcools) Chimique (les aldéhydes) Physique (Azote liquide)
Inclusion Paraffine Résine
