Technologies de l’ADN
recombinants
PARTIE I : Création de bioréacteurs cellulaires pour
la production de protéines d’intérêts
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires
PROCARYOTES
PROCARYOTES
PARTIE Ib : Bioréacteurs cellulaires
EUCARYOTES
EUCARYOTES
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
II. Autres bactéries
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
bacille Gram<0
GRAM + GRAM -
Premier hôte utilisé pour la production de
protéines hétérologues
Hormone de croissance humaine, insuline,
interféron α et interleukine-2
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
a) Structure générale
ORF
Séquences
reconnues par [Link]
SMC Term
r
teu
Marqueurs sélections
o
om
Pr
Sous dépendance signaux
Vecteurs spécifiques de E. coli
d’expression
ORI
E. coli
Pas besoin de Vecteur Navette
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
b) Grande diversité de vecteur
Il faudra être capable d’analyser les différentes séquences
Repérer les différentes séquences
Définir leurs rôles
Savoir dans quels hôtes elles sont utilisables
Savoir pour quelles applications ils peuvent être utilisés
Bioréacteurs cellulaires / animaux transgéniques
Je repère
J’analyse
Rôles
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
Produire en grande quantité la protéine d’intérêt
Pallier les problèmes de toxicité de la protéine recombinante
DO
Inducteur
Promoteur
inductible
temps
Production de la biomasse
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
Induction IPTG Promoteur inductible plac
DO
IPTG Production de la biomasse
temps
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
RNA-
PROMOTEUR FORCE INDUCTEUR POLYMÉRAS
E
T7 Bactériophage
++++ -
(gènes tardifs bactériophage T7) T7
Lac (fragment UV5) IPTG
++ E. coli
(opéron lactose) (Lactose)
Ara + Arabinose E. coli
(opéron Arabinose)
Trp Absence de
++++ E. coli
(opéron Tryptophane) Tryptophane
TAC IPTG
+++ E. coli
(hydride Lac et Trp) (Lactose)
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
Amélioration des systèmes en effectuant des constructions
hybrides
Promoteurs inductibles Promoteurs forts
plac
Promoteur Trp
pAra
Promoteur T7
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
Le promoteur pTac
Opérateur
Hybride
Opérateur
Opérateur
Opérateur
Le promoteur pTac De boer et al., PNAS 1983
Ptac1
Test d’efficacité de Ptac I
Production HGH
Plac
Le promoteur pTac De boer et al., PNAS 1983
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
ATTENTIO
N !!!!
Utilisation de Promoteurs forts de gènes
tardifs du bactériophage T7
Non reconnus par la
machinerie d’E. coli
Utilisation de promoteur fort pT7 du bactériophage T7
Transcriptio
1 n par la
RNApol
d’[Link] Transcriptio
n par la
RNApol T7
[Link]
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
c) Avoir un promoteur fort et inductible
Apport gène codant RNA polymérase T7 : souche Bl21 (E. coli
modifiée)
Action trans
+
RNA pol T7
Promoteur T7 Gène d’intérêt
pLac RNA pol T7
ADN plasmidique
ADN
génomique BL21
Comment rendre le système inductible?
c) Des promoteurs forts et
inductibles
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
d) Marqueurs de sélection chez E. coli
Basés sur l’existence de gènes de résistance aux antibiotiques
Gènes Enzymes /Mode d’action Sélection milieu
km Aminoglycoside phosphotransférase Kanamycine
Amp b-lactamase Ampicilline
Tet Protéine impliquée dans l’efflux Tétracycline
(Chlo) Chloramphénicol Acétyltransférase(CAT) Choramphénicol
CAT
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
e) Avoir des systèmes qui facilite le clonage
Aujourd’hui : technologies qui améliore l’efficacité de clonage
Clonage : Nouvelles technologies
- sans ligase
- Utilisant
des recombinases Des toposimérases
GATEWAYTM TOPOTM cloning
« Passerelle »
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
1) Caractéristique des vecteurs d’expression chez [Link]
2) Avantage et inconvénient de [Link]
Avantages
Modification simple du génome
Large diversité souches et vecteurs
Expression rapide - temps génération court
Culture facile
Peu coûteux
Production en masse - fermenteur
Grande production : 20 - 175 g/L
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
2) Avantage et inconvénient de [Link] (bacille Gram<0)
Inconvénients
1. Peu de modifications co- ou post traductionnelles
a. Difficultés pour faire des ponts disulfures :
- Protéines ponts disulfures difficiles à exprimer
b. Pas de glycosylation
2. Protéine hétérologue peut être toxique
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
Inconvénients
3. Dégradation protéolytique (protéases)
Protéines recombinantes perçues comme :
- Différentes
- Anormales
Exposées à la destruction
Protéolyse : limitation source carbone et acides
aminés
- Fermentation grande échelle, haute densité
- Manque C et O2
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
Inconvénients
4. Surproduction – un frein à la production
a. Production d’acétate : toxique
b. Formation de Corps d’inclusions
(protéine non fonctionnelles)
c. Protéines tronquées : dégradations
4. Surproduction – un frein à la production
Composés toxiques Surproduction c. Protéines tronquées
Mauvais Usage
a. Acétate codon
b. Corps d’inclusion
Mauvais
repliements
Protéine inactive
4. Surproduction – un frein à la production
a.a. Production d’acétate : toxique
Phospho- Acétate
Transacétylase Kinase
Acétate
toxiqu
e
Production Acétate :
En condition d’oxygène limitée
En condition aérobie avec forte
concentration en glucose
b.a. Repliements chez E. coli et agrégats
Processus de repliement
Processus réversibles
Lilie et al. (1998) Curr. Opin. Biotech
the trigger factor, DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL and GroES
Proteases (lon, ClpP and others) Polypeptides
Degradation deposited
as insoluble inclusion bodies
DnaK, ClpB and IbpA,B.
Soluble aggregates
2
De novo
1 protein
synthesis
Folding intermediatesNative or quasi-native species
Misfolded species Degradation
Proteases (lon, ClpP and others)
Gasser et al. Microbial Cell Factories 2008 7:11 doi:10.1186/1475-2859-7-11
c.a. Protéines tronquées
USAGE CODON
DIFFÉRENT
c.a. Protéines tronquées
USAGE CODON
DIFFÉRENT
[Link]
5- Endotoxines
LPS (Lipopolysaccharide - Bactérie GRAM -)
EFFET PYROGÈNE
Réduit utilisation en pharmaceutique des protéines recombinantes produits
chez E. coli : nécessite purification supplémentaire
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
3) Pistes pour pallier certains inconvénients
1. Inconvénients liés aux peu de modifications co-
ou post traductionnelles
a. Difficultés pour faire des ponts disulfures :
- Utilisation de mutant E. coli facilitant la
formation de ponts disulfures (mutant trx B)
b. Pas de glycosylation
- Utilisation autres hôtes
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
3) Pistes pour pallier certains inconvénients
2. Protéines hétérologues toxiques
Utilisation promoteur inductible
Faire une protéine de fusion
3. Améliorer la solubilisation / éviter les agrégats
Faire des protéines de fusion
Meilleure solubilisation
Reconnaissance par l’hôte
Utilisation des TAG solubilisation
- GFP, Thioredoxin, MBP, GST
- Trx Thioredoxine Séquence
de clivage
Gène d’intérêt
La nécessité de faire une protéine de fusion , le
choix ne sont pas simples
Différents facteurs interviennent
HaloTag Technology
Protéines de fusion - Haloalcane deshalogénase (mutée)
Protéines de fusion
PodD ou Crr
Protéines à
tendance à
l’agrégation
FractionFraction
insoluble
soluble
3) Pistes pour pallier certains inconvénients
4. Dégradation protéolytique (protéases)
Utilisation de Mutant d’E. coli
Souches protéase -
Ex) souche Bl21-protéase Ion et
OmpT déficientes
3) Pistes pour pallier certains inconvénients
5. Défaut de synthèse de la protéine recombinante
Lien avec l’usage codon
Modifier la séquence (ORF) en la « Procaryotisant »
Adapter l’hôte en l’« Eucaryotisant »
Adapter l’hôte en l’« Eucaryotisant »
Utilisation des codons rares (ARNt)
Fréquence d’utilisation des codons et
Protéases
ARg/
Ileu/Leu
ARg/Pro
Améliorations : Souches bactériennes
6. Surproduction – un frein à la production
Composés toxiques
a.a. Production d’acétate : toxique
Acétate
Techniques consistants à diminuer la croissance bactérienne
Diminuer la croissance
Diminution température
Diminuer l’apport de substrat phosphorylé,
source d’énergie
Composés toxiques
Diminuer la production d’acétate Acétate
Une stratégie intéressante basée sur diminution
transport/phosphorylation GLUCOSE
Système PEP-PhosphoTransferase Sytem (PTS)
Opéron : pts H- pst I - crr
Transport d’ose
O2 faible
ACETATE PTS EIIgluc = Crr
production
Wong et al., 2007
Composés toxiques
Diminuer la production d’acétate Acétate
Mutant diminution transport GLUCOSE
Mutant E. coli DpstH1-TC110
Entrée par non PTS
système
Diffusion passive
GalP
Mutation transporteurpar un
complémentée
DptsH1 gène codant un système de
transport passif : gène glf
Wong et al., 2007
Diminution l’entrée de glucose d’environ 25%
Composés toxiques
Diminuer la production d’acétate Acétate
Mutant E. coli DpstH1-TCI10
GFPGreen Fluorescent Protein
GJT001
TC110
DptsH1
Wong et al., 2007
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
Surproduction
Corps d’inclusion
Mauvais
repliements
E. coli peut produire jusqu’à 10 à 30% de ces protéines cellulaires
Problèmes : Mauvais repliements
Manque de protéines chaperones eucaryotes
Spécialisées dans modifications post-traductionnelle
Spécialisées dans la localisation sub-celulaire
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
Diminuer les corps
d’inclusion
Protéines de fusion
Sur-expression protéines Chaperones
Diminuer le taux de production
Diminution température
« Refolding » in
vitro
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
« Refolding » in Objectif : Production Protéines actives
vitro
1. Extraire corps d’inclusion – Isoler les corps d’inclusion
Casser les cellules : homogénéiseur - lyzosyme
Centrifugation
Lavages –
Agents chaotropiques Détergeants
Se dit d'un agent qui détruit les Tension actif
liaisons hydrogène dans les
Urée biologiques et détruit
molécules triton
structure tridimensionnelle
Chlorure de Guanidium Désoxycholate
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
« Refolding » in Objectif : Production Protéines actives
vitro
2. Solubiliser les agrégats avec détergeant
Ponts disulfures détruits par des agents réducteurs
Tampon dénaturant
20 mM DTT
B-mercaptoéyhanol
Clivage des ponts disulfures
Conditions adaptées à chaque protéine
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
3. « Refolding »
Elimination détergents
Dialyse Formation des ponts disulfures
Elimination agents réducteurs
Se fait sur de faible concentration : 10-100mg/ml
Conditions adaptées à chaque protéine
Oxydation
Par l’air
Système
Ré-Oxydation
Glutathion
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
« Refolding » in
vitro
6. Surproduction – un frein à la production
b. Corps d’inclusion
« Refolding » in
vitro
« Refolding » in
vitro Corps d’inclusion
Micelles avec protéine chaperone GroEL
7- Endotoxines
Les endotoxines : toxines situées dans la membrane
externe de certaines bactéries Gram négatif
de nature LipoPolySaccharidique (LPS)
Thermostables
Effet pyrogène
Réduit l’utilisation en pharmaceutique, de protéines
recombinantes produites chez E. coli
Nécessite purifications supplémentaires
Solution : Exprimer la protéine recombinante
chez une bactérie GRAM +
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
I. Escherichia coli
4) Etapes de production de la protéine recombinante
Choix du
couple
Vecteur
Clonage Expression Extraction Purification PROTÉINE
ORGANISME d’expression
([Link]) D’INTÉRÊT
D’INTÉRÊT /Hôte
Sélection Essais pilotes
(antibiotique) Fermenteur ou Essais pilotes Précipitation, taille
Réacteur etc…
Amplification Sonication, Lyse
Vérification du
des cellules Induction douce, récolte du Colonnes d’affinité
clone
sous pression (inducteur, pH, milieu, etc… Ni, Ab, etc…
de sélection Température
Amplification
du vecteur en etc…) Vérification (WB, Vérification (WB,
bactérie ELISA, etc… ELISA, etc…)
Vérification (WB)
Quelques problèmes et solutions pour production protéines hétérologues chez
[Link]
Terpe, Appl Microbiol Biotechnol 2006
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
II. Autres bactéries
Bactérie Gram positive
Bacillus
Avantages majeurs
Forte sécrétion – pas de corps d’inclusion
Bacille GRAM + : pas de LPS ; pas d’endotoxine
Un usage codon légèrement différent d’E. coli
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
II. Autres bactéries
Bactérie Gram positive
Bacillus
Avantages majeurs
Un usage codon légèrement différent
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
Bactérie Gram
positive
II. Autres bactéries
Bacillus
Inconvénients majeurs
Production de protéases extracellulaires
Noms Gènes Types
Subtilisine * aprE Protéine à sérine alcaline majeure
Protéase neutre * nprE Métalloprotéase majeure, contient du Zn
Protéase à sérine mineure epr Inhibée par *PMSF et EDTA
Bacillo peptidase F bfp Autre protéase/esterase à sérine mineure
Minor metalloesterase mpe exoprotéase
ISP-I isp-I Majeure intracell serine protéase (nécessite Ca)
ISP-II ispII Mineur intracelulaire serine protéase
*PMSF : Phénylmethanesulfonyl fluoride
* : Réprésentent 96-98% de l’activité protéase extracellulaire
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
Bactérie Gram
positive
II. Autres bactéries
Bacillus
Inconvénients majeurs
Production de protéases extracellulaires
Pour pallier le problème :
Souches délétées de 6 gènes : activité protéase de 0,32%
Culture en présence de PMSF
Utilisation de B. brevis moins de protéases
PMSF : Phénylmethanesulfonyl fluoride
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes Bactérie Gram
positive
II. Autres bactéries
Avantages Forte sécrétion
Pas d’endotoxines
Pas de corps d’inclusion
Caractéristique de croissance supérieure
Métabolisme robuste
Facile de manipulation
Bacillus Génétique bien caractérisée Génome modifiable
Production en masse - fermenteur
Rendement et coût correct
Production : 3 g/L
Reconnu inoffensif par US FDA
Inconvénients
Présences de protéases extracellulaires
Pas de glycosylation
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
II. Autres bactéries
Ralstonia eutropha – bactérie Gram négative
Moins de corps d’inclusion qu’[Link]
Production organophosphohydrolase
Production <100mg/L chez E. coli
Production autour de 10g/L chez R. eutropha
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
II. Autres bactéries
Pseudomonas fluorescens – bactérie Gram négative
Produit 4g/L TNF-alpa trimérique
Staphylococcus carnosus – bactérie Gram positive
Produit 2g/L d’une protéine de mammifère sécrétées
Produite seulement à 0,2g/L par Streptomyces lividans
PARTIE Ia : Bioréacteurs cellulaires PROCARYOTES pour
la production de protéines recombinantes
III. Conclusion
Sans cesse améliorer les systèmes d’expression
Sans cesse élaborer des systèmes facilitant :
la mise en évidence de protéine hétérologue
la purification
Sans cesse résoudre les problèmes engendrés par la surproduction
Il n’y a pas de solution miracle
La solution doit être adaptée à chaque protéine
Si
glycosylation
nécessaire :
changer d’hôte
EUCARYOTES
pour une
glycosylation
adaptée
