Iso 21527 et Iso 6611 :
Dénombrement des levures et
moisissures (lait , produit laitiers )
Réaliser par :
EL FARISSI Latifa
EL FARSAOUI Mohamed
Introduction et définitions des
termes
Domaines d’application
Préparation Milieux de
culture
Matériels et Méthode d’échantillonnage
utilisée
Partie d'essai : suspension, Inoculation & incubation et
Comptage des colonies
Expression des
résultats
Conclusion
Introduction
Définition :
ISO 21527- ISO 6611|IDF
1:2008 94:2004
ISO 21527-
spécifie une méthode 2:2008 spécifie une méthode de
horizontale de dénombrement des unités formant
dénombrement des colonie (UFC) de levures et/ou
levures et des moisissures dans le lait et les
spécifie une méthode produits laitiers par la technique de
moisissures dans les
horizontale de comptage des colonies à 25 °C.
produits destinés à la
dénombrement des
consommation humaine
levures osmophiles et
ou à l'alimentation des
des moisissures
animaux
xérophiles
Moisissures levures colonies
micro-organisme aérobie, mésophile micro-organisme aérobie, groupe d'organismes individuels
filamenteux qui, à la surface d'un milieu mésophile, se développe à la appartenant à la même espèce, vivant
gélosé et dans les conditions décrites surface du milieu en formant rassemblés selon un mode de vie
dans la présente partie de l'ISO 21527, des colonies présentant le particulier
présentant souvent des fructifications plus souvent un contour
colorées et des formes de sporulation régulier et une surface plus
ou moins convexe
propagule/germe
entité viable, capable de se développer
dans un milieu nutritif
Références normatives : 6611-2004
ISO 8261:2001 Lait et produits
ISO 6887:2017 Microbiologie des laitiers — Lignes directrices générales
aliments — Préparation des échantillons, de pour la préparation des échantillons pour
la suspension mère et des dilutions décimales essai, de la suspension mère et des
en vue de l'examen microbiologique dilutions décimales en vue de l'examen
microbiologique
ISO 7218:2007 Microbiologie des
aliments — Exigences générales et
recommandations
Références normatives :21527-2008
ISO/TS 11133 (toutes les parties), Microbiologie des
aliments — Guide pour la préparation et la production
des milieux de culture
ISO 21527-1, Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour le dénombrement des levures et
moisissures — Partie 1: Technique par comptage des
colonies dans les produits à activité d'eau supérieure
à 0,95
Domaines d’application
ISO 21527 -
ISO 6611|IDF 94:2004 1 :2008
Lait, produits laitiers liquides, lait sec, [œufs, viande, produits laitiers (excepté
babeurre séché, lactose, fromage, beurre, le lait en poudre), fruits, légumes, pâtes
produits laitiers congelés (y compris les fraîches
glaces comestibles), crème pâtissière,
desserts, lait fermenté et crème.
ISO 21527 -
2 :2008
fruits secs, gâteaux, confitures, viande
séchée, poisson salé, grains, céréales et
produits à base de céréales, farines, noix,
épices et condiments,
Milieux de culture (ISO 6611) :
Milieu à l'extrait de levure, dextrose, Oxytétracycline et agar-agar :
Composants Préparation
Refroidir le milieu basique stérilisé à 45 °
Solution d'hydrochlorure
d'oxytétracycline 10 ml C. Juste avant l'utilisation, apporter le
chlorhydrate d'oxytétracycline
Milieu de base 90 ml Ajouter 10 ml de cette solution de manière
aseptique à 90 ml du milieu basique
Solution d'hydrochlorure
Milieu de base d'oxytétracycline
Composants : Composants :
Extrait de levure en poudre 5,0 g Chlorhydrate d'oxytétracycline (C22H30O11 ⋅HCl) 50
Glucose (C6H12O6) 20,0 g mg
Eau 50 ml
Eau 900 ml
Préparation
Préparation
Dissoudre les composants du milieu de base ou du Dissoudre le chlorhydrate d'oxytétracycline dans l'eau.
milieu déshydraté en chauffant, si nécessaire. La solution doit être fraîchement préparée avant
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après utilisation.
stérilisation, il soit de 6,6 à 25 °C. Stériliser la solution au moyen de la filtration.
Stériliser à l'autoclave (6.1) à 121 °C ± 1 °C
pendant 15 min
Milieu à l’extrait de levure / dextrose / chloramphénicol / Agar :
Composants Préparation
Dissoudre les composants dans l'eau en
Extrait de levure 5,0 g
Glucose (C6H12O6) 20,0 g chauffant, si nécessaire.
Chloramphénicol (C11H12Cl2N2O5) 0,1 ga Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après
Agar-agar 12 g à 15 g b
Eau 1 000 ml stérilisation, il soit de 6,6 à 25 °C.
Répartir le milieu gélosé dans des récipients
de capacité appropriée (6.8).
Stériliser à l'autoclave (6.1) à 121 °C ± 1 °C
pendant 15 min.
Milieux de culture (ISO 21527)
Milieu à l'extrait de levure, dextrose, oxytétracycline et agar-agar :
Composition :
Digestat enzymatique de caséine 5,0 g Dichloran (2,6-dichloro-4-
0,002 g
nitro-aniline)
D-Glucose (C6H12O6) 10,0 g
Glycérol anhydre 220 g
Phosphate monopotassique
1,0 g Gélose 12 g à 15 g a
(KH2PO4)
Chloramphénicol 0,1 g
Sulfate de magnésium
0,5 g
(MgSO4,H2O) Eau, distillée ou déionisée 1 000 ml
Préparation
Mettre tous les ingrédients, excepté Ajouter 10 ml de solution à 1 % Refroidir immédiatement le milieu
le chloramphénicol, en suspension (concentration en masse) dans dans un bain-marie (6.3) maintenu
dans l'eau et porter à ébullition pour l'éthanol de chloramphénicol et à une température comprise entre
dissoudre complètement. Si mélanger. Répartir le milieu dans 44 °C et 47 °C. Refroidir à une
nécessaire, ajuster le pH (6.4), de des récipients appropriés (6.5). température inférieure à 50 °C et
sorte qu'après stérilisation, il soit de Stériliser à l'autoclave à 121 °C répartir par portions de 15 ml dans
5,6 ± 0,2 à 25 °C. pendant 15 min. des boîtes de Petri stériles (6.6).
ATTENTION — Éviter
l'exposition du milieu à la Utiliser immédiatement ou Laisser le milieu se solidifier et
lumière, car les produits de conserver dans l'obscurité, sécher, si nécessaire, la surface
décomposition cytotoxiques conformément à l'ISO/TS 11133 des boîtes, comme décrit dans l'ISO
(toutes les parties), jusqu'au 7218 et l'ISO/TS 11133 (toutes les
peuvent causer la sous- moment voulu. parties).
évaluation de la mycoflore
dans les échantillons.
Addition facultative de chlorhydrate de chlortétracycline
● Lorsque la prolifération bactérienne peut représenter un problème (par exemple dans les
viandes crues), il est recommandé d'utiliser le chloramphénicol (50 mg/l) et la
chlortétracycline (50 mg/l)
préparer le milieu de base, comme décrit ci-
dessus, avec seulement 50 mg de
chloramphénicol, le répartir par quantités de
100 ml et stériliser.
Préparer également une solution avec 0,1 %
(concentration en masse) de chlorhydrate
de chlortétracycline dans de l'eau
(relativement instable en solution, elle doit La gentamicine est
être préparée extemporanément) et déconseillée, car elle peut
stériliser par filtration.
causer l'inhibition de
certaines espèces de
levures.
Juste avant l'utilisation, ajouter 5 ml de cette
solution de manière stérile à 100 ml du
milieu de base et verser dans les boîtes.
Addition facultative d'éléments trace
Identifier les
moisissures dans
ce milieu en
Pour que les
ajoutant la solution
moisissures
d'élément
présentent toute
trace suivante à 1
leur morphologie,
ml par litre de
notamment tous
milieu, avant
les pigments
passage à
qu'elles produisent
l'autoclave:
habituellement,
ZnSO4,7H2O
elles ont besoin
1g; CuSO4,5H2O
d'éléments trace
0,5 g; 100 ml
d'eau, distillée ou
déionisée.
Addition facultative de Tergitol
Afin d'éviter la prolifération de Mucoraceae
dans les boîtes de gélose, il est recommandé
d'ajouter du Tergitol (1 ml/l) au milieu de
culture.
Test de Test de sélectivité
• productivité
Incubation : 5 jours à 25°C ± 1 °C • Incubation: cinq jours à 25 °C
• Souches : ± 1 °C
(ISO-21527-1):
• Souches:
-Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763
- Candida albicans ATCC 10231 -Escherichia coli ATCC 25922 ou
-Mucor racemosus ATCC42647 -Bacillus subtilis ATCC 6633
(ISO-21527-2): Ou souches enregistrées comme
-Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 équivalentes dans d'autres
-Wallemia sebi ATCC 42694 collections de bactéries.
-Aspergillus restrictus ATCC 42693
• Méthode de contrôle:
-Eurotium rubrum ATCC 42690
Ou souches enregistrées comme équivalentes qualitative
dans d'autres collections fongiques. • Critères: inhibition totale
• Milieux de référence: milieux de culture
SDA («Sabouraud Dextrose Agar») déjà
validés.
• Méthode de contrôle: quantitative
• Critères: rapport de productivité, PR≥0,5
• Réaction caractéristique:
colonies/propagules/germes
caractéristiques selon chaque espèce
Matériel
Appareils pour la
Boîtes de Petri, de 90 mm à Microscope stérilisation en chaleur
100 mm de diamètre sèche (four) ou en chaleur
humide (autoclave).
Pipettes graduées Fioles Étuve, réglable à 25
°C ± 1 °C
pH-mètre à température
Tubes Loupe binoculaire compensée
Bain-marie, réglable
à 45 °C ± 1 °C
Bouteilles de culture
Appareil de comptage Incubateur, capable Etaleurs ou flacons
de colonies de fonctionner à 25
° C ± 1 °C
Méthode
Echantillonnage :
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon
réellement représentatif qui n'a pas été endommagé ou modifié
pendant le transport ou le stockage . endommagé ou modifié
pendant le transport ou le stockage
Échantillonnage en vue de l'examen microbiologique :
-Il convient de toujours prélever en premier les
a
échantillons destinés à l'examen microbiologique
d el en utilisant des techniques aseptiques, et, chaque
t r ai t 7 0 7 fois que cela est possible, à partir des mêmes
ex rme
no récipients de produit que ceux destinés à l'analyse
chimique et physique et à l'examen sensoriel.
-Traiter le matériel d'échantillonnage et les
récipients pour échantillons comme décrit en
5.1.2. Procéder comme décrit en 9.3.2, en utilisant
toutefois des techniques aseptiques
Procédure:
Généralité:
Afin d’améliorer la précis ion de la méthode, la préparation des dilutions doit être
soigneusement normalisée
Les facteurs qui affectent la
précision
Le temps d’agitation
Le type Le temps de
Le temps lors de la
d’appareillage pour Le diluant décantation des
d’homogénéisation préparation des
l’homogénéisation grosses particules
dilutions décimales
Les précautions d’asepsie habituelles doivent être prises. Les deux opérations de « Préparation de
l'échantillon à tester et dilution primaire » et « Autres dilutions décimales » ne doivent pas être
effectuées au soleil.
Partie d'essai, suspension
initiale et dilutions
ISO 6611-2004
Fromage et fromage
Beurre fondu
• Peser 10 g de l’échantillon à tester dans un • Pesez 10 g de l'échantillon à tester dans une
récipient à échantillon. coupelle et transférez-le dans le récipient d'un
• Placer le récipient dans le bain-marie réglé à mélangeur rotatif.
45 ° C. • Lorsqu'un mélangeur rotatif ou un mélangeur
• Conservez-le dans le bain-marie jusqu'à ce que de type péristaltique est utilisé, ajoutez 90 ml
la totalité de la prise d'essai ait fondue. de diluant => (pH 7,5 ± 0,1), préchauffé à 45 °
• Ajouter 90 ml de diluant (5.2) réchauffé à 45 ° C.
C
• Mélange, cette opération s’effectue plus • Mélangez jusqu'à ce que le fromage soit bien
facilement dans un mélangeur de type dispersé (1 min à 3 min). Si vous utilisez un
péristaltique (6.2). mélangeur rotatif, faites fonctionner l’appareil
pendant une durée suffisante pour obtenir un
total de 15 000 à 20 000 tours
Produits laitiers liquides
Agiter l'échantillon
testé de manière à
répartir les micro- Prélever 1 ml de la prise
organismes aussi d'essai avec une pipette
uniformément que stérile et l'ajouter à 9 ml de
possible en inversant diluant (ou 10 ml de prise
rapidement 25 fois le d'essai à 90 ml de diluant,
échantillon au ou 11 ml de l'échantillon à
récipient . tester à 99 ml de diluant).
retourner rapidement Agiter cette dilution
le récipient . Éviter la primaire, en utilisant un
formation de mousse. agitateur mécanique,
L'intervalle entre le pendant 5 s à 10 s pour
mélange et le retrait obtenir une dilution 10-1.
de la portion d'essai pour obtenir une dilution de
ne doit pas dépasser 3 [Link]éparer d'autres
minutes dilutions.
ISO 21527 :
Agitez la suspension initiale et les dilutions afin d'éviter la
sédimentation des particules contenant des micro-organismes.
En raison de la sédimentation rapide des spores dans la pipette,
maintenez la pipette dans une position horizontale (et non verticale).
Sauf pour la préparation spécifique de l’échantillon à tester, il est recommandé d’utiliser
un bouillon à l’eau 0,1% de peptone comme diluant. Utilisez un homogénéisateur
approprié plutôt qu'un mélangeur ou un shaker.
Préparer la prise d'essai, la suspension initiale (dilution primaire) et les
dilutions supplémentaires conformément à l'ISO 8261 (toutes les parties) et
L’ISO 6887.
Inoculation et incubation (ISO-6611)
Prenez deux autres boîtes de
Prendre deux boîtes de Petri Petri stériles. Transférer
stériles. Transférer dans dans chaque boîte, à l'aide
chaque boîte, à l'aide d'une d'une autre pipette stérile, 1 Si nécessaire, répétez cette
pipette stérile, 1 ml de ml de opération en utilisant
l'échantillon pour essai, s'il la dilution 10-1 (produit d'autres dilutions décimales.
est liquide, ou 1 ml de la liquide) ou 1 ml de la
suspension mère dans le cas dilution 10-2 (autres
d'autres produits. produits).
Pour éviter la propagation,
Mélangez soigneusement Verser environ 15 ml du milieu
Le temps écoulé entre la
l'inoculum avec le milieu en contenant le chlorhydrate certaines précautions doivent
faisant tourner les boîtes de d'oxytétracycline ou le milieu
préparation de la première
dilution et le mélange de
Pétri et laissez le mélange se
solidifier en laissant les
contenant du chloramphénicol, être prises, telles que
préalablement fondu et
l'inoculum ne doit pas
dépasser 15 min.
boîtes de Pétri reposer sur
une surface horizontale
maintenu à 45 °C au bain-
marie, dans chaque boîte de
• l'ajout d'une surcouche de
fraîche. Pétri. milieu de culture après
resolidification, ou
• l'ajout d'une goutte de
glycérol sur papier filtre dans
le couvercle de la boîte.
Ne pas empiler les plats plus
Après avoir retourné les de six de haut. Séparez les
Préparer un nombre suffisant boîtes préparées, placez-les piles de vaisselle les unes
de plaques de contrôle pour (en les maintenant en position des autres et des parois et le
vérifier la stérilité. verticale) dans l'incubateur dessus de l'incubateur.
réglé à 25 °C pendant 5 jours.
Inoculation et incubation (ISO-21527)
sur une deuxième plaque de pour faciliter le
gélose, à l'aide d'une dénombrement de faibles
Sur une plaque de gélose, à l'aide
pipette stérile neuve, populations de levures et
d'une pipette stérile, transférer 0.1 ml
transférer 0,1 ml de la moisissures, des volumes
de l'échantillon pour essai s'il est
première dilution décimale allant jusqu'à 0,3 ml d'un
liquide, ou 0.1 ml de la suspension
(10-1) dilution (produit échantillon dilué à 10-1, ou
initiale dans le cas des autres
liquide), ou 0,1 ml de la de l'échantillon s'il est
produits.
dilution 10-2 (autre liquide, peuvent être
produit). étalés sur trois plaques.
incuber les plaques
préparées en aérobiose,
couvercles vers le haut, en étaler le liquide sur la
répéter ces opérations avec
position verticale dans surface de la plaque de
les dilutions suivantes, en
l'incubateur à 25°C +- 1°C gélose avec un étaleur
utilisant une nouvelle
pendant 5 jours. si stérile jusqu'à ce que le
pipette stérile pour chaque
nécessaire, laisser reposer liquide soit complètement
dilution décimale
les plaques de gélose en absorbé dans le milieu.
exposition à la lumière
pendant 1 à 2 jours
Interprétation (ISO-6611)
Ne conserver que les boîtes
contenant au moins 10 et pas plus de
Compter les colonies sur chaque
150 colonies. Si des parties des
boîte. Évitez d'inclure une
plats sont
éventuelle colonie bactérienne
envahies par les moisissures, ou
occasionnelle qui peut être
s'il est difficile de compter des
développée.
colonies bien isolées, compter les
Si nécessaire, distinguer les
colonies de levures des colonies de colonies sur une boîte contenants
moisissures sur la base de critères une
morphologiques. dilution plus élevée, même si leur
nombre peut être inférieur à 10.
Dans ce dernier cas.
comptage et sélection des colonies pour
confirmation (ISO-21527)
lire les plaques entre 2 jours et 5
jours d'incubation. sélectionner
les boites contenant moins de 150
colonies/propagules/germes et si nécessaire, procéder à un examen
compter ces à la loupe binoculaire ou au
colonies/propagules/germes. si les microscope afin de distinguer les
moisissures à croissance rapide cellules de levures ou moisissures
présentent un problème, compter les et les bactéries des colonies.
colonies/propagules/germes après 2
jours et de nouveau après 5 jours
d'incubation
pour l'identification des levures
et des moisissures, sélectionner
compter les colonies de levures et
les zones de croissances fongiques
les colonies/propagules de
et les retirer pour un examen
moisissures séparément, si
microscopique ou inoculer sur des
nécessaire
milieux d'isolement ou
d'identification appropriés
Confirmation (ISO-6611)
L'identité de toute
colonie vraie ou
douteuse doit être
recherchée par examen
microscopique.
Si nécessaire,
confirmer au moins (√n)
des colonies au
microscope, où (n) est
le nombre de colonies
comptées
Expression des résultats et limites de confiance (ISO-21527)
Voir ISO-7218
enregistrer les
colonies de levures
et les
colonies/propagules
de moisissures
séparément, si
nécessaire.
Expression des résultats (ISO-
6611) Calculer le nombre • ∑C : la somme des colonies
d'UFC de levures et/ou
Conserver les boites comptées sur les boites retenues
moisissures, N, par
contenant au moins 10
et pas plus de 150 gramme ou par • N1 : le nombre de boites retenues
colonies millilitre de produit,
à l'aide de la dans la première dilution donnant
formule suivante : entre 10 et 150 colonies ;
• N2 :le nombre de boites
retenues dans la seconde
dilution donnant entre 10
et 150 colonies ;
• D :le facteur de dilution
correspondant à la
première dilution.
Expression des résultats (ISO-
S'il y a plus de deux
6611) N :le nombre de boites
dilutions dénombrables
donnant entre 10 et 150
3
colonies, la formule doit retenues dans la troisième
être dilution donnant entre 10
modifié pour tenir compte
des dilutions ultérieures. et 150 colonies
Pour trois dilutions, la
formule devient
Expression des résultats (ISO-
6611)
Arrondir le résultat obtenu à deux
chiffres significatifs. Lorsque le
nombre à arrondir est 5, sans Prendre comme résultat le nombre
autre d'UFC de levures et/ou moisissures
chiffres significatifs, par millilitre ou par gramme de
arrondissez le nombre produit, exprimé
immédiatement à gauche du 5 pour comme un nombre compris entre 1,0
obtenir un chiffre pair. Par et 9,9 multiplié par 10x, où x est
exemple la puissance appropriée de 10.
28 500 est arrondi à 28 000 et 11
500 est arrondi à 12 000.
Expression des résultats (ISO-
6611)
Exemple:
Un comptage des UFC de levures et/ou moisissures a donné les résultats
suivants (deux boîtes de Pétri par dilution ont été incubé):
• A la première dilution retenue (10−2), 83 et 97 colonies ;
• A la seconde dilution retenue (10−3), 33 et 28 colonies :
• En arrondissant les résultats comme spécifié au point 9.1, on
obtient 11 000 ou 1,1 × 104 UFC de levures et/ou moisissures
par gramme ou par millilitre de produit.
Expression des résultats (ISO-
6611)
Si les deux boîtes correspondant à la prise d'essai (produits liquides) ou
à la suspension mère (autres produits) contiennent moins de 10 colonies,
rapporter le résultat comme suit :
• moins de 10 UFC de levures et/ou moisissures par millilitre (produits
liquides) ;
• moins de 10 × 1/d UFC de levures et/ou moisissures par gramme (autres
produits), où d est le facteur de dilution de
• la suspension initiale.
S'il n'y a que des boîtes contenant plus de 150 colonies, calculez
un nombre estimé à partir des boîtes ayant un nombre le plus proche de 150
colonies et multiplier ce nombre par l'inverse de la valeur correspondante
à la plus haute dilution. Reportez le résultat sous la forme du « nombre
estimé d'unités formant colonie de levures et/ou moisissures par gramme ou
par millilitre de produit ».
