DUT « BIOANALYSES & CONTRÔLE »

Module 10:
Analyses et essais pharmaceutiques et cosmétiques
Pr. AINANE Tarik
Pr. SAOUDI Omaima

Année universitaire 2024/2025

Partie 1: Industries
pharmaceutiques et
cosmétiques

Pr. AINANE Tarik

Pr. SAOUDI Omaima
1- Définition:
• Industrie pharmaceutique
L’industrie pharmaceutique est le secteur économique qui se
consacre à la recherche, au développement, à la production
et à la commercialisation de médicaments pour traiter,
prévenir ou diagnostiquer des maladies chez les humains et les
animaux. Elle inclut des entreprises qui fabriquent des
médicaments génériques, des médicaments de marque, des
vaccins, et des produits biotechnologiques.

3
1- Définition:
• Industrie cosmétique:
L’industrie cosmétique englobe les activités liées à la création,
la production et la distribution de produits destinés à
améliorer l’apparence et le soin du corps. Cela inclut les
produits de soin de la peau, les produits capillaires, les
parfums, le maquillage, et les produits d’hygiène personnelle.

« Ces deux industries sont cruciales pour la santé et le bien-être des

consommateurs, et elles investissent beaucoup dans la recherche et
l’innovation pour répondre aux besoins et aux attentes du marché » 4
 2- Produits pharmaceutiques
a) Les produits pharmaceutiques médicamenteux: sont des
substances ou des compositions utilisées pour prévenir,
diagnostiquer, traiter ou soulager des maladies chez les humains
ou les animaux. Ils peuvent être administrés de différentes manières,
telles que par voie orale, injectable, topique, etc.

5
- Molécule organique synthétique (Paracétamol traitement symptomatique des
douleurs aiguës ou chroniques)
- Molécule organique hémi synthétique (D océtaxel substance active aux propriétés
anticancéreuses, est un alcaloïde obtenu par hémisynthèse à partir d'une molécule
extraite des feuilles de l'if européen)
- Molécule minérale (composé inorganique de formule Mg(OH)₂ Laxatif)
- Molécule issue du monde végétal (Quinine est un alcaloïde naturel antipyrétique,
analgésique et surtout, antipaludique Extraite du quinquina)
- Peptide ou protéine issue des biotechnologies(L'insuline est une hormone
protéique sécrétée par les cellules β des îlots de Langerhans dans le pancréas)
- Substance d’origine humaine ou animale (sérum le liquide sanguin débarrassé de
ses cellules et des protéines de la coagulation.)
6
2- Produits pharmaceutiques
b) Les produits pharmaceutiques non-médicamenteux: sont des articles
utilisés à des fins médicales ou de soins, mais qui ne contiennent pas de
substances actives destinées à traiter ou prévenir des maladies
- De diagnostic, prévention, contrôle, traitement ou atténuation d’une maladie
(Thermomètre médical, Hémodialyseur, …)
- De diagnostic, contrôle, traitement ou atténuation ou compensation d’une
blessure ou d’un handicap (Lentilles intra oculaires, …)
- D’étude, de remplacement ou de modification de l’anatomie ou d’un processus
physiologique ( Pace- maker, Prothèse articulaire, colles biologiques, …)
- De maîtrise de la conception (Dispositif intra utérin « stérilet »,Préservatif, …)

7
 2-1- Formulation d’un médicament:
La formulation d’un médicament correspond à l’ensemble des substances qui entrent dans
sa composition

1. Identification du principe actif

Le principe actif est la substance chimique qui produit l’effet thérapeutique désiré. La recherche commence souvent par
l’identification d’une cible biologique, comme une enzyme ou un récepteur, impliquée dans une maladie spécifique.
2. Synthèse et optimisation
Une fois la cible identifiée, les chimistes médicinaux synthétisent et testent des milliers de composés pour trouver ceux qui
interagissent efficacement avec la cible. Ces composés sont ensuite optimisés pour améliorer leur efficacité, leur sécurité et
leur stabilité.
3. Formulation galénique
La formulation galénique consiste à transformer le principe actif en un médicament administrable. Cela inclut :
Les excipients : Substances inactives qui facilitent l’administration du médicament (par exemple, les liants, les agents de
remplissage, les conservateurs).
La forme galénique : La forme sous laquelle le médicament sera administré (comprimé, gélule, sirop, injection, etc.)
4. Études précliniques
Avant d’être testé sur des humains, le médicament passe par des études précliniques sur des cellules et des animaux pour
évaluer sa toxicité et son efficacité.
8
 2-1- Formulation d’un médicament:
5. Essais cliniques
Les essais cliniques se déroulent en plusieurs phases :
• Phase I : Test sur un petit groupe de volontaires sains pour évaluer la sécurité et la posologie.
• Phase II : Test sur un groupe plus large de patients pour évaluer l’efficacité et les effets
secondaires.
• Phase III : Test sur un groupe encore plus large pour confirmer l’efficacité, surveiller les effets
secondaires et comparer avec les traitements existants.
6. Autorisation de mise sur le marché (AMM)
Si les essais cliniques sont concluants, une demande d’AMM est soumise aux autorités de santé
(comme la FDA aux États-Unis ou l’EMA en Europe). Une fois approuvé, le médicament peut être
commercialisé.
7. Surveillance post-commercialisation
Même après la mise sur le marché, le médicament continue d’être surveillé pour détecter tout effet
indésirable rare ou à long terme.
9
 Formulation d'un médicament
La formulation d’un médicament correspond à l’ensemble des substances qui entrent dans sa
composition.
Matière chimique : Molécules organiques, Composant(s)
MATIERES PREMIERES minéral (aux), Solvant(s) organique(s), Eau, …
Matière biologique :Plante(s), Microorganisme(s), Animal
Procédés de (aux), …
fabrication Autres : Argile, Pierres ponces, Produits bactéricides,
Produits fongicides, Produits antiseptiques, …
PRINCIPE(S) ACTIF(S)
Les agrégants : ils permettent la cohésion d’un mélange de poudres.
+ Les diluants : ils permettent la dilution et de compléter un volume.
EXCIPIENTS Les intermèdes : ils peuvent stabiliser le médicament et permettre de le fabriquer.
Les colorants : ils servent pour l’identification d’un médicament.
Transformation, Les édulcorants : ils donnent un goût acceptable voire agréable, on les appelle
Pré-formulation aussi les correctifs.
et Formulation Les conservateurs : ils empêchent la dégradation des médicaments, ils
empêchent également la prolifération de micro-organismes.
MEDICAMENT
L'aspect et la texture du produit final est
appelée "forme galénique".
Formes orales liquides : Sirop, Suspension,
Emulsion.
FORME GALINIQUE Formes orales solides : Gélules, Pilules,
Dragées, Cachets, Comprimés, Capsules,
pastilles.
Le nom du médicament. Formes dermatologiques : Onguent, Crème,
Les pictogrammes. Gel, Lotion, Shampoing, Savon,
EMBALLAGE ET ETIQUETTAGE Les conditions de Formes rectales : suppositoire.
délivrance. Ovules.
Les conditions de Gouttes.
conservation.
 3- PRODUITS COSMETIQUES :

PRODUITS CAPILLAIRES
PRODUITS SOLAIRES
• Les shampooings.
• Les produits pour la mise en forme des • Produits de protection solaire.
cheveux (permanentes). • Autobronzants.
• Les produits de maintien de la coiffure. • Produits après soleil.
• Les produits de la coloration.
• Les produits de soins et produits traitants.
PRODUITS DE MAQUILLAGE

PRODUITS D’HYGIÈNE (DE TOILETTE) • Rouges à Lèvres.

• Fonds de teint.
• Produits nettoyants et démaquillants. • Poudres.
• Déodorants et antiperspirants. • Produits pour les yeux (FAP, mascaras, eyeliner,
• Produits de rasage. anticernes...)
• Lingettes. • Vernis à ongles,
• Dentifrices.
• Produits d’épilation. PARFUMERIE ALCOOLIQUE

PRODUITS DE SOINS POUR LE VISAGE OU LE CORPS • Parfums, eaux de parfum...

• Produits d’extension de gamme
• Crèmes de soins.
• Masques.
• Produits de gommage.
• Produits de dépigmentation.
 COMPOSITION GÉNÉRALE D’UN PRODUIT
COSMETIQUE

Substances qui véhiculent les principes

Responsables de l'efficacité du produit cosmétique actifs dans l’ épiderme, ils vont moduler
la pénétration de l’actif à travers la peau
et peuvent avoir une activité par eux-
PRINCIPE(S)
ACTIF(S)
EXCIPIENT(S) mêmes

Substances qui vont améliorer le

rôle de l’excipient en modifiant ADJUVANTS ADDITIFS
Des additifs, qui présents en petite
l'aspect, le toucher et la viscosité quantité vont améliorer la présentation
du cosmétique (humectants, et la conservation du produit, ce sont:
épaississants) • Des agents conservateurs, qui évitent
la contamination bactérienne et des
antioxydants qui protègent les
produits de l’oxydation.
• Des parfums destinés à rendre
agréable l'utilisation du produit de
beauté ou à masquer l'odeur de
certains ingrédients.
• Des colorants.
 LES DIFFERENTES FORMES GALENIQUES DES PRODUITS
COSMETIQUES

Solutions vraies Une solution vraie résulte d’un mélange homogène de deux ou plusieurs substances
Solutions
Solutions colloïdales Elle est obtenue par la dissolution de particules de solutés (macromolécules) dans l’eau
(solvant).

Emulsions Liquide/Liquide

Suspensions Une dispersion résulte de la fragmentation Solide / liquide ou Liquide / solide

d’une substance au sein d’une autre
Dispersions substance. Ces deux substances ne sont pas
Formes galéniques Aérosols miscibles entre elles et se présentent à l’état Liquide/Gaz ou Solide/Gaz
solide, liquide ou gazeux

Mousses Gaz/Liquide ou Gaz/Solide

Tensio-actif mélanger deux liquides hetérogènes

Le stabilisant ou émulsionnant est une
Stabilisant ou substance naturelle ou chimique capable de
mélanger un solide et un liquide
Gélifiant réaliser un mélange stable dans le temps, à
émulsionnant
partir de substances non miscibles entre elles,
mélanger des substances chargées (+ ou -
raidisseur
d'interface
 LES MATIÈRES PREMIÈRES
• L’eau.
• Les produits d’origine minérale : Silices, Silicates, Sels
• Les alcools et les solutions alcooliques : Ethanol, d’aluminium, Carbonates, Oxydes, …
Propylène glycol , Glycérol = glycérine, Sorbitol.
• Les vitamines : Vitamine A, Vitamine C, Vitamine E,
• Les composés lipidiques : Acides gras, Alcools gras, Esters Vitamine B6, …
gras, Huiles végétales, Huiles animales, Huiles modifiées,
Huiles synthétiques, Beurres, … • Les extraits biologiques : Huiles essentielles, Extraits secs,
…
• Les composés glucidiques : Alginates (algues), Cellulose
(bois), Gomme arabique (sève famille de l’acacia), Pectine • Les colorants : Origine minérale (Oxyde de titane, Oxyde
(graines), Gel d’aloès (feuilles), Chitosane (carapaces de de zinc, … ), Origine végétale (Caroténoïdes,
crustacés), … Chlorophylles, Anthocyanes,…), Origine animale (Carmin
de Cochenille), Origine synthétique (Tartrazine), …
• Les composés azotés : Acide glutamique, Arginine,
Citrulline, Hydroxyproline, Proline, Sérine, … • Les conservateurs : L’acide salicylique, La chlorhexidine,
Le triclosan, Le formol, L’acide sorbique, L’acide
• Les protéines : Collagène (peau de poisson), Kératine benzoïque, …
(plumes de poulets), ….
• Les antioxydants : BHT, BHA, …
• Les hydrocarbures : Vaselines (pâteux), Paraffines
(solides), … • Les matières aromatiques.

• Les composés macromoléculaires de synthèse : Silicones,

Carbomers, …
Exemple: Crème hydratante

Question: Comment choisir les matières premières pour une crème

hydratante?

Réponse: Choisir les matières premières pour une crème hydratante

nécessite de prendre en compte plusieurs facteurs pour garantir
l’efficacité, la sécurité et la satisfaction des utilisateurs.

« Voici quelques étapes clés pour vous guider »

15
Exemple: Crème hydratante
1- Identifier le type de peau cible :
• Peau sèche : Optez pour des ingrédients riches et nourrissants comme
le beurre de karité, l’huile d’avocat, et l’acide hyaluronique.
• Peau grasse : Privilégiez des ingrédients légers et non comédogènes
comme l’aloe vera, l’huile de jojoba, et la niacinamide.
• Peau sensible : Utilisez des ingrédients apaisants et hypoallergéniques
comme l’extrait de camomille, l’avoine colloïdale, et le panthénol.

16
Exemple: Crème hydratante
2- Choisir des agents hydratants efficaces :
• Humectants : Glycérine, acide hyaluronique, urée. Ces ingrédients
attirent l’eau dans la peau.
• Émollients : Huiles végétales, beurres (karité, cacao), silicones. Ils
adoucissent et lissent la peau.
• Occlusifs : Cires, vaseline, lanoline. Ils forment une barrière pour
retenir l’humidité.

17
Exemple: Crème hydratante
3- Ajouter des agents de texture et de stabilisation :
• Émulsifiants : Lécithine, polysorbates. Ils permettent de mélanger
l’eau et l’huile.
• Épaississants : Gomme xanthane, carbomères. Ils donnent de la
consistance à la crème.
4- Incorporer des conservateurs :
Pour éviter la contamination microbienne, utiliser des conservateurs
sûrs comme les parabènes, le phénoxyéthanol, ou des conservateurs
naturels comme l’extrait de pépins de pamplemousse.

18
Exemple: Crème hydratante
4- Incorporer des conservateurs :
Pour éviter la contamination microbienne, utiliser des conservateurs sûrs
comme les parabènes, le phénoxyéthanol, ou des conservateurs naturels
comme l’extrait de pépins de pamplemousse.
5- Ajouter des actifs spécifiques :
Selon les besoins, ajouter des vitamines (comme la vitamine E), des
antioxydants, ou des extraits de plantes pour des bénéfices supplémentaires.
6- Tester et ajuster :
Formuler des échantillons et testez-les pour vérifier la texture, l’absorption, et
l’efficacité hydratante. Ajuster les proportions des ingrédients si nécessaire.
19
Exemple de matières premières pour une baume à lèvre

• Cires :
• Cire d'abeille (pour sa consistance et ses propriétés protectrices)
• Cire de carnauba (végétale, pour un fini brillant)
• Huiles :
• Huile de coco (hydration et texture crémeuse)
• Huile d'amande douce (nourrissante)
• Huile d'olive (hydratante et riche en antioxydants)
• Huile de jojoba (équilibre et protection)
• Beurres :
• Beurre de karité (très nourrissant)
• Beurre de cacao (pour un parfum agréable et une texture lisse)
• Émollients :
• Vitamine E (antioxydant et conservateur naturel)
• Extraits de plantes (comme l’extrait de calendula ou de camomille pour apaiser)
• Colorants (optionnels) :
• Mica ou pigments naturels pour une teinte colorée.
• Huiles essentielles (optionnelles) :
• Pour le parfum, comme la menthe poivrée, la lavande ou l’orange douce.
20
 Partie 2: Techniques
d’analyses des produits
pharmaceutiques et
cosmétiques.

Pr. AINANE TariK

Pr. SAOUDI Omaima
 1) NORMES ET RÈGLEMENTS DU CONTRÔLE QUALITÉS
DES PRODUITS PHARMACEUTIQUES ET COSMÉTIQUES:

Les produits pharmaceutiques et cosmétiques devraient être sûrs dans des conditions d’utilisation
normales ou raisonnablement prévisibles.

PROCESS DU CONTRÔLE

Recherche Principe actifs Bioanalyse et contrôle

R Excepients
&
D Fabrication en Bioanalyse et contrôle
Formulation
pilote
Contrôle d’atmosphère
Fabrication Echelle Contrôle des surfaces
industrielle Contrôle de l’hygiène du personnel
Contrôle microbiologique du produit
vrac
conditionnement Contrôle du produit fini
Les normes et règlements pour le contrôle de la qualité des produits pharmaceutiques et cosmétiques sont
essentiels pour garantir la sécurité, l’efficacité et la conformité des produits. Voici quelques-unes des
principales normes et règlements :
Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) / Good s’appliquent à la production et au contrôle de la qualité des
Manufacturing Practices (GMP) médicaments, des compléments alimentaires et des cosmétiques. Elles
visent à assurer que les produits sont fabriqués de manière cohérente et
contrôlée selon des normes de qualité appropriées.
Normes ISO: « ISO 22716 » fournit des lignes directrices pour la fabrication, le contrôle, le stockage
et l’expédition des produits cosmétiques.
Normes ISO: « ISO 9001» spécifie les exigences pour un système de management de la qualité,
applicable à toutes les industries, y compris pharmaceutique et
cosmétique.
Normes ISO: « ISO 17025» couvre les exigences générales relatives à la compétence des laboratoires
d’essais et d’étalonnage, cruciales pour le développement de
médicaments et le contrôle qualité
Pharmacopée Européenne (Ph. Eur.) La Ph. Eur. offre une base scientifique pour le contrôle qualité des
produits pharmaceutiques tout au long de leur cycle de vie4. Elle définit
des normes de qualité pour les substances actives, les excipients et les
produits finis.
Règlementation des produits cosmétiques En France, l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits
(ANSM) de santé (ANSM) régule les produits cosmétiques. Les fabricants
doivent se conformer aux exigences de sécurité, d’étiquetage et de
notification avant la mise sur le marché5.

23
 RÉFÉRENTIELS POUR LE CONTRÔLE

International Organization for Standardization

« Document établi par consensus et approuvé par
un organisme reconnu, qui fournit, pour des Normes ISO
usages communs et répétés, des règles, des lignes
directrices ou des caractéristiques, pour des contrôle de la qualité pendant les
activités ou leurs résultats garantissant un niveau processus de développement, de
d'ordre optimal dans un contexte donné » production et de commercialisation.
Référentiels pour le
contrôle

Normes d'analyses et d'essais

La Pharmacopée européenne est un ouvrage de
référence unique en matière de contrôle de la
Pharmacopée
qualité des médicaments au sein des pays
signataires de la Convention relative à son
élaboration. Les normes officielles qui y sont
publiées fournissent une base juridique et
scientifique.
 PHARMACOPÉES
Les Pharmacopées sont des recueils réglementaires régulièrement
mis à jour et destinés :
- Aux professionnels de santé utilisateurs de matières premières
ou en charge de préparations pharmaceutiques.
- Aux laboratoires (publics et privés) chargés des contrôles de
qualité et service d’évaluation des médicaments.

Les Pharmacopées définissent :

- Les critères de pureté des matières premières ou des préparations
35 États membres (inclus 26 pays de l’Union européenne) :
entrant dans la fabrication des médicaments (à usage humain ou Allemagne, Autriche, Belgique, Bosnie et Herzegovine,
vétérinaire). Bulgarie, Chypre, Croatie, Danemark, Espagne, Estonie,
- Les méthodes d’analyse à utiliser pour en assurer le contrôle. Finlande, France, Grèce, Hongrie, Irlande, Islande, Italie,
Lettonie, Lituanie, Luxembourg, Malte, Norvège, Pays-bas,
Portugal, République Tchèque, Roumanie, ex-République
Les Pharmacopées les plus utilisées : yougoslave, Royaume-Uni, Serbie et Monténégro, Slovaquie,
- La Pharmacopée Européenne Ph. Eur. (matières premières). Slovénie, Suède, Suisse,Turquie.
- La Pharmacopée Britannique BP (matières premières et produits
Commission des Communautés européennes
finis).
- La pharmacopée Américaine « USP » (matières premières et produits 14 Observateurs :
finis). • Pays européens : Albanie, Georgie, Pologne, Ukraine,
Les Pharmacopées sont constituées de plusieurs monographies • Pays non – européens: Maroc, Algérie, Australie, Canada,
(ensemble de spécifications définissant des caractéristiques Chine, Malaisie, Sénégal, Syrie, Tunisie
qualitatives et quantitatives des matières premières ou produits finis • OMS
pharmaceutiques en vue d’assurer une qualité optimale),
 2) TECHNIQUES D’ANALYSES :

Techniques d’analyses pour les produits Techniques d’analyses pour les produits
pharmaceutiques cosmétiques

1- Chromatographie en phase liquide à haute Chromatographie en phase gazeuse (GC) :

performance (HPLC) : Utilisée pour séparer, Utilisée pour analyser les composés volatils et
identifier et quantifier les composants d’un semi-volatils.
mélange. Spectroscopie infrarouge (IR) : Permet
2- Spectrométrie de masse (MS) : Permet d’identifier les liaisons chimiques dans les
d’identifier les molécules et de déterminer leur molécules.
structure chimique. Tests de stabilité : Évaluent la durée de
3- Résonance magnétique nucléaire (RMN) : conservation et la stabilité des produits sous
Utilisée pour déterminer la structure des différentes conditions environnementales.
composés organiques. Analyse microbiologique : Vérifie la présence
4- Tests de dissolution : Évaluent la vitesse à de micro-organismes pour assurer la sécurité du
laquelle un médicament se dissout dans un produit.
liquide, ce qui est crucial pour son efficacité.

26
 2) TECHNIQUES D’ANALYSES :

Analyses
sensorielles

Volumétrie, Tests
Analyses chimiques
chimiques, …

 COMPOSITION QUALITATIVE
Spectroscopie,
Analyses physico- Chromatographie,  COMPOSITION QUANTITATIVE
chimiques Analyses thermiques,
…  CARACTERISTIQUES ORGANOLEPTIQUES

 ESSAIS
TECHNIQUES D’ANALYSES Analyses Tests d’orientations,
biochimiques Tests enzymatiques, …  PURETE

 STABILITE
Identification des
Analyses  PROPRETE MICROBIOLOGIQUE
microbiologiques microorganismes,
Confirmation, …
 ACTIVITE BIOLOGIQUE (IN VIVO ET IN VITRO)

Analyses
Extraction d’ADN,
biologiques
Analyse PCR, …
moléculaires

Analyses
Test toxicité, Test
biologiques
prolifération, …
cellulaires
 PRINCIPALES TECHNIQUES D’ANALYSES UTILISÉES POUR LES
CONTRÔLES PHARMACEUTIQUES ET COSMÉTIQUES

pH, Conductivité,
Analyses de Indice de
routine réfraction,
humidité, … CCM

In vivo

Analyses Analyses Analyses Analyses

Sensorielles Organoleptiques Chromatographiqu CPG microbiologiques
es
In vitro

HPLC
Analyses
Titrages
Volumétriques
Extraction ADN

UV-VISIBLE Analyses en
biologie PCR
ATD moléculaire
Analyses
Analyses
Spectroscopiqu INFRA-ROUGE
thermiques
es Analyse ADN
ATG

ICP
 TRAVAUX DIRIGÉS 1
Techniques d’analyses physico-chimiques d’un produit
pharmaceutique ou cosmétique.

29
Analyses physico-chimiques

Dans le domaine pharmaceutique et cosmétique, plusieurs types d'analyses physico-chimiques

sont essentielles pour garantir la qualité, la sécurité et l'efficacité des produits. Voici quelques-
unes des principales analyses :
1. Analyse de pureté
Chromatographie (HPLC, GC) : Pour séparer et quantifier les composants d'un mélange.
Spectroscopie (UV-Vis, IR) : Pour identifier les substances et mesurer leur concentration.
2. Analyse de stabilité
Tests de stabilité : Évaluer la dégradation des produits dans le temps sous différentes conditions
(température, lumière, humidité).
Études de vieillissement accéléré : Pour prédire la durée de vie du produit.
30
3. Analyse de solubilité
Tests de solubilité dans différents solvants : Pour déterminer comment
un principe actif se dissout dans les formulations.
4. Analyse de viscosité
Viscométrie : Pour mesurer la viscosité des formulations, importante pour
la texture des crèmes et des gels.
5. Analyse de point de fusion et d'ébullition
Détermination des points de fusion et d'ébullition : Pour caractériser les
substances.
6. Analyse de densité et de masse volumique
Densimétrie : Pour déterminer la densité des liquides ou des solides.
7. Analyse de pH
Mesure du pH : Pour évaluer l'acidité ou l'alcalinité des formulations.
31
8. Analyse de libération (dissolution)
Tests de dissolution : Pour évaluer la vitesse à laquelle un principe actif est libéré
dans un milieu.
9. Analyse de taille des particules
Diffraction laser ou microscopie : Pour mesurer la distribution de la taille des
particules, ce qui influence la biodisponibilité.
10. Analyse de contamination
Tests microbiologiques : Pour détecter la présence de contaminants microbiens.
Analyse de métaux lourds : Pour évaluer la présence de contaminants
inorganiques.
11. Caractérisation des formes solides
Diffraction des rayons X (DRX) : Pour déterminer la structure cristalline des
solides.
Analyse thermogravimétrique (TGA) : Pour étudier la stabilité thermique des
substances. 32
Analyse volumétrique

33
Titrage volumétrique
Le titrage volumétrique est une technique analytique utilisée pour
déterminer la concentration d'une solution inconnue en ajoutant une
solution de concentration connue (appelée titrant) jusqu'à atteindre un point
d'équivalence.
Il est utilisé dans de nombreux domaines pour assurer la qualité et la
sécurité des produits, comme en pharmacie et en alimentation.
1-Concept de base
• Titrant : Solution de concentration connue.
• Analyte : Solution dont on veut déterminer la concentration.
• Point d'équivalence : État atteint lorsque le nombre de moles de titrant
ajouté est stoechiométriquement (proportion exacte) égal au nombre de
moles de l'analyte
34
Titrage volumétrique
2- Étapes de Base
• Préparation : On mesure un volume de l'analyte dans un récipient (comme un
erlenmeyer).
• Ajout du titrant : On ajoute le titrant depuis une burette, petit à petit.
• Point d'équivalence : On utilise un indicateur (qui change de couleur) pour savoir
quand on a ajouté la quantité exacte de titrant nécessaire
3- Calcul
• À ce point, on peut utiliser la formule suivante pour calculer la concentration de
l'analyte :
• C1×V1=C2×V2
Où :
• C1​= concentration du titrant,
• V1​= volume du titrant ajouté,
• C2= concentration de l'analyte,
• V2​= volume de l'analyte.

35
ANALYSES SENSORIELLES
OU
ANALYSES
ORGANOLEPTIQUES

36
L’analyse sensorielle ou l’analyse organoleptique

L’analyse sensorielle ou l’analyse organoleptique consiste à analyser les

propriétés organoleptiques des produits par les organes des sens.
Les analyses sensorielles permettent de caractériser les propriétés
organoleptiques d’un produit, de connaître les avis et attentes de
consommateurs en terme de perception sensorielle.

• L’évaluation organoleptique doit être effectuée par un

personnel convenablement qualifié. Ils évaluent une gamme
bien déterminée d’un produit et utilisent une seule méthode
d’évaluation organoleptique.

37
LABORATOIRES D'ANALYSE SENSORIELLE

Le local où se déroule les analyses doit répondre à des normes bien précises
(AFNOR NF V 09-105).
Ce local doit comprendre au moins trois pièces réservées à l’analyse
sensorielle : une salle de préparation, une salle de l’analyse sensorielle, et une
salle de réunion, auxquelles s’ajoute un bureau pour le personnel.

38
 TRAVAUX DIRIGÉS 2
Olfactométrie : Mesure des odeurs par analyse sensorielle.

39
Olfactométrie :
L'analyse olfactométrique est une méthode utilisée pour évaluer et quantifier les
odeurs. Elle est souvent appliquée dans des domaines tels que l'environnement,
l'agroalimentaire, la parfumerie, et l'industrie chimique.

40
 ON CHERCHE
A DETERMINER

DES DIFFERENCES DES PREFERENCES DES INTENTIONS

D’ACHAT

EPREUVES ETUDES
EPREUVES EPREUVES HEDONIQUES CONSOMMATEURS
DISCRIMINATIVES DESCRIPTIVES

SUJETS ENTRAÎNÉS SUJETS “NAIFS”

41
TECHNIQUES D’ANALYSE MICROBIOLOGIQUES
• Les pharmacopées distinguent deux types de produits :

- Les produits qui doivent être stériles :

 Les préparations pour usage parentéral (introduction d’une substance dans l’organisme par une autre
voie que la voie digestive, exemple : Injection sous-cutanée, intraveineuse ou intra musculaire).
 Les préparations ophtalmiques.
 Les pansements chirurgicaux et le matériel chirurgical.
 Les autres préparations devant être stérile…

-Les produits non obligatoirement stériles :

 Les matières premières.
 Les médicaments à usage non parentéral.

43
 Risque microbiologique

L'analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels que :

• l'altération potentielle des produits;
• le caractère pathogène des micro-organismes;
• le site d'application des produits;
• la catégorie d'utilisateurs (adultes, enfants de 5 ans au 12 ans, enfants de moins de 5 ans, bébé,
...).
Recherche d'agents pathogènes :
• Staphylococcus aureus,
• Pseudomonas aeruginosa
• Candida albicans
• recherche des indicateurs de contamination fécale pour détecter une défaillance de l'hygiène
au cours du processus de fabrication.
• Escherichia coli

44
A) CONTRÔLE D’UN PRODUIT NON OBLIGATOIREMENT STÉRILE

1) MICROORGANISMES RECHERCHÉS
• La présence de micro-organismes peut
 Réduire l’efficacité des principes actifs
 Induire des problèmes de santé
• produits à faible risque de contamination :
– Dénombrement de germe indicateur de la qualité globale :
– les germes totaux (DGAT : dénombrement des germes aérobies totaux)
– les levures et moisissures (DMLT : dénombrement des moisissures et levures totales)
– Recherche des microorganismes spécifiques, pour quelques produits particuliers : [Link] ,
Salmonella , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus.
• Leur recherche va dépendre :
• la voie et le mode d’administration
• La nature du produit et son aptitude à favoriser la croissance microbienne
• Catégorie de patients visée (YOPI: Young Old, Pregnant, Immunocompromised)
• Etat du patient : Existence de blessures, lésions organiques, utilisation d’immunosuppresseurs.
• Des traitements ultérieurs de fabrication pour les matières premières
45
 2) TECHNIQUES
• Préparation de l’échantillon avec
– un diluant avec neutralisant tamponné pour arrêter l’action des antimicrobiens présents
(PA ou conservateur)
– un tensio-actif pour mélanger les produits de nature lipidique
• Méthode de dénombrement
• Filtration
• Dénombrement en milieu solide (produit non filtrable)
• Les milieux de culture recommandés par la pharmacopée sont :
– Milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja pour la FMAT (Flore Mésophile Aérobie
Totale)
– Milieu Sabouraud glucosé gélosé + ATB pour les levures moisissures

46
 3) CRITÈRES D’ACCEPTATION (PH Eu 8.0 2014)
DGAT DMLT Micro-organismes spécifiés
Voie d’administration UFC/g UFC/g Absence dans ( ) 5.1.4. Qualité
ou /mL ou /mL microbiologique des
Orale : préparation non aqueuse 103 102 Escherichia coli (1g ou 1 mL) préparations
pharmaceutiques et des
Orale : préparation aqueuse 102 101 Escherichia coli (1g ou 1 mL) substances pour usage
pharmaceutique non
Rectale 103 102
stériles (5.8.)
Buccale, Gingivale Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
102 101
Cutanée, Nasale, Auriculaire Pseudomonas aeruginosa(1g ou 1 mL)
Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Vaginale 102 101 Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Candida albicans (1g ou 1 mL)
Staphylococcus aureus(1 dispositif)
Transdermique 102 101
Pseudomonas aeruginosa (1 dispositif)
Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL)
Inhalation 10 2
10 1
Pseudomonas aeruginosa (1g ou 1 mL)
Bactéries Gram – résistantes aux sels biliaires (1g ou 1 mL)
- DGAT :
Staphylococcus aureus(1g ou 1 mL) Dénombrement
Préparation à base de MP naturelle ne Escherichia coli (1g ou 1 mL)
des Germes
pouvant subir de prétraitement 104 102 Salmonella (10 g ou 10 mL)
antimicrobien Au maximum 102 Bactéries Gram – résistantes aux sels Aérobies Totaux.
biliaires /g ou mL - DMLT :
Dénombrement
Escherichia coli (1g ou 1 mL) des Moisissures
Aliments médicamenteux vétérinaire
Salmonella (10 g ou 10 mL) et Levures
ne pouvant subir de prétraitement 105 104
Au maximum 104 Bactéries Gram – résistantes aux sels Totaux.
antimicrobien
biliaires /g ou mL
B) CONTRÔLE DES PRODUITS STÉRILES :

1) RECHERCHE DE MICRO-ORGANISMES :
Etant des produits stériles, il ne s’agit plus de dénombrer mais de vérifier l’absence de
tout microorganisme (FMAT, levures moisissures, bactéries anaérobies en bouillon
thyoglycolate) mais aussi d’endotoxine.
Vue l’absence de microorganisme dans le produit, il faut tester de grand volume
d’échantillon d’où l’utilisation des techniques de filtration.
Afin de limiter encore le risque de contamination par l’environnement, l’appareil de
filtration est manipulé sous des isolateurs : PSM de type III ou équipés d’un hémi
scaphandre.

48
Médicament à analyser

Bouillon TSA
Bouillon Schaedler
Germes retenus sur les filtres

Incubation : 30° C en
Aérobiose et Anaérobiose

49
2) RECHERCHE ET DOSAGE D’ENDOTOXINE :
Les normes de la pharmacopée imposent l'absence de substances
pyrogènes (susceptible de provoquer une augmentation de la
température) dans les produits pharmaceutiques qui entrent en
contact avec la circulation sanguine ou le système nerveux central.
Les pyrogènes sont soit
- des micro-organismes responsables d’infections
- des substances sécrétées par des micro-organismes persistant
après la destruction de celui-ci ex : endotoxine

50
 L'essai permettant la détection des endotoxines
Endotoxine : partie de la membrane bactériennes est un essai in vitro réalisé à l'aide d'un
externe d'une enveloppe cellulaire de réactif, le lysat d'amoebocytes de Limule (LAL),
bactérie à Gram-négatif obtenu à partir des cellules circulantes de cet animal :
le limule.

Lysat d'amébocytes de Limule (LAL)

Extraits aqueux de globules sanguins provenant de
la Limule, Limulus polyphemus ou Tachypleus
tridentatus
51
DOSAGE D’ENDOTOXINE :
• Lors de la mise en présence du LAL et d’endotoxines, la formation de coaguline s’accompagne de
l’apparition
• d’un trouble (base de la méthode turbidimétrique)
• Leur agrégation conduit à la formation
• d’un gel (technique par gélification)
• La protéine coagulogène peut être éliminée du réactif LAL et remplacée
• par un substrat chromogène spécifique de la coagulase (méthodes chromogéniques)
• Par un substrat fluorogène spécifique de la coagulase (méthode par fluorimétrie)
1. Préparation de l'échantillon: Échantillon du
produit testé est préparé et placé dans un tube ou
une plaque.
2. Ajout du lysat d'amoebocytes: Le lysat
d'amoebocytes de Limule (LAL) est ajouté à
l'échantillon.
3. Incubation: Mélange est incubé à une température
spécifiée, permettant aux endotoxines de réagir avec
le LAL.
4. Détection: Si des endotoxines sont présentes, elles
provoqueront une coagulation visible ou une
fluorescence dans le cas de substrats fluorogènes.

C'est un outil essentiel pour garantir la sécurité des produits médicaux et

pharmaceutiques. 53
Dosage des pyrogènes « totaux » :

- L'essai des pyrogènes est une étape cruciale pour garantir la sûreté des
produits pharmaceutiques parentéraux et des dispositifs médicaux.
- Dans les infections, les substances pyrogènes peuvent provenir de toxines
microbiennes et les leucocytes pourraient peut-être en sécréter.

54
1. Préparation de l'échantillon: L'échantillon contenant les
pyrogènes est préparé et placé dans un puits ou une plaque de
micro-titration
2. Immobilisation de l'antigène: Un antigène lié aux pyrogènes
est déposé dans chaque puits
3. Liaison avec l'anticorps: Un anticorps spécifique aux
pyrogènes est ajouté et autorisé à se lier à l'antigène
4. Liaison avec un second anticorps: Un deuxième anticorps,
souvent marqué avec une enzyme, est ajouté pour se lier à
l'anticorps primaire
5. Ajout du substrat: Un substrat chromogène ou fluorogène est
ajouté, qui réagit avec l'enzyme pour produire une couleur ou
une lumière
6. Mesure: La couleur ou la lumière produite est mesurée,
généralement avec un spectrophotomètre ou un fluoromètre,
pour déterminer la concentration des pyrogènes dans 55
 C) CONTRÔLE DES PRODUITS FINIS

Référentiels pour le contrôle

• Pharmacopée EU 8.0 (janvier 2014): (harmonisée)
Cosmétique = médicament à usage cutané
• paragraphe 2 .6.12 : Contrôle microbiologique des produits non stériles :essais de dénombrement
microbien
• paragraphe 2.6.13 : Contrôle microbiologique des produits non stériles : recherche de
microorganismes spécifies

• Normes ISO
• NF EN ISO 21 148 : généralités(2009)
• NF EN ISO 21 149 : dénombrement et détection de la flore mésophile aérobie (2009)
• NF EN ISO 16 212: dénombrement des levures moisissures (2011)
• NF EN ISO 22 718: détection Staphylococcus aureus (2009)
• NF EN ISO 21 717 : détection Pseudomonas aeruginosa (2009)
• NF EN ISO 21 148 : détection Escherichia coli (2009
• NF EN ISO18 416 : détection Candida albicans (2009)
• NF EN ISO18 415 : détection des micro-organismes spécifiés et non spécifiés (2011)
Préparation de la suspension mère :
• le temps qui s’écoule entre la fin de la préparation et le moment où l’inoculum entre
en contact avec le milieu de culture ne doit pas dépasser 45 min
• La suspension mère est préparée à partir d’un échantillon d’au moins 1 g ou 1 ml
du produit d’essai mélangé avec soin.

Produit miscible à l’eau Produit non miscible à l’eau

V mL de diluant neutralisant + polysorbate

V mL de diluant-neutralisant
80
Dilution d=
Dilution d=
1/10
1/10 S (g ou mL) de
S (g ou mL) de
produit
produit

S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit

Composés chimiques pouvant Exemples de neutralisants adéquats et de liquides de

neutraliser rinçage (pour les méthodes de filtration sur
Conservateur
l'activité antimicrobienne des membrane)
conservateurs
Produits phénoliques: Lécithine Polysorbate 80, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Polysorbate 80 Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras, 7 g/l + lécithine, 20 g/l +
parabens, phénoxyéthanol,
Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras polysorbate 80, 4 g/l.
phényléthanol, etc.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Tensioactifs non ioniques Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5
Anilides
g/l.
Lécithine, saponine, polysorbate 80, dodécylsulfate de
Ammoniums quaternaires Polysorbate 80, 30 g/l + dodécylsulfate de sodium, 4 g/l + lécithine, 3 g/l.
sodium
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Bouillon neutralisant D/Ea.
Tensioactifs cationiques Condensat d'oxyde d'éthylène d'alcools gras
Liquide de rinçage: eau distillée; tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5
g/l.
Aldéhydes Lécithine, 3 g/l + polysorbate 80, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + L-histidine, 1 g/l + L-cystéine, 1 g/l.
Agents générateurs de Glycine, histidine
formaldéhyde Bouillon neutralisant D/Ea.
Liquide de rinçage: polysorbate 80, 3 g/l + L-histidine, 0,5 g/l.
Thiosulfate de sodium, 5 g/l.
Oxydants Thiosulfate de sodium
Liquide de rinçage: thiosulfate de sodium, 3 g/l.
Lécithine, saponine Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Isothiazolinones, imidazoles Amines, sulfates, mercaptans, bisulfite de sodium,
thioglycolate de sodium Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Polysorbate 80, 30 g/l + saponine, 30 g/l + lécithine, 3 g/l.
Biguanides Lécithine, saponine, polysorbate 80
Liquide de rinçage: tryptone, 1 g/l + NaCl, 9 g/l + polysorbate 80, 5 g/l.
Sels métalliques (Cu, Zn, Hg) Bisulfite de sodium, L-cystéine Thioglycolate de sodium, 0,5 g/l ou 5 g/l.
 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes d’un produit :
• la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et validée
• La validation est réalisée en contaminant le produit avec des souches de référence et en effectuant le dénombrement
contre un témoin sans produit.
• Staphylococcus aureus ATCC 6538
• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ou [Link] ATCC 8739
• Candida albicans ATCC 10231
• L’écart entre le témoin et l’essai ne doit pas excéder 50% (0,3 log)
Dénombrement et détection :
• En plus du dénombrement, un détection est également réalisée dans un bouillon « d’enrichissement » incubé pendant
20H.
Peptone pancréatique de 15 g
• Bouillon Eugon LT 100 : caséine
Peptonepapaïque de soja 5,0 g
L-cystéine 0,7 g
Chlorure de sodium 4,0 g
Sulfite de sodium 0,2 g
Glucose 5,5 g
Lécithine d’oeuf 1,0 g
Polysorbate 80 5,0 g
Catégorie de
FMAT Germes pathogènes
Octoxynol 9 1,0 g
produit
* destinés aux enfants < 3 ans ou
catégorie 1* ≤10 UFC/ g (ou mL)
2
Absence dans 0,5 g ou mL en contact avec les yeux et les
muqueuses recommandation du
catégorie 2 ≤103UFC/ g (ou mL) Absence dans 0,1g ou mL SCCP
 DÉNOMBREMENT ET DÉTECTION GERMES AEROBIES MESOPHILES
Norme ISO 21 149

Dénombrement Validation du Dénombrement

Pseudomonas aeruginosa
1 mL
V mL de diluant neutralisant Staphylococcus aureus
V mL de diluant neutralisant
à 10 UFC/mL(masse)
3
Dilution d= 1/10 Dilution d= 1/10
à 104 UFC/mL ( surface)
S (g ou mL) de produit à 102 UFC/mL S (g ou mL) de produit Témoin sans produit
(filtration)

1 mL en masse 1 mL en masse
0,1 ml en 0,1 ml en
surface Si inefficacité du surface
10 mL filtration neutralisant 10 mL filtration

Géloses TSA

N T
Réfrigérateur
(détection des particules)
72 H ± 6H
72 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C
32,5 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉNOMBREMENT des levures et moisissures
Norme ISO 16 212
Dénombrement Validation du Dénombrement

Candida albicans 1 mL
V mL de diluant neutralisant
à 103 UFC/mL(masse) V mL de diluant neutralisant
Dilution d= 1/10 à 104 UFC/mL
Dilution d= 1/10
( surface)
S (g ou mL) de produit à 102 UFC/mL S (g ou mL) de produit Témoin sans produit
(filtration)
1 mL en masse 1 mL en masse
0,1 ml en surface 0,1 ml en
10 mL filtration surface
10 mL filtration

Géloses SDA
Sabouraud dextrose agar

Réfrigérateur N T
(détection des particules)
3 à 5 jours
3 à 5 jours
25 °C ± 2,5°C
25 °C ± 2,5°C
Validation si N >50% (0,3 log)de T
S = 1g produit de catégorie2
S= 5g produit de catégorie 1
 DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES

Pseudomonas Validation de la Détection

Détection aeruginosa 1 mL
V mL de bouillon Eugon Staphylococcus aureus
[Link] V mL de bouillon Eugon
Candida albicans Dilution d= 1/10
Dilution d= 1/10
à 102UFC/mL
S (g ou mL) de produit S (g ou mL) de produit Témoin sans produit
1 ml en masse

20 H minimum 20 H minimum
32,5 °C ± 2,5°C 32,5 °C ± 2,5°C
0,1 ml en surface

Gélose Cétrimide (ISO 21 150) 0,1 ml en surface

Gélose Baird parker (ISO 21 718) 20 à 24 H

Gélose Mac Conkey (ISO 21 148) 32,5 °C ± 2,5°C
Gélose SDA (ISO 18 416) Validation si 100 à 500
UFC/mL

48H ± 6H 48 H ± 6H
32,5 °C ± 2,5°C 32,5 °C ± 2,5°C
Validation si présence de colonie caractéristiques
Et absence de colonie sur le témoin
S = 1g produit de catégorie2
Identification S= 5g produit de catégorie 1
 DÉTECTION des GERMES PATHOGÈNES
Souche et norme Ps. aeruginosa St aureus [Link] [Link]
(ISO 21 150) (ISO 21 718) (ISO 21 148) (ISO 18 416)
Milieu Cétrimide Baird parker Mac Conkey SDA

Pigment jaune-vert Colonies noires et Colonie rouge Colonies convexes

Colonies (pyocyanine), brillantes, entourées brique; peut être et crémeuses, de
caractéristiques fluorescent sous d'un halo clair (de 2 entourée d'une zone couleur blanche à
rayonnement UV mm à 5 mm) de bile précipitée. beige

Gram Gram Gram Gram

Test enzymatique Test enzymatique Test enzymatique Test de filamentation
Méthode Isolement sur Test coagulase Isolement sur EMB Test de
d’identification* « Pseudomonas P » (24 à 48 H à 32,5°C) chlamydosporulation
(24 à 48 H à 32,5°C)

Bacille Gram – Coque Gram+ Bacille Gram – Cellules ovoïdes

Oxydase + Catalase + Oxydase – violettes
Colonies entourées Coagulase + Colonies bleu noir à Filaments
Résultat d’une zone bleu- reflet métallique sur Chlamydospore
verte (pyocyanine) EMB Blastospore
ou rouge marron
(pyorubine)
* Minimale : galerie biochimique ou autre méthode validée possible
Souche et norme Ps. aeruginosa
(ISO 21 150)
Cétrimide
Milieu
Pigment jaune-vert
(pyocyanine), fluorescent
Colonies
caractéristiques
sous rayonnement UV

Gram
Test enzymatique
Méthode Isolement sur
d’identification* « Pseudomonas P » (24 à
48 H à 32,5°C)

Bacille Gram –
Oxydase +
Colonies entourées d’une
Résultat zone bleu-verte
(pyocyanine) ou rouge
marron (pyorubine)
64
Souche et norme St aureus
(ISO 21 718)

Milieu Baird parker

Colonies noires et
Colonies brillantes, entourées
caractéristiques d'un halo clair (de 2
mm à 5 mm)

Gram
Test enzymatique
Méthode Test coagulase
d’identification*

Coque Gram+
Catalase +
Coagulase +
Résultat

65
Souche et norme [Link]
(ISO 21 148)
Milieu Mac Conkey

Colonie rouge
Colonies brique; peut être
caractéristiques entourée d'une zone
de bile précipitée.

Gram
Test enzymatique
Méthode Isolement sur EMB
d’identification* (24 à 48 H à 32,5°C)

Bacille Gram –
Oxydase –
Colonies bleu noir à
Résultat reflet métallique sur
EMB

66
Souche et norme [Link]
(ISO 18 416)
Milieu SDA

Colonies convexes
Colonies et crémeuses, de
caractéristiques couleur blanche à
beige

Gram
Test de filamentation
Méthode Test de
d’identification* chlamydosporulation

Cellules ovoïdes
violettes
Filaments
Résultat Chlamydospore
Blastospore

67
 Détection de micro-organismes spécifiés et non
spécifiés
Enrichissement (Eugon)

Isolement (TSA)

Gram

Coque Bacille G- autre Levure

gram +

Non oxydase + oxydase -

Catalase +

Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification Kit d’identification

adapté adapté adapté adapté

Escherichia Non Non

Staphylococcus Non Non Pseudomonas Candida
aureus ? aeruginosa ? coli? albicans?

Présence de Présence de
Présence de Présence de
Escherichia Candida albicans
Staphylococcus Pseudomonas
aureus aeruginosa coli

Présence d’un micro-organisme non spécifié

 D) CHALLENGE TEST :

Un challenge test en microbiologie est une méthode utilisée

pour évaluer la résistance d'un produit ou d'un système
(comme un aliment, un médicament ou un équipement) à la
contamination microbienne. Ce test implique l'inoculation
intentionnelle d'un échantillon avec un ou plusieurs micro-
organismes spécifiques, puis l'observation de la croissance ou
de l'inhibition de ces micro-organismes sur une période
déterminée.

69
Risque microbiologique :
Règlement (CE) n°1223/2009
• Concernant la sensibilité microbiologique, on distingue trois catégories de produits:

1) les produits à faible risque microbiologique (par exemple, les produits dont la
teneur en alcool est > 20 %, les produits à base de solvants organiques, les
produits à pH élevé/faible), pour lesquels il n’est pas nécessaire de soumettre le
produit fini à un challenge test pour la conservation, ni à des contrôles
microbiologiques. Une justification scientifique est toutefois requise;

2) les produits à usage unique et les produits qui ne peuvent être ouverts (par
exemple, dont le conditionnement permet de doser le produit sans que celui-ci
n’entre en contact avec l’air), pour lesquels seuls des contrôles microbiologiques
sur le produit fini sont nécessaires. Une justification scientifique est toutefois
requise;

3) tous les autres produits, pour lesquels un challenge test pour la conservation et
des contrôles microbiologiques sur le produit fini sont nécessaires.
 Challenge test ou test d’efficacité de la conservation antimicrobienne
• Etabli par la pharmacopée européenne ou pharmacopée US pour les médicaments et
les produits cosmétiques;
• NORME ISO 11930 : 2012
• Ce test consiste en la contamination artificielle du produit cosmétique avec différents
micro-organismes en nombre connu et au suivi de l’évolution de ce nombre en
fonction du temps.
• Les souches utilisées sont celles habituellement trouvées dans les produits
cosmétiques et pharmaceutiques au niveau de l’épiderme :
• Candida albicans
• Aspergillus niger
• Escherichia coli
• Staphylococcus aureus
• Pseudomonas aeruginosa
• La population microbienne pour chaque souche est évaluée après 2, 7, 14, 21 et 28
jours.
 CHALLENGE TEST
Pseudomonas aeruginosa 0,2 mL de N
Staphylococcus aureus N0 =N/100
[Link]
Candida albicans T0 20 g de produit
10 3
10 UFC/mL
2
Aspergillus brasiliensis 7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
N 1 ml en masse
10 à 10
7 8

bactéries/mL
106 à 107 Calcul de N
T7
mycètes/mL 1 ml
en masse 48 à
Validation du Gélose TSA ou SDA
Nx 72 H à
neutralisant
32,5 °C
± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant
T14
1 g de Témoin Témoin inoculum
produit
Essai 1 ml
1 ml en masse en masse 48 à
Nx 72 H à
32,5 °C
± 2,5°C

T28
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 ml
en masse 48 à
Nvf Nvn Nv
Nx 72 H à
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C
± 2,5°C
1. Préparation du diluant
• Choix du diluant : Sélectionner un diluant approprié,
souvent un milieu de culture adapté à la croissance des
micro-organismes cibles.
• Stérilisation : Stériliser le diluant par autoclave ou filtration.
• Conditionnement : Préparer des flacons stériles pour
conserver le diluant.

73
 CHALLENGE TEST
Pseudomonas aeruginosa 0,2 mL de N
Staphylococcus aureus N0 =N/100
[Link]
Candida albicans T0 20 g de produit
10 3
10 UFC/mL
2
Aspergillus brasiliensis 7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
N 1 ml en masse
10 à 10
7 8

bactéries/mL
106 à 107 Calcul de N
T7
mycètes/mL 1 ml
en masse 48 à
Validation du Gélose TSA ou SDA
Nx 72 H à
neutralisant
32,5 °C
± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant
T14
1 g de Témoin Témoin inoculum
produit
Essai 1 ml
1 ml en masse en masse 48 à
Nx 72 H à
32,5 °C
± 2,5°C

T28
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 ml
en masse 48 à
Nvf Nvn Nv
Nx 72 H à
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C
± 2,5°C
2- Préparation des souches microbiologiques
• Choix des souches : Sélectionner des souches de micro-
organismes pertinentes (bactéries, levures, moisissures).
• Culture : Cultiver les souches dans un milieu approprié
jusqu'à obtenir une densité cellulaire adéquate (généralement
dans la phase exponentielle de croissance).
• Dénombrement : Effectuer un dénombrement (par exemple,
par comptage sur milieu solide) pour connaître la
concentration cellulaire.

75
3- Inoculation du produit
• Préparation de l'échantillon : Prélever le produit à tester
(médicament) dans des conditions stériles.
• Inoculation : Ajouter un volume mesuré de la suspension
microbienne au produit, en respectant les concentrations
définies par le protocole.
• Homogénéisation : Mélanger doucement pour assurer une
distribution homogène des micro-organismes.

76
 CHALLENGE TEST
Pseudomonas aeruginosa 0,2 mL de N
Staphylococcus aureus N0 =N/100
[Link]
Candida albicans T0 20 g de produit
10 3
10 UFC/mL
2
Aspergillus brasiliensis 7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
N 1 ml en masse
10 à 10
7 8

bactéries/mL
106 à 107 Calcul de N
T7
mycètes/mL 1 ml
en masse 48 à
Validation du Gélose TSA ou SDA
Nx 72 H à
neutralisant
32,5 °C
± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant
T14
1 g de Témoin Témoin inoculum
produit
Essai 1 ml
1 ml en masse en masse 48 à
Nx 72 H à
32,5 °C
± 2,5°C

T28
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 ml
en masse 48 à
Nvf Nvn Nv
Nx 72 H à
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C
± 2,5°C
4- Incubation
• Conditions d'incubation : Placer les échantillons inoculés
dans des conditions contrôlées (température, humidité,
temps).
• Durée : Incuber pendant la période définie (généralement
plusieurs jours).

78
5- Dénombrement des micro-organismes
• Échantillonnage : Prélever des échantillons à intervalles
réguliers pour analyser la croissance microbienne.
• Diluations : Effectuer des dilutions des échantillons prélevés
si nécessaire pour obtenir un nombre de colonies comptable.
• Cultures : Inoculer des milieux de culture appropriés et
incubés.
• Dénombrement : Compter les colonies après incubation pour
évaluer la croissance des micro-organismes.
79
 CHALLENGE TEST
Pseudomonas aeruginosa 0,2 mL de N
Staphylococcus aureus N0 =N/100
[Link]
Candida albicans T0 20 g de produit
10 3
10 UFC/mL
2
Aspergillus brasiliensis 7 jours à 22,5 °C ± 2,5°C
N 1 ml en masse
10 à 10
7 8

bactéries/mL
106 à 107 Calcul de N
T7
mycètes/mL 1 ml
en masse 48 à
Validation du Gélose TSA ou SDA
Nx 72 H à
neutralisant
32,5 °C
± 2,5°C
10ml de diluant neutralisant 10ml de diluant
T14
1 g de Témoin Témoin inoculum
produit
Essai 1 ml
1 ml en masse en masse 48 à
Nx 72 H à
32,5 °C
± 2,5°C

T28
48 à 72 H à 32,5 °C ± 2,5°C 1 ml
en masse 48 à
Nvf Nvn Nv
Nx 72 H à
Validation si Nv  100 , Nvn proche de Nv et Nvf  0,5 Nvn 32,5 °C
± 2,5°C
6- Analyse des résultats
• Interprétation des données : Comparer les dénombrements
à des critères prédéfinis (par exemple, limites acceptables de
contamination).
• Validation : Évaluer si le produit répond aux normes de
sécurité et d'efficacité.
7- Documentation et rapport
• Rédaction du rapport : Documenter toutes les étapes,
résultats et conclusions.
• Validation finale : Soumettre les résultats à des experts pour
validation. 81
TECHNIQUES SPECTROSCOPIQUES D’ANALYSE
La spectroscopie
Ce contrôle a pour but de déterminer en partie la
nature chimique de l’échantillon analyser, de
déterminer son absorption (ou transmittance) en
fonction de sa concentration mais aussi,
déterminer ou prévoir la couleur de l’échantillon.

83
La spectroscopie est l'étude de l'interaction entre la matière et les radiations
électromagnétiques.

Si la matière absorbe de l'énergie, il s'agit de spectroscopie d'absorption.

Ondes radio Utilisées pour la communication, telles que la radio, la télévision et les
télécommunications.
Longueur d'onde: de quelques millimètres à des milliers de kilomètres.

Micro-ondes Utilisées pour les fours à micro-ondes et les télécommunications sans fil.
Longueur d'onde: de 1 millimètre à 1 mètre.
Infra-rouges (IR) Émis par les objets chauds, utilisés en thermographie et en vision nocturne.
Longueur d'onde: de 700 nanomètres à 1 millimètre.
Lumière visible La seule partie du spectre que l'œil humain peut voir, allant du violet au rouge.
Longueur d'onde: de 400 à 700 nanomètres.
Ultraviolets (UV) Rayonnement du soleil qui peut provoquer des coups de soleil, utilisé également
en désinfection.
Longueur d'onde: de 10 à 400 nanomètres.
Rayons X Utilisés en imagerie médicale et en sécurité.
Longueur d'onde: de 0,01 à 10 nanomètres.
Rayons gamma Rayonnement très énergétique, utilisé en médecine nucléaire et en traitement du
cancer.
Longueur d'onde: moins de 0,01 nanomètre.

Chaque partie du spectre a ses propres applications et caractéristiques uniques. 85

 Principaux types de spectroscopie
1. Spectroscopie UV-Visible:
- Mesure l'absorption ou la transmission de la lumière ultraviolette et visible par
une substance.
- Utilisée pour déterminer la concentration de solutés dans des solutions.
2. Spectroscopie infrarouge (IR):
- Analyse l'absorption de la lumière infrarouge, qui provoque des vibrations
moléculaires.
- Utile pour identifier les groupes fonctionnels dans les composés organiques.
3. Spectroscopie de fluorescence:
- Étudie l'émission de lumière par une substance après excitation par une source
lumineuse.
- Employée dans la recherche biomédicale pour tracer des molécules spécifiques.
86
4. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN):
- Utilise les propriétés magnétiques des noyaux atomiques pour déterminer
la structure moléculaire.
- Très utile en chimie organique pour identifier les liaisons chimiques.
5. Spectroscopie de masse:
- Sépare les ions en fonction de leur rapport masse/charge.
- Essentielle pour déterminer les masses moléculaires et les structures des
composés.
6. Spectroscopie de résonance électronique paramagnétique (RPE):
- Étudie les espèces paramagnétiques en utilisant des champs magnétiques.
- Utilisée pour étudier les radicaux libres et les complexes métalliques.

Chacun de ces types de spectroscopie fournit des informations uniques sur la structure et les
propriétés des substances analysées. 87
 A- CARACTERISTIQUES D'UN SPECTRE
D'ABSORPTION

1. Longueur d'onde (λ): L'axe horizontal représente les différentes longueurs

d'onde de la lumière. Chaque composé absorbe la lumière à des longueurs
d'onde spécifiques, créant ainsi des "pics" dans le spectre.
2. Intensité de l'absorption (A): L'axe vertical montre l'absorbance, qui est
une mesure de l'intensité de la lumière absorbée. Les valeurs plus élevées
indiquent une plus grande absorption à cette longueur d'onde.
3. Pics d'absorption: Les pics ou bandes dans le spectre indiquent les
longueurs d'onde spécifiques où la substance absorbe le plus de lumière. La
position et l'intensité des pics peuvent fournir des informations sur la
structure chimique de la substance.
4. Largeur de bande: La largeur des pics peut donner des indications sur l'état
de la substance, comme la pureté ou les interactions avec d'autres molécules.

88
 A- CARACTERISTIQUES D'UN SPECTRE
D'ABSORPTION

Soit un échantillon contenu dans une cellule d'épaisseur l,

les faces de cette cellule sont parallèles, l'échantillon est Flux transmis I
Flux incident I0
caractérisé par une concentration C.

l
LOI DE BEER – LAMBERT :

Absorbance 𝑨=𝒍𝒐𝒈 𝟏𝟎 ( )
𝟏
𝑻
=𝒍𝒐𝒈 𝟏𝟎
𝑰𝟎
𝑰 ( )
=𝜺 . 𝑪 . 𝒍 Longueur du trajet optique (1 cm)

Concentration (mol/L)

Coefficient d'extinction molaire cm-1(L/mol)

Transmittance dépend de plusieurs facteurs :
• Température;
• pH;
• Solvant;
• Nature de Substance;
• Longueur d’onde.

L’absorbance est proportionnel à la concentration et grâce à la loi de

Beer-Lambert on peut retrouver la concentration de la substance
dans la solution.
 B- SPECTROPHOTOMÉTRIE UV/VISIBLE:
(UV-VIS)
L’appareil émet un rayonnement visible qui passe à travers la cuve de la solution à analyser, il
compare ainsi l’intensité avant et après l’échantillon. L’appareille trace ensuite une courbe
d’absorbance ou de transmittance.

 Le rayonnement ultraviolet se situe entre 200

E
nm<<400 nm. La longueur d'onde étant très petite,
 antiliante
l'énergie transportée est très grande (de 300 à 600  antiliante
KJ).
n non liante
 On observe donc une excitation électronique, ce
 liante
qui entraîne le saut d'un électron d'une orbitale  liante
liante ou ou non liante n sur une orbitale antiliante  (nm)
130 160 180 280
(état excité) * ou *.
 ANALYSE PAR SPECTROPHOTOMÉTRIE UV/VISIBLE

Avantages
- Non destructive: Ne nécessite pas de consommation de
l'échantillon.
- Rapide et précis: Donne des résultats en quelques minutes
avec une grande précision.

La spectrophotométrie UV-visible est largement utilisée en

chimie analytique, biochimie, et dans l'industrie pour diverses
applications analytiques
91
 ANALYSE PAR SPECTROPHOTOMÉTRIE UV/VISIBLE

ANALYSE QUALITATIVE ANALYSE QUANTITATIVE

Détermination ou détection du Dosage ou quantification d’une

longueur d’onde d’une espèce espèce chimique
chimique (Loi de Beer-Lambert)

𝜆 𝑚𝑎𝑥 =272 𝑛𝑚

SPECTRE UV DE LA CAFEINE
 C- SPECTROSCOPIE INFRAROUGE :
(IR)
La spectrométrie infrarouge est l’un des outils les plus utilisés pour la caractérisation et l’identification
des molécules organiques et minérales.
La spectrométrie IR est une méthode de caractérisation rapide et sensible de la plupart des molécules
existantes. Son utilisation est simple et le coût de son instrumentation en fait un outil accessible à la
plupart des laboratoires.
 La spectroscopie IR appliquée à la
chimie organique s'étend entre :
2,5 mm < l < 25 mm.
 Pour des raisons pratiques, on
caractérise habituellement les
radiations IR par leurs fréquences
en nombres d'ondes :
cm-1 = 1/ cm= 104/ mm
 Donc le domaine IR s'étend entre
4000 cm-1 et 400 cm-1 :
104/2,5 = 4000cm-1 et 104/15 = 400
cm-1
Le rayonnement infrarouge dispense suffisamment d’énergie pour stimuler les vibrations moléculaires
à des niveaux d’énergie supérieurs.

La spectrométrie infrarouge s'utilise principalement pour l'analyse qualitative d'une molécule en

mettant en évidence la présence de liaisons entre les atomes (fonctions et groupements).
PRINCIPE :
La spectrométrie infrarouge est la mesure de la diminution de l'intensité du rayonnement qui traverse un échantillon
en fonction de la longueur d'onde. Le rayonnement infrarouge dispense suffisamment d'énergie pour stimuler les
vibrations moléculaires à des niveaux d'énergie supérieurs.

Elongation
MODES VIBRATIONNELS :
Variation de l’angle
entre deux liens
adjacents
Déformation angulaire
Variation de la
distance
interatomique

Symétrique

Rocking Wagging

Elongations ou Stretching Déformations angulaire dans le Déformations angulaire hors

plan du plan

Asymétrique

Scissoring Torsion
 EFFET DE LA FORCE DE LIAISON EFFET DE LA FORCE DE LIAISON

Force de liaison croissante Force de liaison croissante

sp sp2 sp3
C C C C C C C H C H C H
2150 1650 1200 cm -1
3300 3100 2900 cm-1
Fréquence croissante Fréquence croissante

EFFET DE LA MASSE DES ATOMES

Masse atomique croissante

C H C C C O C Cl C Br
3000 1200 1100 800 550 cm-1

Fréquence croissante
 ANALYSE PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE :

 Une molécule soumise au rayonnement IR absorbe certaines radiations et on obtient

alors des bandes d'absorption. En spectroscopie d'absorption, on applique la Loi de
Beer-Lambert.
 Dans un spectre IR on présente la transmittance graduée de 0% à 100% en fonction du
nombre d’onde (l’inverse de longueur d'onde). Une faible transmission est un minimum
sur la courbe, une forte transmission est un maximum sur la courbe.
 ANALYSE PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE :

L’analyse d’un spectre IR se fait en

4 étapes.
D’abord, il s’agit de repérer les
liaisons chimiques (C-H, N-H,
C=O etc.) grâce à leurs nombres
d'onde (voir tableau ).
Attention : à une liaison peuvent
correspondre plusieurs bandes
d'absorption car la liaison peut
vibrer de différentes façons
(symétrique, cisaillement etc.).
Puis, il faut rechercher les groupes
caractéristiques (hydroxyle -OH,
carboxyle -COOH
97
Niveaux énergétiques
moléculaires des différents
domaines spectraux (d’après
Humbert et al., Techniques de
l’Ingénieur P 2850).

98
• Cas de la liaison O-H : une liaison hydrogène se forme
lorsqu’un atome d’hydrogène, lié à un atome A très
électronégatif, interagit avec un atome B, également très
électronégatif et porteur d’un doublet non liant (O, N, Cl,
F).

99
• Cas des bandes C-O et N-H :
la liaison C-O est présente dans les acides carboxyliques, alcools etc. La
position de la bande d'absorption dépend du type de fonction (voir
tableau ). Sa bande se situe entre 1050 et 1450 cm-1.

La liaison N-H est présente dans les amines et amides etc. Sa bande se
situe entre 3100 et 3500 cm-1.
À noter, le spectre IR d'une amine RNH2 donne 2 bandes alors que celui
d'une amine RNR'H ne donne qu'une bande (1 seule liaison N-H).

100
101
• Cas des bandes C=C et C=O :
la liaison C=C se retrouve dans les alcènes et également dans les
composés aromatiques comme le benzène où elle est moins forte car
délocalisée (comprise entre 1450 et 1600 cm-1).
La liaison C=O est présente dans les aldéhydes, cétones, esters, amides
etc.

102
 (a) Spectre infrarouge du méthanal.
(b) Les trois modes de vibration d’une molécule à 3 atomes. 103
 L'analyse qualitative des spectres permet de distinguer les régions dans laquelle
vibrent ou absorbent les principaux groupements fonctionnels d'une molécule, ces
régions sont rassemblés sous forme de tables et permettent d'attribuer les fréquences de
vibration aux groupements fonctionnels. Les régions peuvent être schématisées de la
manière suivante :

(C=C) = 1650 Cm-1 1650 Cm-1 1650 Cm-1 1650 Cm-1 1650 Cm-1

1651 Cm-1 1657 Cm-1 1678 Cm-1 1780 Cm-1

 Bande large
Spectre Infrarouge de
cocaïne :

Bande large
Pic
Plusieurs pics

1728 et 1712 cm-1 : vibration d'étirement des

deux groupes carbonyle.

1230 et 1105 cm-1 : attribuée à l'étirement

acétate C-O).

1071, 1026 et 729 cm-1 : attribuée à

l'étirement de benzène monosubstitué.

1290 cm-1 : attribuée à l'étirement C-N de

l’amine tertiaire
 D- LA SPECTROSCOPIE D'ABSORPTION ET D’ÉMISSION
ATOMIQUE :(SAA & SEA)

La spectroscopie d’absorption ou d’émission est probablement la plus

ancienne méthode analytique utilisée dans le monde. Elle inclut deux méthodes
d’analyse quantitative qui peuvent être utilisées pour mesurer les
concentrations d’environ 70 éléments (métaux, métalloïdes et non-métaux).

Ex: Fer (Fe), cuivre Ex: Silicium (Si), Ex: Oxygène

(Cu) arsenic (As) (O), soufre (S)
 PRINCIPE :
La technique se base sur l’absorption (ou émission) de la radiation monochromatique par un
nuage d’atomes. Les atomes dans l'état fondamental absorbent l’énergie dans une certaine
longueur d'onde produite par une source composée par les mêmes atomes à être analysé à partir
d'une source (lampe avec cathode creuse). Cette source produit une radiation électromagnétique
intense avec une longueur d’onde similaire à celle absorbée par les atomes. La sensibilité de
cette technique est proportionnelle au nombre d'atomes à l'état fondamental.

Technique Excitation Détection

Photométrie par flamme Flamme chimique UV-Vis radiation émise
Spectrométrie par Absorption atomique
Absorption de radiation EM Radiation EM absorbée
(AAS)
Spectroscopie Arc/spark Décharge électrique UV-Vis radiation émise
Spectrométrie d’émission de Plasma Plasma Gazeux UV-Vis radiation émise
Plasma – Spectrométrie de masse Plasma Gazeux Ions
Spectrométrie de fluorescence de rayons X
Irradiation par rayons X Rayons X Fluorescents
107
Spectrométrie
 Nébuliseur

Détecteur
Lampe à Monochromateur
cathode creuse Brûleur

1. Lampe
Fonction : La lampe est la source de lumière qui émet la longueur
d'onde spécifique correspondant à l'élément à analyser.
Types de lampes :
Lampe à cathode creuse : Contient le métal à analyser et émet la lumière de
manière spécifique à cet élément.
Lampes à décharge : Utilisées pour des éléments spécifiques.

108
 Nébuliseur

Détecteur
Lampe à Monochromateur
cathode creuse Brûleur

2. Flamme
Fonction : La flamme est utilisée pour atomiser l'échantillon. Lorsque
la solution contenant le métal est introduite dans la flamme, l'eau
s'évapore, et le soluté se décompose, libérant les atomes métalliques.
Types de flammes :
Flamme de gaz propane/air : Utilisée pour de nombreux éléments.
Flamme d'acétylène/air : Plus chaude, utilisée pour les éléments nécessitant
une plus grande température d'atomisation.

109
 Nébuliseur

Détecteur
Lampe à Monochromateur
cathode creuse Brûleur

3. Monochromateur
Fonction : Le monochromateur sélectionne une longueur d'onde
spécifique de la lumière émise par la lampe. Chaque élément métallique
a une longueur d'onde d'absorption caractéristique.
Importance : Cela permet de mesurer uniquement la lumière absorbée
par l'élément d'intérêt, améliorant ainsi la précision et la spécificité de
l'analyse.

110
 Nébuliseur

Détecteur
Lampe à Monochromateur
cathode creuse Brûleur

Spectroscopie d'absorption atomique

 ANALYSE PAR SPECTROSCOPIE ABSORPTION ATOMIQUE :

Méthode de l’étalonnage Méthode des ajouts doses

Principe général de l’étalonnage : création de Cette méthode est utilisée lorsque les effets de
la courbe d’étalonnage à partir de la gamme matrice sont importants et dans les cas où la
étalon et détermination de la concentration substance d’intérêt peut difficilement être
d’un échantillon à l’aide de cette courbe extraite de la matrice. Dans ce cas, la matrice va
être analysée seule puis avec des
supplémentations -ou ajouts- connues en
substance à doser.
On prépare ainsi un certain nombre de solutions de concentrations connues: C0,C1,C2,Cn
et la solution de concentration inconnue Cx​.
On mesure ensuite les absorbances A0,A1,A2,A3,An et on détermine la concentration Cx​à
partir de l’absorbance Ax​de l’échantillon.

On recherche la fonction : y = ax + b.
Avec y : Absorbance, x: la concentration de l’élément métallique

113
On mesure ensuite l’absorbance des solutions obtenues. En traçant la courbe
Absorbance= f(concentration), on obtient une droite dont l’intersection avec l’axe des
abscisses donne la concentration de l’analyte dans la solution sans ajout.

Actuellement, les appareils modernes équipés d’un distributeur d’échantillons peuvent

effectuer ces opérations de façon entièrement automatique.

114
TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES D’ANALYSE
 CHROMATOGRAPHIE :
Méthode d’analyse physico-chimique qui permet :
- la séparation des différents constituants d’un mélange;
- leur identification;
- leur quantification.
Principe de base :
Chaque composé subit une succession d’équilibres dynamiques de concentration entre deux phases non
miscibles :
- une phase stationnaire fixe (Φstat ; solide ou liquide) ;
- une phase mobile (ΦMob ; liquide ou gaz) qui entraîne les constituants au travers de la phase stationnaire fixe
(Φstat).
 Répartition des molécules (échantillon à analyser) entre les deux phases :

Échantillon
(3 molécules) Phase stationnaire (Φstat)

Phase mobile (Φmob) t=0s

t>

t >>

Soluté le plus retenu Soluté le moins retenu

Injecteur Détecteur

Sens du débit de la phase mobile

Séparation : La chromatographie repose sur la séparation des
composants d'un mélange en fonction de leurs interactions avec deux
phases :
•Phase mobile : C'est le solvant ou le mélange de solvants qui transporte
le mélange à travers la colonne.
•Phase stationnaire : C'est le matériau qui reste fixe dans la colonne et
avec lequel les composants du mélange interagissent.

Migration : Les différents composants se déplacent à des vitesses

différentes, en fonction de leur affinité pour la phase stationnaire et de
leur solubilité dans la phase mobile. Cela permet de les séparer.

118
 Adsorption

Echange
d’ions

Selon le principe de base Partition

Exclusion
Classification

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Chromatographie sur papier (CP)

Chromatographie sur colonne (CC)

Selon la technique instrumentale
Chromatographie liquide à haute
performance

Chromatographie gazeuse (GC)

…
 Types de chromatographie
•Chromatographie sur colonne :
Utilise une colonne remplie de phase stationnaire. Les échantillons sont introduits
dans la colonne et séparés au fur et à mesure qu'ils migrent.
•Chromatographie liquide à haute performance (HPLC) :
Une forme de chromatographie en phase liquide qui utilise des pressions élevées pour
faire passer le solvant à travers la colonne.
•Chromatographie gazeuse (GC) :
Utilise une phase gazeuse pour séparer les composants volatils d'un mélange. C'est
souvent utilisé pour les analyses de composés organiques.
•Chromatographie en couche mince (TLC) :
Utilise une plaque plate recouverte d'une phase stationnaire pour séparer les
composants d'un mélange. Les résultats sont souvent visualisés par révélation.

120
 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE
MINCE
(CCM)

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une technique de

séparation et d'analyse des mélanges homogènes. Elle utilise le principe de
la migration par capillarité d'une espèce sur un support (une plaque couche
mince) grâce à sa solubilité dans le solvant choisi.

Méthode : Lorsque la plaque CCM sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans
la cuve, l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par
capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa
propre vitesse derrière le front du solvant.
 Distance parcourue par le composé
Rf =
Plaque CCM Distance parcourue par le front du solvant

Ligne de
dépôt
Solvant

Dépôt de Identification :
l’échantillo - Direct (couleur);
- Révélation : UV ou produit chimique 122
n
 CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
:
(HPLC)

La chromatographie en phase liquide

à haute performance (CLHP) et on
trouve plus fréquemment l'abréviation
anglaise HPLC (high performance
liquid chromatography) : est une
technique de séparation analytique
et/ou préparatrice de molécules
présentes dans un mélange. Cela
permet d'adapter les méthodes
chromatographiques usuelles sur un
montage haute pression. Chromatographie en phase normale : la phase stationnaire
est polaire tandis que la phase mobile est apolaire (ou
très faiblement polaire)
Chromatographie en phase inverse : la phase mobile est
polaire tandis que la phase stationnaire est apolaire
 Détecteurs :
UV-VIS, Réfractomètre, potentiomètre, …
Enregistre
ur

Colonne

Colonne chromatographique : Tube en acier

contenant la phase stationnaire solide.
particules solides de silice - sphériques et calibrées
Waste en taille - surface spécifique d’échange élevée -
activées ou désactivées en surface (non polaire ou
Solvant Pompe Détecteu polaire)
r

Phase mobile : solvant pur ou mélange de

solvants
- Mode isocratique : composition
constante de la phase mobile
- Mode à gradient d’élution : composition
variable mais contrôlée de la phase
mobile avec le temps
124
  tM : temps de rétention d’une substance non retenue sur
la colonne
 tR : temps rétention
 t’R : temps rétention réduit d’où : 𝒕 ′ 𝑹 =𝒕 𝑹 −𝒕 𝑴
𝒕 ′ 𝑹 𝒕 𝑹 −𝒕 𝑴
 Facteur de capacité k 𝒌=
: =
𝒕𝑴 𝒕𝑴

( ) ( )
𝟐 𝟐
𝒕𝑹 𝒕𝑹
𝑵 =𝟏𝟔 . =𝟓 ,𝟓𝟒𝟓 .
𝝎 𝜹
 Nombre de plateaux théoriques :
𝑳
𝑯=
𝑵
 hauteur de plateaux théoriques :

Méthode avec introduction d'un poids

Méthode
d'étalonnag
e interne
Méthode d'étalonnage interne avec
Méthodes de courbe d'étalonnage
dosage

Méthode
d'étalonnag
e externe