Chromatographie en Phase Gazeuse
CPG
Enseignant : S. AMRANI
Chromatographie en Phase Gazeuse
Principe (CPG)
Méthode de séparation de
composés gazeux ou susceptibles
Phase mobile
Phase stationnaire
d’être vaporisés sans
décomposition
A ÉCHANGE de molécule GAZEUSE
entre phase stationnaire et phase
mobile
B Phase stationnaire liquide ou
solide
Phase mobile GAZEUSE
Appareil de chromatographie en phase gazeuse
Chromatography
Gas Chromatography
• GC = ‘good chromatography’
Separation according to difference in volatility &
structure
- For compounds with sufficient volatility
- thermostable 4
Chromatographie en Phase Gazeuse
(CPG)
Appareillage
Chromatography
Gas Chromatography
• Mostly used for untargeted metabolomics
• optimized over several decades
• High reproducibility
• Easy to use
• Good software
• ‘standardized’ GC method with very good databases for compounds
identification
• Very universal for compounds <600 Da
• Great coverage for polar compounds (for same coverage, 3+ LC-MS
methods are needed)
• Only tool for volatiles
Limitations:
- high temperatures can destroy labile compounds
- polar compounds cannot ‘fly’ on GC columns and must first be
derivatized
- difficult to collect fractions
- heat may cause degradation 7
Chromatographie en Phase Gazeuse
Phase mobile(CPG)
ou gaz vecteur
Nature : Gaz inerte
Hélium
Diazote
Argon
Dihydrogène…
Propriété : inerte vis-à-vis des solutés et des phases stationnaires
Choix du gaz vecteur
Détecteur utilisé
Coût de fonctionnement…
Il n’y a pas d’interaction entre le gaz et la phase stationnaire
Il n’y a pas d’interaction entre le gaz et les solutés
Facteurs qui influencent l’ordre de sortie
des molécules sur le chromatogramme
Les différentes molécules du mélange vont se séparer et
sortir de la colonne les unes après les autres en fonction
de :
la tendance qu’a le composé chimique à passer à l’état
vapeur (sa volatilité (P.É.))
les conditions expérimentales (nature de la
colonne (polaire ou non polaire), longueur et diamètre de
la colonne, température de la colonne, type et débit de
gaz).
l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules
(polarité)
Principe de séparation des produits
Influence de la Téb (facteur principal dans le cas d’une colonne non-
polaire)
Selon le point d’ébullition des composés : si Teb TR
La polarité des composés et des phases (mobile et stationnaire) doit
aussi être analysée.
1. Phase stationnaire polaire
Les substances polaires sont retenues par la phase
stationnaire elles sortent donc en dernier (grands temps
de rétention
2. Phase stationnaire non polaire (autre appellation : phase
inverse, C18, etc.)
Les substances polaires sont peu retenues par la phase
stationnaire (car peu solubles) elles apparaissent avant
les substances peu polaires
Chromatographie en Phase Gazeuse
(CPG)
Phase mobile ou gaz
vecteur
La nature et la vitesse linéaire d’une phase mobile donnée, contribuent
à la qualité de la séparation
Chromatographie en Phase Gazeuse
(CPG)
La température T
La température T est un paramètre majeur en GPG
Le volume de rétention VR varie selon la loi :
Log(VR) = (a/T) + b
Si T augmente : le volume de rétention diminue et
donc le temps de rétention diminue
Chromatographie en Phase Gazeuse
(CPG)
La température T
Représentation de l’équation pour une série de composés homologues
Log(VR) = (a/T) + b
Plus la température est forte, plus la séparation est rapide
A très forte température, il n’y a plus de séparation
Chromatographie en Phase Gazeuse
(CPG)
La température T
Représentation de l’équation pour une série de composés différents
A T1, on ne sépare pas les composés 1 et 3
A T3, on ne sépare pas les composés 1 et 2
A T2, on sépare des composés 1, 2 et 3
Phase stationnaire:
Composé non Polarité
polaire
Composé polaire
Phase stationnaire :
Polarité
Phase stationnaire:
Exemple Polarité
Choix du
diamètre
Gain en temps d’analyse
Perte en efficacité (N) et en résolution (R)
Gain en capacité d’échantillon
Choix du diamètre
Influence de la
Pluslongueur
Plus la colonne est longue:
la résolution est améliorée
Mais plus le temps d’analyse augmente
Plus le cout de la colonne est important
Exemple
Avec une colonne de 60 m, on gagne 40% en résolution par rapport
à une colonne de 30 m
Avec une colonne de 60 m, on double le temps d’analyse par
rapport à une colonne de 30 m
La résolution augmente proportionnellement à la
racine carrée de la longueur de la colonne
Influence de la
longueur
Influence de la
longueur
Influence de l’épaisseur du film de phase
stationnaire
Les effets de l’épaisseur du film de phase et du diamètre
interne de la colonne sont interdépendants
Utilisation du rapport β pour sélectionner les colonnes :
Plus la valeur de β est faible, plus la capacité et la rétention
du composé sont élevées
Application en fonction de β :
Pour β < 100 - composés très volatils, masses faibles
Pour β entre 100 et 400 - travaux courants, intervalles
importants
Influence de l’épaisseur du
film
Préparation de
l’échantillon
Dérivation:
But:
Rendre les constituants d’un mélange moins polaires et
plus volatils en les dérivant chimiquement
Les réactions les plus courantes:
Silylation
Alkylation
Acylation
Réactions de dérivation des lipides
Alkylation; Silylation
En masquant les fonctions polaires, elles
permettent d'augmenter:
• la volatilité
• la stabilité
• la détectabilité
Préparation de
l’échantillon
Dérivation:
Silylation
Sur fonctions alcool, phénol, amine. Substitution d’un groupe
triméthylsilyle (TMS) à un atome d’hydrogène mobile
Acylation
On remplace un hydrogène mobile par un groupement acyle (obtention
d’un ester)
Alkylation
Remplacement d’un hydrogène mobile par un radical alkyle, en
générale un méthyle
Alkylation: réduit la polarité
des lipides en remplaçant
les H actifs par des
groupements alkyles
O
R C KOH O
OH
+ CH 3 OH R C
BF3 O CH
3
Acide gras
Ester méthylique
Silylation: réduit la polarité
des lipides en remplaçant les
H actifs par des groupements
triméthylsilyl ou tert-butyl-
diméthyl-silyl (t-BDMS)
O
O t-BDM CS CH CH 3
R C 3
R C + M TBSTFA
OH O Si C CH 3
1H, 60°C
CH 3 CH 3
Acide gras
Dérivé t-BDM S
